subtipificación de Campylobacter jejuni Ssp. doylei El uso de aislamientos PhyloProteomics basados ​​en espectrometría de masas (MSPP)

El objetivo general de este procedimiento de espectrometría de masas, llamado MSPP o FiloProteómica basada en espectrometría de masas, es subtipificar las bacterias a nivel de cepa. Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en los campos de la Microbiología, la Epidemiología y la Higiene. Por ejemplo, se puede utilizar para analizar situaciones de brotes mediante la visualización de la relación filoprómica.

En comparación con otros métodos de tipificación, MSPP es barato por muestra y muy rápido. Las infecciones nosocomiales son un tema de creciente importancia, y esperamos que nuestro esquema de MSPP pueda extenderse hacia la tipificación epidemiológica de otras bacterias, o incluso hongos. Nuestro esquema MSPP proporciona información sobre la relación de las cepas, por lo que para la predicción de fenotipos relevantes, como la resistencia a los medicamentos o incluso la virulencia, tiene sentido aplicarlo cuando estos fenotipos se correlacionan con genotipos específicos.

Para comenzar este procedimiento, prepare dos tubos de solución de matriz disolviendo 2,5 miligramos de HCCA en 250 microlitros de una mezcla de solvente orgánico, un 50% de isonitrilo. Agregue insulina humana recombinante como calibrador interno a uno de ellos, luego 47,5% de agua destilada doble y 2,5% de ácido trifluoroacético. A continuación, esparce una cantidad del tamaño de una colonia del tamaño de la cabeza de un alfiler de la cepa de referencia, directamente sobre una placa objetivo de maldi.

Para determinar la masa exacta del pico de calibración, colóquelo en el microlitro del patrón de prueba en otro punto. Superponga cada mancha de bacterias y estándar con 1 microlitro de solución de matriz enriquecida con HCCA y déjelas cristalizar a temperatura ambiente. Para cada cepa a analizar, repita la preparación del frotis.

Superponga cada punto con 1 microlitro de solución de matriz de HCCA enriquecida y deje cristalizar a temperatura ambiente. Alternativamente, las proteínas se pueden extraer de células difíciles de mentir. Para ello, se cosechan aproximadamente 5 colonias de un cultivo en placa de agar con un circuito de inoculación.

Suspenderlos en 300 microlitros de agua bidestilada en un tubo de reacción de 1,5 mililitros y mezclarlos bien pipeteando repetidamente hasta que las colonias bacterianas estén completamente suspendidas. Luego agregue 900 microlitros de etanol absoluto y mezcle. Centrifugar la muestra a 13.000 g durante 1 minuto.

Después de secar el pellet, vuelva a suspenderlo pipeteando hacia arriba y hacia abajo en 50 microlitros de ácido fórmico al 70%. A continuación, añadimos 50 microlitros de aceto-nitrilo y mezclamos. Retire los residuos por centrifugación a 13.000 g durante 2 minutos.

Cuando termine, transfiera 1 microlitro del supernombrado a una posición de muestra en una placa de objetivo maldi. Después de dejar que la muestra se seque, superponga cada punto con un microlitro de solución de matriz de HCCA y deje cristalizar a temperatura ambiente. En este punto, realice el análisis MALDI-TOF recopilando 600 espectros en 100 pasos de disparo para cada punto.

Primero, haga clic en la pestaña de ejecución automática en el software de configuración del espectrómetro de masas. Abra el método haciendo clic con el botón izquierdo en el botón del método y eligiendo el método en el menú desplegable. A continuación, haga clic con el botón izquierdo en el botón de edición para abrir el editor de métodos de ejecución automática.

En la pestaña Acumulación, establezca el valor de disparo satisfactorio en 100 y el valor de suma en 600. Para cada espectro, elija el pico del calibrador de la lista, haga clic en asignar automáticamente'y presione OK'Después de obtener espectros de masas de cada punto, determine experimentalmente la masa exacta del pico de calibración, abriendo un espectro con el navegador de espectro y encontrando el pico en la masa esperada en comparación con un espectro sin calibrante. Compruebe que el pico calibrador no esté oscurecido por ningún otro biomarcador del organismo de interés.

A partir de los datos de secuenciación del genoma de la cepa de referencia, se calcula el peso molecular monoisotópico teórico de cada una de las proteínas codificadas traduciendo la secuencia de ADN a la secuencia de aminoácidos correspondiente. Cargue el archivo o copie y pegue esta secuencia de proteínas en el cuadro de entrada del panel de recursos bioinformáticos correspondiente y calcule el punto isoeléctrico teórico y el peso molecular. Copie los resultados en una hoja de cálculo con una columna que contenga el identificador del gen y otra columna el peso molecular.

Ordene las filas por peso molecular calculado, para facilitar la búsqueda de masas. Inserte una columna adicional en la hoja de cálculo para el peso molecular de la forma dematonominada, restando 135 dautons del peso molecular monoisotópico. Asigne cada masa de biomarcador medido principal a las masas calculadas de la cepa de referencia, consultando la masa medida de la tabla del genoma.

En otra hoja de cálculo, registre la masa y el identificador de cada ion biomarcador. Ahora calibre los espectros de masas obtenidos de los aislados de la colección como se hizo para la cepa de referencia. Para un aislado por fila, identifique los biomarcadores variantes en los espectros de masas, registre la masa medida para cada biomarcador y la isoforma predicha en las columnas respectivas.

El espectro de masas MALDI-TOF de la subespecie C-Jejuni doylei ATCC 49349 contiene 14 iones biomarcadores singularmente cargados que podrían identificarse mediante la comparación de las masas moleculares calculadas con el espectro de referencia. Dentro de la colección, se detectaron diferentes formas iso para L32 sin metionina, L33 y la proteína hipotética codificada por gil152939117, S20 M y S15 M. Las masas restantes asignadas a los iones biomarcadores fueron invariables en los aislados probados. La sustitución de aminoácidos correspondiente al desplazamiento de masa se ha identificado mediante amplificación por PCR y secuenciación del gen en particular utilizando los cebadores enumerados aquí.

Aquí se indican las secuencias de aminoácidos de todos los iones biomarcadores incluidos en el esquema MSPP, así como las isoformas alélicas detectadas. El dendrograma UPGMA basado en MLST construido a partir de los aislados de doylei de la subespecie C jejuni examinados, muestra que cada aislado pertenece a un tipo de secuencia MLST diferente. Y la cepa LMG7790 tiene la distancia filogenética más larga.

Como se observó con la alaysis MLST, el aislado LMG7790 tiene la distancia filocurómica más larga en el análisis MSPP de los aislados de doylei de la subespecie C. jejuni examinados. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día si se realiza correctamente. Al seguir este procedimiento, es importante recordar la toxicidad de algunas sustancias utilizadas durante el experimento.

Por ejemplo, el aceto-nitrilo puede causar irritación de la piel. Además del MSPP, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación del ADN, para analizar otros parámetros, como la presencia de genes de resistencia. El desarrollo de esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploren la fotogenia.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo funciona MSPP y cómo se puede aplicar a preguntas específicas. No olvide que trabajar con patógenos violentos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el equipo de laboratorio S2.