Name: Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprende a generar embriones parabióticos de pez cebra mediante fusión quirúrgica de blástulas en desarrollo. Este método permite estudiar funciones celulares autónomas y no autónomas en Danio rerio.

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Agradecemos a Julie R. Perlin por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. D.I.S. cuenta con el apoyo de subvenciones de la Sociedad Americana de Hematología, la Fundación de la Anemia de Cooley y los NIH (K01DK085217 y R03DK100672). E.J.H. es miembro del Instituto Médico Howard Hughes de la Fundación Helen Hay Whitney. B.L. es becario de investigación médica del Instituto Médico Howard Hughes. B.W.B. cuenta con el apoyo de una beca Irvington del Instituto de Investigación del Cáncer y un joven investigador Premio de la Fundación Conquer Cancer de ASCO. L.I.Z. cuenta con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH, R01CA103846, P01HL032262 y R01HL04880), la Fundación Taub para la Investigación de MDS, el Instituto de Células Madre de Harvard y es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston. Este protocolo se modificó a partir de un método publicado previamente 15. 1. Preparación de los reactivos (días o semanas de anticipación) <ol><li> Preparar 1,5% de agarosa recubiertas de platos. Añadir 1,5 g de agarosa a 100 ml de medio de pez cebra E3 en un matraz Erlenmeyer. El calor, disolver la agarosa, y luego vierta aproximadamente 5 ml en 100 mm de diámetro x 20 mm placas de Petri profundas. Nota: Estos se utilizan para dechorionation de embriones (Paso 3.1) y para la cirugía parabiotic (paso 3.3). Almacenar placas revestidas con agarosa a 4 ° C durante unas semanas; sacarlos de la nevera y calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic. </li><li> Preparar 4% de celulosa de metilo. Disolver 4 g de polvo de metilcelulosa en 100 ml de E3 en un matraz Erlenmeyer con una barra de agitación. Colocar el matraz en una placa de agitación a 4 ° C, ajuste a la velocidad más baja, y dejar que se mezclepara un máximo de 2 días. <ol><li> utilizar de forma intermitente una espátula para romper los grumos blancos de metilcelulosa. Los cristales metil celulosa no se disuelven completamente a esta concentración. Cuando la solución se vuelva clara y aparece homogénea sin grumos blancos restante, parte alícuota de la solución en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se congelan a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Nota: Las concentraciones más bajas de metil celulosa se pueden utilizar; Sin embargo, este porcentaje más alto, más viscosa de celulosa de metilo ha dado los mejores resultados. </li></ol></li><li> Preparar la solución de Ringer alta de calcio (HCR). Para hacer 400 ml de solución HCR, mezcla 8 ml de NaCl 5 M (116 mM final), 400 l de 3M KCl (2,9 mM final), 800 l de 5M de CaCl2 (10 mM final), y 2 ml de HEPES 1 M (5 mM final) con 390 ml de medio E3. Nota: La solución de tienda HCR a 4 ° C durante unas semanas; calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic. </li><li> Preparar 5 - 6 pipetas Pasteur modificados para la transferenciasonar blástula pares. Brevemente calentar el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen. Entonces, el uso de grandes pinzas, doblar el extremo de la pipeta a aproximadamente 45 ° C mientras todavía está caliente. <ol><li> Para asegurarse de que no hay bordes afilados que puedan dañar embriones, sostenga la punta de la pipeta brevemente en la llama durante unos 3 seg. Esto suavizará / esmalte al final de la pipeta. Esta pipeta Pasteur de vidrio modificada se utiliza en conjunción con una bomba de pipeta 10 ml (Figura 1) en el paso 3.5 a continuación. </li></ol></li><li> Preparar herramientas de aguja de vidrio para la costura quirúrgica de pares de blástula. Tire 2 - 3 agujas de vidrio como se hizo para la microinyección de embriones de pez cebra. Utilizar el laboratorio de película para fijar cada aguja de vidrio en el extremo de una aguja burlas leña o con mango de plástico (Figura 1A). El uso de pinzas, rompa el extremo de la aguja en un diámetro de aproximadamente 20 - 30 micras. Use un micrómetro de platina para guiar este paso (Figura 1B). Nota: El tamaño del needle punta es importante. Si la punta es demasiado grande se hace difícil de controlar con precisión y puede causar un daño excesivo. Si la punta es demasiado pequeño, es difícil bobinado suficientemente los embriones. </li></ol> 2. La creación de parejas reproductoras de pez cebra y percepción de los embriones (día -1 al día 0) <ol><li> Configurar parejas de adultos de pez cebra. Configurar el pescado la noche anterior se va a realizar la cirugía parabiosis. Utilice divisores para separar machos y hembras. Para aumentar las probabilidades de que se obtengan los embriones deseados, la creación de varias parejas de cada línea. Nos encontramos con que normalmente 20 - 50% de las parejas se generan. </li><li> A la mañana siguiente, tire de los divisores y permitir el apareamiento. Recoger los embriones utilizando un colador de té de malla fina, y luego transferirlos a una placa de Petri que contiene medio de embrión E3 18. </li><li> Micro-inyectar embriones como desee (por ejemplo, con 25 pg de ADN de plásmido, el ARNm pg 200, o con 1 a 6 ng morfolino) dentro de 1 h de colección. Permitirlescrecer hasta la etapa 256 de células. Si la construcción de expresión de ADN se coloca bajo el control de un promotor de choque térmico (por ejemplo, la hsp70, la Figura 4B), controlar el momento de la expresión génica por desconchado térmico los parabionts a 37 ° C en una etapa posterior (por ejemplo., En 36 hpf ). Nota: Como alternativa a un transgén fluorescente, dextrano fluorescente se puede añadir a la DNA, RNA, o la mezcla de inyección de morfolino (por ejemplo, dextrano, azul cascada a 2 mg / ml). El tinte de dextrano no interfiere con el desarrollo normal y permitirá el embrión inyectado para ser identificado bajo la luz fluorescente apropiada después de la fusión parabiotic. Alternativamente, la parabiosis de una cepa pigmentado (por ejemplo, AB) con una cepa no pigmentado (por ejemplo, Casper) podría ser utilizado para identificar el embrión inyectado en etapas posteriores. </li><li> Incubar los embriones a 28,5 ° C.Use un estereoscopio para controlar su evolución periódicamente a medida que se acercan al dev-256 célulaselopmental etapa (aproximadamente 2,5 HPF). Nota: Si es necesario, cambiar los embriones a diferentes temperaturas para garantizar la coincidencia de fase entre los socios parabiotic (por ejemplo, embriones de morfolino-inyectada a menudo desarrollan más lento que sus contrapartes de la ONU con inyección de desplazamiento de los embriones de la ONU-inyectada a RT mientras que los embriones de morfolino-inyectada se colocan. a 28,5 ° C resultará en sus etapas de alineación después de un par de horas de desarrollo). </li></ol> 3. Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas <ol><li> Como los embriones se acercan a la etapa 256 de células (aproximadamente 2,5 hpf), la transferencia de los embriones de cada fondo genético (es decir, mutante genético, líneas transgénicas y / o la manipulación genética) en placas de agarosa recubiertas de separados (por ejemplo, un plato de morfolino embriones inyectados y un segundo plato para el control de embriones). Por otra parte, la transferencia de los embriones para limpiar, vasos de vidrio libre de arañazos o platos de Petri de vidrio. Nota: Evitar el uso de placas de plástico no revestidas como los embriones se adhieren al plástico y dañarse una vez fuera de sus chorions. </li><li> Decantar los medios de comunicación E3 hasta justo suficiente líquido permanece para cubrir los embriones (aproximadamente 7 - 10 ml). Añadir 200 l de 50 mg / ml de mezcla de proteasas aislados del fluido extracelular de Streptomyces griseus (proteasas). Agitar suavemente los embriones cada par de minutos. <ol><li> Cuando el 50% de los embriones han salido de sus corion, que por lo general tarda de 5 - 10 minutos, enjuagar tres veces con un volumen generoso (aproximadamente 15 - 20 ml) de medio E3 de embriones frescos. <ol><li> Dechorionate los embriones restantes en sus chorions dibujando suavemente hacia arriba en la pipeta Pasteur de vidrio modificado y luego suavemente disiparlas. Una vez que los embriones se han dechorionated y lavado, vuelva a colocar los medios de comunicación E3 con una solución de HCR. Como una alternativa a las proteasas, retire los chorions forma manual utilizando una pinza fina. Trate de tener 60 - 100 dechorembriones ionated disponibles para cada condición experimental. Nota: Esta es varias veces más que en última instancia ser utilizado, pero muchos embriones son propensos a sufrir daños durante la manipulación o la cirugía para la parabiosis. Una vez que los embriones se dechorionated, mantenerlos sumergidos y no permita que se toquen la superficie del agua, ya que la tensión superficial causará que sean destruidos. Tenga en cuenta que el uso de una dosis más alta de las proteasas permite que los embriones salen de sus chorions más pronto y de una forma más sincronizada. Cuando se utiliza una dosis más baja de las proteasas, los embriones toman más tiempo para salir de sus chorions y lo hacen de una manera síncrona menos, lo que puede resultar en una parte de los embriones ser dañado por la exposición prolongada a proteasas. </li></ol></li></ol></li><li> Descongelar la metilcelulosa (hecho en el paso 1.2 anterior) y se centrifuga en una centrífuga de mesa de la velocidad máxima durante 10 minutos para sedimentar los cristales sin disolver que dañarán los embriones o la ruptura de su yemas. <ol><li> Después de la centrifugación, utilice la fracción superior clara (aproximadamente 75% del volumen). Transfer 1 - gotas de diámetro 1,5 cm de metil celulosa en una placa Petri recubierta de agarosa 1,5%. Tenga cuidado de evitar la elaboración de cualquiera de los cristales sedimentadas desde el fondo del tubo. </li><li> Use un marcador para predeterminar la posición de cada gota en la parte inferior del plato. Coloca 12 - 15 gotas (2 - 3 por valor de alícuotas &#39;) de metil celulosa por 100 mm placa de Petri de diámetro. Preparar tantas placas como sea necesario por experimento. Nota: Use cada gota para la fusión de un solo par de blástula. La marca designará la ubicación de cada gotita vez se añade-en el punto de medios de comunicación que las gotas se convierten casi invisible. </li></ol></li><li> Preparar uno 40 ml alícuota de solución HCR antibiótico suplementada por placa de agarosa recubiertas de preparado anteriormente en el paso 3.3. A cada 40 ml alícuota de HCR añadir penicilina-estreptomicina a 50 U / ml, ampicilina a 50 U / ml, y kanamicina a 0,5 g/ Ml. <ol><li> Cuando esté listo para realizar fusiones de blástula, llenar cuidadosamente cada uno de los platos que contienen gotitas de celulosa de metilo con 40 ml de la solución de antibiótico HCR-suplementado. Si se añade la solución HCR demasiado rápido, puede interrumpir las gotas. </li></ol></li><li> Una el vidrio modificado pipeta Pasteur (hecho en el paso 1.4 anterior) a una bomba de pipeta 10 ml. En un estereoscopio recoger un embrión dechorionated de cada plano (por ejemplo, un embrión morfolino-inyectado y uno de tipo salvaje embriones). <ol><li> Antes de dispensar los dos embriones, utilizar la pipeta Pasteur para hacer una pequeña depresión en el medio de la caída de metil celulosa, luego suavemente depositar ambos embriones en la depresión. Nota: Durante el proceso de transferencia, gire la pipeta Pasteur ligeramente hacia arriba para que los embriones se depositan en la curva de la pipeta Pasteur a fin de evitar su toma de contacto con la superficie del líquido en la parte superior o inferior de la pipeta (que puede conducir a their ruptura). </li></ol></li><li> Inmediatamente después de depositar los embriones en el metilcelulosa, utilizar una aguja burlas leña o con mango de plástico con una punta de pipeta de carga de gel en el extremo (Figura 1 A) para volver a colocar cuidadosamente los embriones dentro de la metilcelulosa tal manera que sus polos animales son directamente tocarse. <ol><li> Utilizar suaves movimientos de barrido a través de la metilcelulosa cerca de los embriones para cambiar su posición sin tocar directamente. Deje que los embriones se sientan durante 5 minutos por lo que la metilcelulosa se instalará en torno a ellos. Durante este tiempo, cargue el siguiente par en otra gota. Nota: Evitar el contacto directo con los embriones y tener especial cuidado de no tocar ninguna parte del saco vitelino, que se romperá fácilmente. </li></ol></li><li> Con la herramienta de aguja de vidrio, la herida cuidadosamente cada embrión en su punto de contacto. Con un movimiento suave de costura, las células de la primera embriones pueden introducirse en el segundo embrión y luego de vuelta otra vez.Al final de este movimiento, mantener la aguja en el lugar durante 2 - 3 segundos y después alejarla muy lentamente. Nota: Hay un período de aproximadamente 2 a 3 segundos después de los embriones son heridas donde los dos tejidos parecen ser más adhesivo y más probable para unir el uno al otro. Por lo tanto, creemos que la celebración de la aguja en su lugar brevemente después de la herida ayuda a mantener los tejidos heridos de cada embrión en contacto durante el período inicial de tiempo inmediatamente después de la herida. </li><li> Permitir que estos embriones para sentarse durante 10 - 15 min a TA. Mientras tanto, seguir puntadas nuevos pares en otras gotas de metil celulosa. Después de 10-15 min, evaluar si el primer par se ha mantenido adjunto (Figura 2A). Nota: Si los embriones son ya unidos, repetir el proceso de costura durante el tiempo que los embriones son menores de alrededor del escenario epibolia 30%. Normalmente, esto permite hasta tres intentos para coser los embriones juntos. Si los embriones parecen haber mantenido un archivo adjunto pero la cone xión no es sustancial, realizar la costura adicional en el borde de la conexión para reforzarla. Evite agitar o mover los platos durante los períodos de incubación y de cirugía parabiotic. Nota: A pesar de su etapa de desarrollo temprano y fragilidad percibido, las masas de células de los embriones pueden tolerar una cantidad sustancial de manipulación (es decir, heridas y la costura), y aún desarrollarse normalmente. La yema de huevo, sin embargo, puede romperse con sólo el más mínimo contacto, causando la muerte del embrión. Cuando coser las dos blástulas con la aguja de vidrio, no para hacer contacto con la superficie de contacto entre la masa celular y la yema de cada embrión. </li><li> Incubar los embriones O / N a 28,5 ° C en el mismo plato y medios de comunicación (no cambie los medios de comunicación). Por la mañana siguiente, los embriones se han mudado de las gotitas de metil celulosa sobre todo disueltos. Retire cualquier embriones que no fueron fusionadas con éxito. Decantar los medios de comunicación y reemplazar con una fresca 25 ml E3. Nota: Si se trabaja con unacepa pigmentada, añadir 500 l feniltiourea 0,15% (50x) (PTU) a una concentración final de 0,003% para bloquear la pigmentación. Los embriones deberán permanecer continuamente en la PTU para mantener la supresión de la pigmentación. </li></ol> 4. Configuración del microscopio, adquisición de imágenes, procesamiento y análisis <ol><li> Preparar agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión (LMP): Añadir 0,8 g de agarosa LMP a 100 ml E3 y el calor hasta que esté completamente disuelto. Si bien caliente, alícuota de 1 ml de agarosa LMP en 1,5 ml tubos de microcentrífuga en un bloque de calentamiento de 37 ° C. La agarosa LMP permanecerá fundido a 37 ° C. Añadir 40 l de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaína a cada alícuota de 1 ml de agarosa LMP a 37 ° C. Nota: Si se trabaja con una cepa pigmentada, se añaden 20 l de 0,15% (50x) PTU a cada alícuota de 1 ml. <ol><li> Almacenar la agarosa LMP restante durante varios meses en tubos de 50 ml sellados a 4 ° C. </li></ol></li><li> Anestesie embriones parabiotic a ser fotografiado mediante la adición de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaínaa los 25 ml de E3 que los embriones ya en lo son. </li><li> Hacer girar suavemente el plato de manera que los embriones pondrán en común en el medio. Luego, utilizando una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas elaborar los embriones en tan poco líquido como sea posible. Girar la pipeta en posición vertical y rebotar suavemente los embriones para que se depositan en el fondo mismo de la pipeta. <ol><li> Con los embriones en la parte inferior de la pipeta, transferirlos a una alícuota de 1 ml de agarosa LMP tocando ligeramente la punta de pipeta a la superficie de la agarosa. Evitar la transferencia de líquido en exceso ya que esto va a diluir la agarosa. </li></ol></li><li> Después de expulsar el exceso de líquido de la pipeta, use la pipeta para mezclar suavemente los embriones dentro de la agarosa, a continuación, utilizar la pipeta para transferir la totalidad de la agarosa y embriones para el bienestar de un fondo de vidrio (Nº 1.5 cubreobjetos), 6- así placa. Nota: Asegúrese de desechar la pipeta después de transferir los embriones a la placa de imagen. agarosa residual se establece dentro de la pipeta, rendering ineficaz para su uso posterior. Más bien, utilizar una pipeta nueva cada vez. </li><li> En virtud de un estereoscopio, utilizar una punta de pipeta de carga de gel fijado en el extremo de una aguja burlas mango de madera para colocar los embriones hacia abajo hacia la cubierta de vidrio (para asegurar que están dentro de la distancia de trabajo del objetivo de microscopio), y en la orientación deseada para formación de imágenes. Nota: Vuelva a colocar de forma continua hasta que la agarosa se ha establecido plenamente. Tenga cuidado para montar los embriones parabiotic según la cual el embrión de la pareja es a explorar. Dada la orientación aleatoria de los embriones unidos, para algunos pares puede ser difícil de imagen ambos embriones. En este escenario, la recuperación de los embriones a partir de la agarosa utilizando unas pinzas y una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas y luego volver a montar para obtener imágenes desde una perspectiva diferente. </li><li> Una vez que la agarosa se ha puesto, cubrir con 2 - 3 ml de E3 suplementado con tricaína (y PTU si es necesario). </li><li> Imagen los embriones utilizando un campo amplio epi-fluorescencia invertido, lasconfocal de barrido-er, o girando el disco microscopio confocal. Seleccionar el objetivo más apropiada para la formación de imágenes deseado. Para un campo de todo el embrión de vista, utilice un objetivo de 4x. Seleccionar un aumento mayor, tal como un objetivo de 20x, a la imagen un tejido específico 16, 19. Nota: Si se utiliza un microscopio vertical, montar en LMP agarosa (similar al anterior) en una hoja de la cubierta de vidrio. Invertir el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que tiene un anillo de grasa de vacío lleno con el mismo E3-tricaína-PTU 16, 19. </li><li> Proceso de las imágenes adquiridas utilizando paquetes de software de análisis de imágenes gratuitas, tales como NIH Image J / FIJI 16, 19. Nota: Contar el número de células y cuantificar la dinámica como la migración celular y la división celular utilizando la segmentación y el seguimiento de los algoritmos 16, 19. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Parabiotic fusión ha sido una herramienta poderosa para investigar las funciones celulares de genes candidatos en modelos murinos adultos y embriones de pollo de 10-14. Más recientemente, un método de fusión de blástula se ha descrito para la generación de embriones de pez cebra unidos 15. En el presente protocolo, tutoriales basados ​​en vídeo se utilizan para demostrar y describir la metodología para la creación de embriones de pez cebra parabiotic de diferentes orígenes genéticos con el fin de e...

Creación de mosaicos genéticos (quimeras) entre los de tipo salvaje y animales modificados genéticamente es una estrategia bien establecida y clásica para la investigación de células intrínseca frente funciones de las células extrínseca de genes candidatos 1-6. Blastula trasplante en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para generar embriones quiméricos para estudios de células autonomía 7-9. Dependiendo del tejido de interés, sin embargo, puede ser un reto para apuntar predecible células del donante en el tejido deseado (por ejemplo, sangre) 1-3, 7-9. Genetistas de ratón han utilizado mucho los métodos quirúrgicos parabiotic para generar organismos unidos con una circulación compartida 10-14. Debido a que los animales parabiotic comparten un torrente sanguíneo común, las interacciones entre las células que se originaron de un animal con células de los demás animales de un fondo genético diferente pueden ser estudiados 10-16. Recientemente, el grupo de Karima Kissa elegantemente demostrado la capacidad de crecomió embriones de pez cebra unidos y luego utilizar este sistema para estudiar madre hematopoyéticas y la migración de células progenitoras (HSPC) 15. Además, parabiosis pez cebra se utilizó recientemente para investigar el papel de cadherina endotelial 5 en células madre hematopoyéticas de la emergencia (HSC) y la migración, 16 y para estudiar el papel de las células del estroma en el nicho de HSPC durante el desarrollo de pez cebra 17. A diferencia de los ratones, embriones de pez cebra son transparentes y permiten la visualización directa de las células durante el desarrollo parabiotic, haciendo que el sistema únicamente de gran alcance. La utilidad de parabiosis en el pez cebra, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje, y la cirugía parabiotic en los embriones delicados puede ser técnicamente difícil sin una instrucción detallada y demostración visual. El objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados ​​en vídeo sobre cómo generar embriones de pez cebra para el estudio de parabioticfunciones de las células extrínseca de un gen (s) candidato por fusión quirúrgica de desarrollar blástulas temporal, celular intrínseco, o. modificaciones clave y recomendaciones adicionales para aumentar la supervivencia parabiont y nuevas aplicaciones experimentales se incluyen.

<table><tbody><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Componentes individuales para E3/HCR:</td><td></td><td>Para 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4</td>NaCl (Cloruro de <td></td></tr><tr><td>sodio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Cloruro de potasio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Cloruro de calcio dihidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (Sulfato de Magnessio heptahidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M) solución tampón</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catálogo Número</fuerte><</td><td></td></tr><tr><td>fuerte>Antibióticos:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>gibco de Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina de Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase de Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>vidrio capilar utilizado para agujas (vidrio capilar & Filamentos)</td><td>Instrumento Sutter</td><td>ARTÍCULO#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de burla con mangos de madera</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta de 10 ml (verde) (Pipeta de bomba de pipeta)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico de 100 mm de diámetro / 20 mm de profundidad (PLACA DE PETRI, 100/20 MM, PS, TRANSPARENTE, CON REJILLAS DE VENTILACIÓN, DISEÑO PESADO, 15 PIEZAS/BOLSA )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano, Azul Cascada, 10.000 MW, Aniónico, Lisina Fijable</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. El stock de trabajo es del 0,003% (50x es 0,15%). por 500 ml, 0,75 g N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (polvo) (Tricaína Metanosulfonato, Tricaína-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarosa (Ultrapure LMP agarose)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100 pipeta</td><td></td></tr> de <tr><td>transferencia de plástico (creo que solo la de extremo ancho)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos con fondo de vidrio utilizadas para la obtención de imágenes</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>punta de carga de gel occidental de plástico fijada en el extremo de una aguja de disección con mango de madera (puntas GELoader)</td>La cubierta de vidrio <td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>se desliza, se desliza y engrasa al vacío si se monta para un microscopio vertical:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasa de vacío ( Dow Corning & reg; grasa de silicona de alto vacío incoloro, peso 5.3 oz (tubo) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Deslizamientos</td> <td>de cubierta de vidrioCiencias de la vida de Corning</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de desarrollar blástulas

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

parabiosis quirúrgica de dos animales de diferentes orígenes genéticos crea un escenario único para el estudio de células intrínseca frente a las funciones de las células extrínseca de genes candidatos de interés, los comportamientos migratorios de las células, y las señales secretadas en los entornos genéticos distintos. Porque los animales parabiotic comparten una circulación común, nada de sangre o factor transmitida por la sangre de un animal se intercambiarán con su pareja y viceversa. Así, las células y los factores moleculares derivadas de uno antecedentes genéticos pueden ser estudiados en el contexto de un segundo fondo genético. Parabiosis de ratones adultos se ha utilizado ampliamente para la investigación del envejecimiento, cáncer, diabetes, obesidad, y el desarrollo del cerebro. Más recientemente, parabiosis de embriones de pez cebra se ha utilizado para estudiar la biología del desarrollo de la hematopoyesis. En contraste con los ratones, la naturaleza transparente de embriones de pez cebra permite la visualización directa de las células en el contexto parabiotic, por lo que es un método única y poderosa para la investigación de fmecanismos celulares y moleculares undamental. La utilidad de esta técnica, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje para la generación de los embriones de pez cebra parabiotic. Este protocolo proporciona un método paso a paso sobre cómo fusionar quirúrgicamente el blástulas de dos embriones de pez cebra de diferentes orígenes genéticos para investigar el papel de los genes candidatos de interés. Además, los embriones de pez cebra parabiotic son tolerantes a choque térmico, por lo que el control temporal de la expresión génica posible. Este método no requiere una sofisticada puesta a punto y tiene amplias aplicaciones para el estudio de la migración celular, la especificación del destino, y la diferenciación in vivo durante el desarrollo embrionario.

De acuerdo con estudios publicados previamente 15, el éxito de la fusión parabiotic de embriones de pez cebra depende de la puesta en escena y la orientación de los dos embriones y la concentración de metilcelulosa. Con tan solo unos simples, herramientas de bajo costo, mediante intervención quirúrgica fusionados blástulas en desarrollo se generaron embriones que se convirtió en parabiotic con circulación compartida. Estas herramientas incluyen una pipeta Pasteur modificado, u...

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo generar embriones parabióticos de pez cebra de diferentes orígenes genéticos. Cuando se combina con las capacidades de imagen sin precedentes del embrión de pez cebra, este método proporciona un medio excepcionalmente poderoso para investigar las funciones autónomas de las células frente a las no autónomas de las células para los genes candidatos de interés.

Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

El objetivo general de este método es generar embriones de pez cebra parabióticos, que pueden utilizarse para estudiar las funciones intrínsecas frente a las extrínsecas a la célula de genes candidatos de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la autonomía celular. Por ejemplo, en el sistema hematopoyético, los defectos vitales en la migración de las CTH son intrínsecos a las CTH o al microentorno del nicho. La principal ventaja de este protocolo es una capacidad mejorada para generar con éxito embriones de pez cebra parabióticos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que los embriones en desarrollo son extremadamente frágiles y se dañan fácilmente. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de sutura quirúrgica pueden ser difíciles de aprender porque requieren un alto grado de exactitud y precisión.Aquí proporcionamos instrucciones paso a paso para generar embriones de pez cebra parabióticos mediante la fusión quirúrgica de blastulas en desarrollo. Este método demuestra cómo aumentar la eficiencia de las fusiones parabióticas y mejorar la supervivencia de los embriones unidos. Después de preparar los reactivos y herramientas según el protocolo descrito, prepare dos o tres pipetas Pasteur modificadas calentando brevemente el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen.Luego, utilizando fórceps grandes, mientras aún esté caliente, doble el extremo de la pipeta aproximadamente 45 grados. Para asegurarse de que no haya bordes afilados que puedan dañar los embriones, mantenga el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen durante uno o dos segundos. Utilizando ADN plasmídico, ARNm o morfolino, inyecte microscópicamente los embriones dentro de la primera hora tras su recolección y permita que se desarrollen hasta la etapa de 256 células.A medida que los embriones se acercan al estadio de 256 células, transfiera cada fondo genético a placas recubiertas con agarosa, vasos de vidrio sin rayaduras o placas de Petri separados. Después de descorionar los embriones según el protocolo descrito en el texto, descongele la metilcelulosa previamente preparada y utilice una centrífuga de banco a velocidad máxima para formar un precipitado de cristales no disueltos, los cuales podrían dañar los embriones o romper las yemas. Mientras tanto, utilizando un marcador, marque de 12 a 15 puntos predeterminados en la parte inferior de una placa de Petri de 100 mililitros recubierta con agarosa.Luego, tras la centrifugación, utilizando la fracción superior clara de la metilcelulosa, transfiera de una a 1,5 gotas de centímetro a los puntos marcados en la placa de Petri. A continuación, prepare un alícuota de 40 mililitros de solución de Ringer con alto contenido de calcio, o solución HCR, por cada placa recubierta con agarosa recién preparada. A cada alícuota, añada los antibióticos que se enumeran aquí.Cuando esté listo para realizar las fusiones de blástula, utilice las alícuotas de HCR con antibióticos para llenar cuidadosamente cada placa que contenga las gotas de metilcelulosa, teniendo cuidado de no alterar las gotas. Sujete una pipeta de vidrio de Pasteur modificada, preparada previamente, a una pipeta manual de 10 mililitros. Luego, bajo un estereoscopio, recoja un embrión descorionado de cada línea genética.Antes de dispensar los dos embriones, utilice la pipeta de Pasteur para hacer una pequeña depresión en el centro de la gota de metilcelulosa. A continuación, deposite los dos embriones en la depresión. Ahora, utilizando una aguja de disección con una punta para carga de geles en el extremo, realice movimientos suaves de barrido sin tocar directamente los embriones para reubicarlos cuidadosamente dentro de la metilcelulosa, de modo que sus polos animales estén en contacto directo entre sí.Orientar correctamente los embriones en desarrollo determina cómo se fusionarán y se desarrollarán. Para fusiones cabeza con cabeza, asegúrese de que cada fusión esté alineada en sus polos animales. Deje reposar los embriones durante cinco minutos para que la metilcelulosa se asiente alrededor de ellos.Durante este tiempo, cargue el siguiente par en otra gota. Para realizar la cirugía, utilizando la herramienta de aguja de vidrio, haga una herida cuidadosamente en cada embrión en su punto de contacto. Luego, con un movimiento suave de costura, tire de las células del primer embrión hacia el segundo embrión y luego nuevamente de regreso.Al final del movimiento, mantenga la aguja en su lugar durante dos o tres segundos antes de retirarla muy lentamente. La precisión con la aguja de vidrio es fundamental para asegurar que los embriones se cosan adecuadamente. Se debe tener cuidado de no dañar las bolsas de vitelo, al tiempo que se mantiene una conexión suficiente para lograr la fusión exitosa.Deje reposar los embriones durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, ensamble pares adicionales de embriones. Después de la incubación, evalúe si los embriones han permanecido unidos y repita el paso de lesión si es necesario.Incube los embriones en el mismo recipiente y medio a 28,5 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, los embriones habrán salido de la metilcelulosa, que estará mayormente disuelta. Retire cualquier embrión que no se haya fusionado con éxito.Luego, decante el medio y use 25 mililitros de E3 para reemplazarlo. Para obtener imágenes de los embriones fusionados, prepare agarosa de punto de fusión baja al 0,8 %. Mientras aún esté caliente, alícuota 1 mililitro de la agarosa en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros colocados en un bloque calefactor a 37 grados Celsius.Anestesie los embriones parabióticos añadiendo un mililitro de tricaina al 4 miligramos por mililitro con pH 7,0 al medio E3 de 25 mililitros que contiene los embriones. Agite suavemente el recipiente para que los embriones se reúnan en el centro. Luego, utilizando una pipeta de transferencia plástica de punta ancha, aspire los embriones con la menor cantidad posible de líquido.A continuación, coloque la pipeta en posición vertical y mueva suavemente los embriones para que se depositen en la parte más baja de la pipeta. Luego, transfiera los embriones a un alícuota de 1 mililitro de agarosa de punto de fusión baja tocando ligeramente la punta de la pipeta sobre la superficie de la agarosa. Deseche cualquier líquido sobrante de la pipeta y utilice la pipeta para mezclar suavemente los embriones en la agarosa.Luego, con la pipeta, transfiera el agarosa y los embriones al pocillo de una placa de seis pocillos con fondo de vidrio. Bajo un estereomicroscopio, utilice una punta para carga de geles fijada al extremo de una aguja de disección para colocar los embriones cerca del cubreobjetos y en la orientación deseada para la adquisición de imágenes. Una vez que el agarosa haya solidificado y se haya añadido medio con tricaina a los pocillos, utilice un microscopio confocal láser de barrido de campo amplio invertido de epifluorescencia, o un microscopio confocal de disco giratorio, para adquirir las imágenes.Para un campo de visión de un embrión completo, utilice un objetivo de 4X. Utilice un objetivo de 20X para obtener imágenes de un tejido específico. Procese las imágenes según el protocolo descrito en el texto.Como se muestra aquí, después de orientar dos blastulas con sus polos animales enfrentados entre sí, los embriones se lesionaron cuidadosamente en el punto de contacto. Un grado mayor de lesión aumentó la probabilidad de que los embriones mantuvieran una conexión que resultara en una fusión exitosa sin defectos morfológicos adicionales ni desarrollo retrasado. Como se demuestra en esta figura, al orientar las dos blastulas con sus polos animales alineados directamente, se generaron fusiones confiables de cabeza a cabeza o de saco vitelino a saco vitelino con circulación compartida.En la mayoría de los casos, los embriones tenían dos corazones que bombeaban una circulación común compartida. Para confirmar que los embriones efectivamente compartían su circulación, se fusionaron embriones transgénicos que poseían eritrocitos positivos para GFP con embriones que tenían células endoteliales vasculares positivas para mCherry. Como se observa en esta película, a las 48 horas post-fecundación, se detectaron eritrocitos positivos para GFP circulando a través del embrión compañero Flik 1 HRAS mCherry.Finalmente, para investigar el control temporal de la expresión génica, uno de los dos embriones fue inyectado con un constructo de ADN hsp70 EGFP. Tras un breve choque térmico de 30 minutos a 37 grados Celsius, se estableció una señal clara de GFP en uno de los embriones, y en algunos casos, se observaron células positivas para GFP circulando en el embrión compañero no inyectado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco horas si se lleva a cabo adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado al unir mediante sutura las dos blástulas, y revisar nuevamente las fusiones si la cirugía no tuvo éxito en el primer intento. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales como la imagenología de células vivas para responder preguntas adicionales, como si las CSH de tipo silvestre pueden funcionar normalmente en un nicho mutante o, por el contrario, si las CSH mutantes pueden funcionar en un nicho de tipo silvestre. Esta técnica proporciona un método potente para que los investigadores en el campo de la hematología estudien la regulación del desarrollo sanguíneo en pez cebra.No olvide que la tricaina puede ser peligrosa y que siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de seguridad adecuado, al realizar este procedimiento. Después de ver este video y seguir nuestras técnicas recomendadas, esperamos que pueda generar embriones de pez cebra bióticos de mejor calidad con mayor éxito.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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