Name: subtipificación de Campylobacter jejuni Ssp. doylei El uso de aislamientos PhyloProteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende la subtipificación de Campylobacter jejuni ssp. doylei mediante espectrometría de masas basada en filoproteómica (MSPP). Este método rápido y económico permite analizar brotes bacterianos y predecir fenotipos como resistencia a fármacos.

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Estamos agradecidos a Hannah Kleinschmidt por su excelente soporte técnico. Este artículo fue financiado por el programa de apoyo al Acceso Abierto de la Deutsche Forschungsgemeinschaft y el fondo de publicaciones de la Georg August Universität Göttingen.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más crítico en el establecimiento de un régimen de MSPP es la determinación genética inequívoca de las identidades de iones de biomarcadores. Si no es posible identificar un biomarcador, sin duda, entonces debe ser excluido del régimen 13. El C. ssp. doylei esquema jejuni incluye 14 diferentes iones de biomarcadores. Estos son 5 menos en comparación con la C. jejuni ssp. esquema de jejuni MSPP 13 .La diferencia más si...

Durante la última década, láser asistida por matriz de desorción ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) ha avanzado a ser un método estándar de gran valor para el género microbiano y la identificación de las especies en microbiología clínica 1, 2. La identificación de especies se basa en el registro de huellas digitales pequeñas proteínas de las células intactas o lisados ​​celulares. El rango de masa típica de un espectrómetro de masas utilizado en microbiología clínica habitual es de 2-20 kDa. Además, el espectro resultante se puede utilizar para discriminar las cepas en las siguientes especies y de nivel 3 por debajo de la subespecie. Los primeros estudios pioneros han identificado iones de biomarcadores específicos para un subgrupo particular de las cepas de Campylobacter jejuni en 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, y EScherichia coli 10 - 12. La combinación de varias masas de biomarcadores variables correspondientes a las isoformas alélicas ofrece la opción para los subtipos más profundo. Anteriormente, hemos implementado con éxito un método para convertir estas variaciones en los perfiles de masas en relaciones significativas y reproducibles phyloproteomic llamados phyloproteomics basados espectrometría de masas (MSPP) en un C. ssp jejuni. colección aislado jejuni 13. MSPP se puede utilizar una de espectrometría de masa equivalente a las técnicas de subtipificación basada en la secuencia de ADN como la secuencia de mecanografía multilocus (MLST). Especies de Campylobacter son la principal causa de gastroenteritis bacteriana en todo el mundo 14, 15. Como consecuencia de la campilobacteriosis sequela post-infecciosa, a saber, el Síndrome de Guillain Barré, artritis reactiva y enfermedad inflamatoria intestinal puede surgir 16. Las principales fuentes de infección sonla carne de ganado contaminado de pollo, pavo, cerdos, vacas, ovejas y patos, la leche y la superficie del agua 15, 17. Por lo tanto, los estudios de vigilancia epidemiológica regulares en el contexto de la seguridad alimentaria son necesarias. MLST es el &quot;patrón oro&quot; en la tipificación molecular de especies de Campylobacter 18. Debido a que el método de Sanger de secuenciación basada MLST es un trabajo intensivo, que consume tiempo y es relativamente caro, MLST datos está restringido a cohortes relativamente pequeñas aisladas. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos de subtipificación más baratos y más rápidos. Esta necesidad podría satisfacerse mediante métodos de espectrometría de masas como MSPP. En este trabajo se presenta un protocolo detallado para MSPP tipificación usando una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos y la comparación de su potencial con MLST.

<table><tbody><tr><td>acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Autoflex III TOF/TOF 200</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>GT02554 G201</td><td>Espectrómetro de masas</td></tr><tr><td>patrón de prueba bacteriana BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td></td><td>263564 Paquete de software</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>8290190</td><td>5 tubos</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislar&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; cepa 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinación de la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Gante, Bélgica</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinación de la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Gante, Bélgica</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei aislado&nbsp;</td><td>Bélgica coordinó la recolección de microorganismos/Laboratorio de Microbiología UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Columbia agar base&nbsp;</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.10455 .0500</td> Brújula de <td>500 g</td></tr><tr><td>para FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>251419 Paquete</td><td>de</td> software</tr><tr><td>sangre de oveja desfibrinada&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Alemania</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>02854 Ácido</td> fórmico Fluka <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matriz HCCA</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes papel tisú</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>259935</td><td>Paquete de software Mástil</td></tr><tr><td>Viales Cryobank</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Alemania</td><td>Objetivo de acero pulido CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemania</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>insulina humana recombinante</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td> Ácido trifluoroacético <td>I2643</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>agua, de grado de biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

subtipificación de<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; el uso de aislamientos phyloproteomics basados ​​en espectrometría de masas (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS ofrece la posibilidad de diferenciar algunas bacterias no sólo a nivel de especies y subespecies, sino incluso por debajo, a nivel de cepa. isoformas alélicas de los iones detectables de biomarcadores resultan en desplazamientos en masa aislante específica. phyloproteomics de masas basado en la espectrometría (MSPP) es una nueva técnica que combina las masas de espectrometría de masas de biomarcadores detectables en un esquema que permite la deducción de las relaciones phyloproteomic de los cambios de masa específica del aislante en comparación con un genoma secuenciado cepa de referencia. Las secuencias de aminoácidos deducidas se utilizan entonces para calcular dendrogramas basados ​​en MSPP. A continuación se describe el flujo de trabajo del MSPP escribiendo un ssp Campylobacter jejuni. Doylei colección aislado de siete cepas. Todos los siete cepas eran de origen humano y la secuencia de multilocus (MLST) demostrado su diversidad genética. MSPP tipificación resultó en siete diferentes tipos de secuencias del MSPP, lo que refleja suficientemente su grafíalas relaciones logenetic. El C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP incluye 14 diferentes iones de biomarcadores, proteínas ribosomales en su mayoría en el rango de masa de 2 a 11 kDa. MSPP puede, en principio, ser adaptado a otras plataformas de espectrometría de masa con un rango de masa extendida. Por lo tanto, esta técnica tiene el potencial de convertirse en una herramienta útil para la tipificación microbiana nivel de cepa.

Anteriormente, hemos establecido con éxito un esquema de MSPP para C. ssp jejuni. jejuni 13. En este caso, el objetivo fue extender el método a la hermana subespecie C. ssp jejuni. doylei. En esta configuración específica, siete C. jejuni ssp. doylei los aislados fueron adquiridos de la colección belga de microorganismos / Laboratorio de Microbiología UGent BCCM / LMG Gante, Bélgica. Todos los siete aislam...

Se utilizó phyloproteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) para escribir una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos a nivel de cepa en comparación con la tipificación de secuencia de multilocus (MLST).

subtipificación de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; El uso de aislamientos PhyloProteomics basados ​​en espectrometría de masas (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

El objetivo general de este procedimiento de espectrometría de masas, denominado MSPP o Filoproteómica basada en Espectrometría de Masas, es subtipificar bacterias a nivel de cepa. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en los campos de la Microbiología, Epidemiología e Higiene. Por ejemplo, puede emplearse para analizar situaciones de brote mediante la visualización de la relación filoproteómica.En comparación con otros métodos de tipificación, el MSPP es económico por muestra y muy rápido. Las infecciones nosocomiales son un problema de importancia creciente, y esperamos que nuestro esquema de MSPP pueda extenderse hacia la tipificación epidemiológica de otras bacterias, o incluso de hongos. Nuestro esquema de MSPP proporciona información sobre la relación entre cepas, por lo que tiene sentido aplicarlo cuando se desean predecir fenotipos relevantes, como la resistencia a fármacos o incluso la virulencia, siempre que estos fenotipos se correlacionen con genotipos específicos.Para comenzar este procedimiento, prepare dos tubos de solución de matriz disolviendo 2,5 miligramos de HCCA en 250 microlitros de una mezcla de disolvente orgánico, un 50%isonitrilo. Añada insulina humana recombinante como calibrador interno a uno de ellos, seguido de 47,5%agua doblemente destilada y 2,5%ácido trifluoroacético. A continuación, extienda una cantidad del tamaño de una cabeza de alfiler de una colonia de la cepa de referencia directamente sobre una placa de objetivo MALDI.Para la determinación de la masa exacta del pico de calibración, coloque un microlitro del estándar de prueba en otro lugar. Superponga cada punto de bacteria y estándar con 1 microlitro de solución de matriz enriquecida con HCCA y déjelos cristalizar a temperatura ambiente. Para cada cepa que se analice, repita la preparación del frotis.Cubra cada punto con 1 microlitro de solución de matriz HCCA enriquecida y deje cristalizar a temperatura ambiente. Alternativamente, las proteínas pueden extraerse de células difíciles de lisar. Para ello, recolecte aproximadamente 5 colonias de un cultivo en placa de Agar con un asa de inoculación.Suspéndalos en 300 microlitros de agua doblemente destilada en un tubo de reacción de 1,5 mililitros y mézclelos completamente mediante pipeteo repetido hasta que las colonias bacterianas estén totalmente suspendidas. Luego añada 900 microlitros de etanol absoluto y mezcle. Centrifugue la muestra a 13.000 g durante 1 minuto.Después de secar el precipitado, volver a suspenderlo pipeteando hacia arriba y hacia abajo en 50 microlitros de ácido fórmico al 70%. Luego, añadir 50 microlitros de acetonitrilo y mezclar. Eliminar los residuos mediante centrifugación a 13.000 g durante 2 minutos.Una vez finalizado, transfiera 1 microlitro del sobrenadante a una posición de muestra en una placa objetivo para MALDI. Después de permitir que la muestra se seque, cubra cada punto con un microlitro de solución de matriz HCCA y deje cristalizar a temperatura ambiente. En este punto, realice el análisis MALDI-TOF reuniendo 600 espectros en pasos de 100 disparos para cada punto.Primero, haga clic en la pestaña de ejecución automática en el software de configuración del espectrómetro de masas. Abra el método haciendo clic izquierdo en el botón de método y seleccionando el método del menú desplegable. A continuación, haga clic izquierdo en el botón de edición para abrir el editor de métodos de ejecución automática.Bajo la pestaña acumulación, establezca el valor de disparos satisfactorios en 100 y el valor de suma en 600. Para cada espectro, seleccione el pico del calibrador de la lista, haga clic en 'asignación automática' y presione 'Aceptar'. Después de obtener los espectros de masas de cada punto, determine experimentalmente la masa exacta del pico de calibración abriendo un espectro con el explorador de espectros y localizando el pico en la masa esperada, en comparación con un espectro sin calibrador. Verifique que el pico del calibrador no esté oculto por ningún otro biomarcador del organismo de interés.A partir de los datos de secuenciación del genoma de la cepa de referencia, calcule el peso molecular monoisotópico teórico de cada una de las proteínas codificadas traduciendo la secuencia de ADN en la secuencia de aminoácidos correspondiente. Cargue el archivo o copie y pegue la secuencia de proteína en el cuadro de entrada del panel de recursos bioinformáticos adecuado, y calcule el punto isoeléctrico teórico y el peso molecular. Copie los resultados en una hoja de cálculo con una columna que contenga el identificador del gen y otra columna con el peso molecular.Ordene las filas por peso molecular calculado para facilitar la búsqueda de masas. Inserte una columna adicional en la hoja de cálculo para el peso molecular de la forma desmetaninada, restando 135 daltons al peso molecular mono-isotópico. Asigne a cada masa principal de biomarcador medida las masas calculadas a partir de la cepa de referencia, buscando la masa medida en la tabla genómica.En otra hoja de cálculo, registre la masa y el identificador de cada ion biomarcador. Ahora calibre los espectros de masas obtenidos a partir de los aislados recolectados, tal como se hizo con la cepa de referencia. Para un aislado por fila, identifique los biomarcadores variantes en los espectros de masas, registre la masa medida para cada biomarcador y el isoforma predicho en las columnas respectivas.El espectro de masas MALDI-TOF de C-Jejuni Subespecie doylei ATCC 49349 contiene 14 iones biomarcadores con carga singular que pudieron identificarse mediante la comparación de las masas moleculares calculadas con el espectro de referencia. Dentro de la colección, se detectaron formas iso variables para L32 sin metionina, L33 y la proteína hipotética codificada por gil152939117, S20 M y S15 M. Las masas restantes asignadas a los iones biomarcadores fueron invariables en los aislados analizados. La sustitución de aminoácidos correspondiente al cambio de masa se identificó mediante amplificación por PCR y secuenciación Sanger del gen particular utilizando los cebadores listados aquí.Se indican aquí las secuencias de aminoácidos de todos los iones biomarcadores incluidos en el esquema MSPP, así como los isotipos alélicos detectados. El dendrograma UPGMA basado en MLST construido a partir de los aislamientos examinados de la subespecie C jejuni doylei muestra que cada aislamiento pertenece a un tipo de secuencia MLST diferente. Y la cepa LMG7790 presenta la mayor distancia filogenética.Como se observó con el análisis MLST, el aislado LMG7790 presenta la mayor distancia filoproteómica en el análisis MSPP de los aislados examinados de la subespecie C jejuni doylei. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día si se lleva a cabo correctamente. Al seguir este procedimiento, es importante recordar la toxicidad de algunas sustancias utilizadas durante el experimento.Por ejemplo, el acetonitrilo puede causar irritación en la piel. Además, se pueden realizar otros métodos para MSPP, como la secuenciación de ADN, para analizar parámetros adicionales, como la presencia de genes de resistencia. El desarrollo de esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploren la fotogenia.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo funciona MSPP y cómo puede aplicarse a preguntas específicas. No olvide que trabajar con patógenos peligrosos puede ser extremadamente riesgoso y que siempre se deben tomar precauciones, como utilizar equipo de laboratorio de nivel S2.

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Aprende la subtipificación de Campylobacter jejuni ssp. doylei mediante espectrometría de masas basada en filoproteómica (MSPP). Este método rápido y económico permite analizar brotes bacterianos y predecir fenotipos como resistencia a fármacos.

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