Name: subtipificación de Campylobacter jejuni Ssp. doylei El uso de aislamientos PhyloProteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende la subtipificación de Campylobacter jejuni ssp. doylei mediante espectrometría de masas basada en filoproteómica (MSPP). Este método rápido y económico permite analizar brotes bacterianos y predecir fenotipos como resistencia a fármacos.

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Estamos agradecidos a Hannah Kleinschmidt por su excelente soporte técnico. Este artículo fue financiado por el programa de apoyo al Acceso Abierto de la Deutsche Forschungsgemeinschaft y el fondo de publicaciones de la Georg August Universität Göttingen.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más crítico en el establecimiento de un régimen de MSPP es la determinación genética inequívoca de las identidades de iones de biomarcadores. Si no es posible identificar un biomarcador, sin duda, entonces debe ser excluido del régimen 13. El C. ssp. doylei esquema jejuni incluye 14 diferentes iones de biomarcadores. Estos son 5 menos en comparación con la C. jejuni ssp. esquema de jejuni MSPP 13 .La diferencia más si...

Durante la última década, láser asistida por matriz de desorción ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) ha avanzado a ser un método estándar de gran valor para el género microbiano y la identificación de las especies en microbiología clínica 1, 2. La identificación de especies se basa en el registro de huellas digitales pequeñas proteínas de las células intactas o lisados ​​celulares. El rango de masa típica de un espectrómetro de masas utilizado en microbiología clínica habitual es de 2-20 kDa. Además, el espectro resultante se puede utilizar para discriminar las cepas en las siguientes especies y de nivel 3 por debajo de la subespecie. Los primeros estudios pioneros han identificado iones de biomarcadores específicos para un subgrupo particular de las cepas de Campylobacter jejuni en 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, y EScherichia coli 10 - 12. La combinación de varias masas de biomarcadores variables correspondientes a las isoformas alélicas ofrece la opción para los subtipos más profundo. Anteriormente, hemos implementado con éxito un método para convertir estas variaciones en los perfiles de masas en relaciones significativas y reproducibles phyloproteomic llamados phyloproteomics basados espectrometría de masas (MSPP) en un C. ssp jejuni. colección aislado jejuni 13. MSPP se puede utilizar una de espectrometría de masa equivalente a las técnicas de subtipificación basada en la secuencia de ADN como la secuencia de mecanografía multilocus (MLST). Especies de Campylobacter son la principal causa de gastroenteritis bacteriana en todo el mundo 14, 15. Como consecuencia de la campilobacteriosis sequela post-infecciosa, a saber, el Síndrome de Guillain Barré, artritis reactiva y enfermedad inflamatoria intestinal puede surgir 16. Las principales fuentes de infección sonla carne de ganado contaminado de pollo, pavo, cerdos, vacas, ovejas y patos, la leche y la superficie del agua 15, 17. Por lo tanto, los estudios de vigilancia epidemiológica regulares en el contexto de la seguridad alimentaria son necesarias. MLST es el &quot;patrón oro&quot; en la tipificación molecular de especies de Campylobacter 18. Debido a que el método de Sanger de secuenciación basada MLST es un trabajo intensivo, que consume tiempo y es relativamente caro, MLST datos está restringido a cohortes relativamente pequeñas aisladas. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos de subtipificación más baratos y más rápidos. Esta necesidad podría satisfacerse mediante métodos de espectrometría de masas como MSPP. En este trabajo se presenta un protocolo detallado para MSPP tipificación usando una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos y la comparación de su potencial con MLST.

<table><tbody><tr><td>acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Autoflex III TOF/TOF 200</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>GT02554 G201</td><td>Espectrómetro de masas</td></tr><tr><td>patrón de prueba bacteriana BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td></td><td>263564 Paquete de software</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>8290190</td><td>5 tubos</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislar&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; cepa 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinación de la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Gante, Bélgica</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinación de la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Gante, Bélgica</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Columbia agar base&nbsp;</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.10455 .0500</td> Brújula de <td>500 g</td></tr><tr><td>para FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>251419 Paquete</td><td>de</td> software</tr><tr><td>sangre de oveja desfibrinada&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Alemania</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>02854 Ácido</td> fórmico Fluka <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matriz HCCA</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes papel tisú</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>259935</td><td>Paquete de software Mástil</td></tr><tr><td>Viales Cryobank</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Alemania</td><td>Objetivo de acero pulido CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>insulina humana recombinante</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td> Ácido trifluoroacético <td>I2643</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>agua, de grado de biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

subtipificación de<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; el uso de aislamientos phyloproteomics basados ​​en espectrometría de masas (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS ofrece la posibilidad de diferenciar algunas bacterias no sólo a nivel de especies y subespecies, sino incluso por debajo, a nivel de cepa. isoformas alélicas de los iones detectables de biomarcadores resultan en desplazamientos en masa aislante específica. phyloproteomics de masas basado en la espectrometría (MSPP) es una nueva técnica que combina las masas de espectrometría de masas de biomarcadores detectables en un esquema que permite la deducción de las relaciones phyloproteomic de los cambios de masa específica del aislante en comparación con un genoma secuenciado cepa de referencia. Las secuencias de aminoácidos deducidas se utilizan entonces para calcular dendrogramas basados ​​en MSPP. A continuación se describe el flujo de trabajo del MSPP escribiendo un ssp Campylobacter jejuni. Doylei colección aislado de siete cepas. Todos los siete cepas eran de origen humano y la secuencia de multilocus (MLST) demostrado su diversidad genética. MSPP tipificación resultó en siete diferentes tipos de secuencias del MSPP, lo que refleja suficientemente su grafíalas relaciones logenetic. El C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP incluye 14 diferentes iones de biomarcadores, proteínas ribosomales en su mayoría en el rango de masa de 2 a 11 kDa. MSPP puede, en principio, ser adaptado a otras plataformas de espectrometría de masa con un rango de masa extendida. Por lo tanto, esta técnica tiene el potencial de convertirse en una herramienta útil para la tipificación microbiana nivel de cepa.

Anteriormente, hemos establecido con éxito un esquema de MSPP para C. ssp jejuni. jejuni 13. En este caso, el objetivo fue extender el método a la hermana subespecie C. ssp jejuni. doylei. En esta configuración específica, siete C. jejuni ssp. doylei los aislados fueron adquiridos de la colección belga de microorganismos / Laboratorio de Microbiología UGent BCCM / LMG Gante, Bélgica. Todos los siete aislam...

Se utilizó phyloproteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) para escribir una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos a nivel de cepa en comparación con la tipificación de secuencia de multilocus (MLST).

subtipificación de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; El uso de aislamientos PhyloProteomics basados ​​en espectrometría de masas (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

El objetivo general de este procedimiento de espectrometría de masas, denominado MSPP o Filoproteómica basada en Espectrometría de Masas, es subtipificar bacterias a nivel de cepa. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en los campos de la Microbiología, Epidemiología e Higiene. Por ejemplo, puede emplearse para analizar situaciones de brote mediante la visualización de la relación filoproteómica.En comparación con otros métodos de tipificación, el MSPP es económico por muestra y muy rápido. Las infecciones nosocomiales son un problema de importancia creciente, y esperamos que nuestro esquema de MSPP pueda extenderse hacia la tipificación epidemiológica de otras bacterias, o incluso de hongos. Nuestro esquema de MSPP proporciona información sobre la relación entre cepas, por lo que tiene sentido aplicarlo cuando se desean predecir fenotipos relevantes, como la resistencia a fármacos o incluso la virulencia, siempre que estos fenotipos se correlacionen con genotipos específicos.Para comenzar este procedimiento, prepare dos tubos de solución de matriz disolviendo 2,5 miligramos de HCCA en 250 microlitros de una mezcla de disolvente orgánico, un 50%isonitrilo. Aña

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Investigación

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Genetics

Genética

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Aunque el cultivo de heces para Campylobacter es impreciso, todavía se considera el estándar de oro para la identificación. Se describen métodos para determinar el límite de detección y supervivencia en los medios de transporte de C. jejuni en heces humanas y se comparan con un nuevo inmunoensayo con mejor precisión.

Métodos de cultivo para determinar el límite de detección y supervivencia en los medios de transporte de Campylobacter Jejuni en especímenes fecales humanos

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación

Aquí presentamos un protocolo para la identificación rápida de proteínas producidas por bacterias patógenas secuenciadas genómicamente utilizando espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. Los iones proteicos metaestables se fragmentan debido al efecto del ácido aspártico y esta especificidad se explota para la identificación de proteínas.

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.

Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.

Campylobacter es la principal causa de gastroenteritis bacteriana transmitida por los alimentos en todo el mundo. A pesar de que los establecimientos adoptan medidas para reducir la prevalencia en sus instalaciones, los productos contaminados llegan constantemente a los consumidores. La técnica desarrollada durante los últimos doce años aborda las limitaciones de los métodos existentes para aislar y detectar Campylobacter spp. de la carne cruda.

Detección y aislamiento de Campylobacter spp. a partir de carne cruda

Este protocolo permite una evaluación rápida y rentable de la composición microbiana en los productos lácteos mediante la combinación de la culturomica con MALDI-TOF MS. Ofrece resultados de taxonomía comparables a la secuenciación de ARNr 16S con un tiempo de respuesta más corto que los métodos de cultivo tradicionales.

Evaluación de la seguridad microbiana de las lecherías mediante perfiles proteómicos bacterianos mediante el enfoque MALDI

Aprende la subtipificación de Campylobacter jejuni ssp. doylei mediante espectrometría de masas basada en filoproteómica (MSPP). Este método rápido y económico permite analizar brotes bacterianos y predecir fenotipos como resistencia a fármacos.

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