Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas

El objetivo general de este método es generar embriones de pez cebra parabióticos, que se pueden utilizar para estudiar las funciones intrínsecas de las células frente a las extrínsecas de las células para los genes candidatos de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la autonomía celular. Por ejemplo, en el sistema hematopéyico, los defectos vitales en la migración de las HSC son intrínsecos a las HSC o al microambiente de nicho.

La principal ventaja de este protocolo es una capacidad mejorada para generar con éxito embriones de pez cebra parabiótico. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque los embriones en desarrollo son extremadamente frágiles y se dañan fácilmente. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de sutura quirúrgica pueden ser difíciles de aprender porque requieren un alto grado de exactitud y precisión.

Aquí proporcionamos instrucciones paso a paso para generar embriones de pez cebra parabióticos por fusión quirúrgica de blástulas en desarrollo. Este método demuestra cómo aumentar la eficiencia de las fusiones de parabióticos y mejorar la supervivencia de los embriones siameses. Después de preparar los reactivos y las herramientas de acuerdo con el protocolo de texto, prepare dos o tres pipetas Pasteur modificadas calentando brevemente el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen.

Luego, con pinzas grandes, mientras aún está caliente, doble el extremo de la pipeta aproximadamente 45 grados. Para asegurarse de que no haya bordes afilados que puedan dañar los embriones, mantenga el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen durante uno o dos segundos. Utilizando ADN plasmático, ARNm o morfolino, microinyecte embriones dentro de una hora después de la recolección y permita que se desarrollen hasta la etapa de 256 células.

A medida que los embriones se acercan a la etapa de 256 células, transfiera cada fondo genético a placas separadas recubiertas de agarosa, vasos de precipitados de vidrio sin arañazos o placas de Petri. Después de descorionar los embriones de acuerdo con el protocolo de texto, descongele la metilcelulosa previamente preparada y use una centrífuga de mesa a máxima velocidad para peltear los cristales no disueltos, lo que dañará los embriones o romperá las yemas. Mientras tanto, con un marcador, marque de 12 a 15 puntos predeterminados en la parte inferior de una placa de Petri recubierta de agarosa de 100 mililitros.

Luego, después de la centrifugación, utilizando la fracción superior clara de la metilcelulosa, transfiera gotas de uno a 1,5 centímetros a los puntos marcados en la placa de Petri. A continuación, prepare una alícuota de 40 mililitros de ringer con alto contenido de calcio, o solución de HCR por plato recubierto de agarosa que se acaba de preparar. A cada alícuota, agregue antibióticos como se indica aquí.

Cuando esté listo para realizar fusiones de blástula, use las alícuotas de HCR con antibióticos para llenar cuidadosamente cada placa que contenga las gotas de metilcelulosa, teniendo cuidado de no interrumpir las gotas. Conecte una pipeta Pasteur de vidrio modificado preparada anteriormente a una bomba de pipeta de 10 mililitros. Luego, bajo un estereoscopio, recoja un embrión decorionado de cada fondo.

Antes de dispensar los dos embriones, utilice la pipeta Pasteur para hacer una pequeña depresión en el centro de la gota de metilcelulosa. Luego, deposita los dos embriones en la depresión. Ahora, usando una aguja de burla con una punta de carga de gel en el extremo, use movimientos suaves de barrido sin tocar directamente los embriones para reposicionar cuidadosamente los embriones dentro de la metilcelulosa, de modo que sus polos animales se toquen directamente entre sí.

La orientación adecuada de los embriones en desarrollo dicta cómo se fusionarán y desarrollarán los embriones. Para fusiones de cabeza a cabeza, asegúrese de que cada fusión esté alineada en sus polos animales. Deje que los embriones se asienten durante cinco minutos para que la metilcelulosa se asiente a su alrededor.

Durante este tiempo, cargue el siguiente par en otra gota. Para realizar la cirugía, utilizando la herramienta de aguja de vidrio, enrolle cuidadosamente cada embrión en su punto de contacto. Luego, con un suave movimiento de costura, tire de las células del primer embrión hacia el segundo embrión y viceversa.

Al final del movimiento, sostenga la aguja en su lugar durante dos o tres segundos antes de retirarla muy lentamente. La precisión con la aguja de vidrio es fundamental para garantizar que los embriones estén correctamente cosidos. Se debe tener cuidado de no dañar los sacos vitelinos mientras se mantiene suficiente conexión para una fusión exitosa.

Deje reposar los embriones durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, cose pares adicionales de embriones. Después de la incubación, evalúe si los embriones han permanecido unidos y repita el paso de herida si es necesario.

Incubar los embriones en el mismo plato y medio a 28,5 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, los embriones habrán salido de la metilcelulosa disuelta en su mayoría. Extraer los embriones que no se hayan fusionado con éxito.

Luego, decanta el medio y usa 25 mililitros de E3 para reemplazarlo. Para adquirir imágenes de los embriones fusionados, prepare agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión. Mientras aún está caliente, alícuota 1 mililitro de la agarosa en tubos de microfuga de 1,5 mililitros colocados en un bloque calefactor a 37 grados centígrados.

Anestesiar los embriones parabióticos añadiendo un mililitro de cuatro miligramos por mililitro de tricaína pH 7.0 a los 25 mililitros de medio E3 que contienen los embriones. Agita suavemente el plato para que los embriones se acumulen en el medio. A continuación, con una pipeta de transferencia de plástico de punta ancha, extraiga los embriones en la menor cantidad de líquido posible.

A continuación, gire la pipeta en posición vertical y haga rebotar suavemente los embriones para que se asienten en el fondo de la pipeta. A continuación, transfiera los embriones a una alícuota de 1 mililitro de agarosa de bajo punto de fusión tocando ligeramente la punta de la pipeta en la superficie de la agarosa. Deseche el exceso de líquido de la pipeta y utilícela para mezclar suavemente los embriones con la agarosa.

Luego, con la pipeta, transfiera la agarosa y los embriones al pocillo de una placa de seis pocillos con fondo de vidrio. Bajo un microscopio estereoscópico, use una punta de carga de gel fijada al extremo de una aguja de burla para colocar los embriones cerca del cubreobjetos y en la orientación deseada para la obtención de imágenes. Una vez que la agarosa se haya fraguado y se haya agregado un medio con tricaína a los pocillos, use un microscopio confocal de escaneo láser de epifluorescencia de campo amplio invertido o un microscopio confocal de disco giratorio para adquirir imágenes.

Para un campo de visión de todo el embrión, utilice un objetivo 4X. Utilice un objetivo de 20X para obtener imágenes de un tejido específico. Procese las imágenes de acuerdo con el protocolo de texto.

Como se muestra aquí, después de orientar dos blástulas con sus polos animales uno frente al otro, los embriones fueron cuidadosamente heridos en su punto de contacto. Un mayor grado de herida aumentó la probabilidad de que los embriones mantuvieran una conexión que resultó en una fusión exitosa sin defectos morfológicos adicionales o retraso en el desarrollo. Como se demuestra en esta figura, al orientar las dos blástulas con sus polos animales alineados directamente, se generaron fusiones confiables de cabeza a cabeza o de saco vitelino a saco vitelino con circulación compartida.

En la mayoría de los casos, los embriones tenían dos corazones que bombeaban una circulación común compartida. Para confirmar que los embriones realmente compartían su circulación, los embriones transgénicos fusionados que tenían eritrocitos GFP positivos se fusionaron con embriones que tenían células endoteliales vasculares mCherry positivas. Como se ve en esta película, 48 horas después de la fertilización, se observaron eritrocitos positivos para GFP circulando a través del embrión asociado Flik 1 HRAS mCherry.

Finalmente, para investigar el control temporal de la expresión génica, uno de los dos embriones fue inyectado con una construcción de ADN hsp70 EGFP. Después de un breve choque térmico de 30 minutos a 37 grados centígrados, se estableció una señal clara de GFP en uno de los embriones y, en algunos casos, se observaron células GFP positivas circulando en el embrión asociado no inyectado. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado al suturar las dos blástulas y volver a visitar las fusiones si la cirugía no tuvo éxito en el primer intento. Siguiendo este procedimiento, se pueden usar métodos adicionales, como la obtención de imágenes de células vivas, para responder preguntas adicionales, como si las HSC de tipo salvaje pueden funcionar normalmente en un nicho mutante o, por el contrario, si las HSC mutantes pueden funcionar en un nicho de tipo salvaje. Esta técnica proporciona un método poderoso para que los investigadores en el campo de la hematología estudien la regulación del desarrollo sanguíneo en el pez cebra.

No olvide que la tricaince puede ser peligrosa y que siempre se deben tomar precauciones, como usar un atuendo de seguridad adecuado, al realizar este procedimiento. Después de ver este video y seguir nuestras técnicas recomendadas, esperamos que puedas generar mejores embriones bióticos de pez cebra con mayor éxito.