Un ensayo libre de células Utilizando

El objetivo general de este procedimiento es utilizar extractos de huevo y embrión de Xenopus para desarrollar un ensayo en el que núcleos grandes reduzcan el tamaño de núcleos más pequeños. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología celular nuclear, como por ejemplo cuáles son los mecanismos que regulan el tamaño nuclear. La principal ventaja de esta técnica es que la composición y las actividades del extracto acelular de Xenopus se pueden manipular fácilmente para evaluar los factores que afectan el tamaño nuclear.

Después de preparar los extractos de óvulos de Xenopus, espermatozoides desprovistos de membrana y núcleos ensamblados según el protocolo descrito, recolecte óvulos recién puestos sosteniendo las ranas sobre un plato de Petri de vidrio reutilizable. Fomente la puesta de óvulos aplicando presión suave en la parte baja de la espalda cerca de la cloaca. Coloque el plato inclinado aproximadamente a 45 grados para permitir que los óvulos se acumulen a lo largo del borde del plato.

Luego, retire el tampón en exceso y agregue suficiente MMR al tercio de X para cubrir apenas los huevos. Usando un pistilo bien ajustado, macere y homogenice una cuarta parte de un testículo en un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de solución salina modificada de Barth con alto contenido de sal, o MBS. A continuación, agregue el testículo macerado a los huevos y permita que ocurra la fertilización a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Después de la incubación, inunde los huevos con un tercio de X MMR. Luego, cinco a 10 minutos después, confirme la fertilización verificando la contracción del polo animal pigmentado oscuro y la rotación de los embriones con sus polos animales orientados hacia arriba. Utilizando una pipeta plástica de gran orificio, retire cuidadosamente los huevos muertos, lisados o no fertilizados y sin división, ya que inducirán rápidamente la muerte de los embriones vecinos.

Entre una y 2,5 horas después de la fertilización, desjelatinar los embriones en una solución de cisteína al dos o tres por ciento disuelta en MMR a un tercio de la concentración, ajustada a un pH de 7,9. Antes de la desjelatinación, los embriones ocupan un volumen relativamente grande. Realizar dos cambios de tampón durante tres a cuatro minutos cada uno.

Luego, lave cuidadosamente los embriones con seis a diez cambios breves de MMR al tercio de concentración para eliminar todos los rastros de cisteína. Después de la desovulación, los embriones se agrupan densamente y ocupan un volumen relativamente pequeño. A continuación, utilizando una pipeta de vidrio de gran orificio, transfiera embriones sanos y fertilizados a una placa de Petri que contenga MMR al tercio de concentración fresco.

Y a temperatura ambiente, permita que desarrollen hasta la etapa deseada. Continúe eliminando embriones muertos o lisados, indicados por la ausencia de primera división o una apariencia blanca e hinchada. Cuando los embriones alcancen la etapa 11.5 a 12, transfiéralos a MMR fresco al un tercio de concentración, suplementado con ciclohexitida 0,5 milimolar, e incube los embriones a temperatura ambiente durante una hora para detenerlos en la fase tardía de interfase.

Con una pipeta de vidrio o plástico de gran diámetro, transfiera un mínimo de 15 embriones arrestados en interfase a un tubo microcentrífugo. Añada un mililitro de tampón de lisis de huevo, o ELB, suplementado con un microlitro de la solución stock de LPC a los embriones. Invierta suavemente el tubo para lavar los embriones.

Luego, permita que los embriones caigan al fondo del tubo. Antes de eliminar el tampón, repita el lavado otras dos veces. Re suspenda los embriones en 500 microlitros de ELB, más 0,5 microlitros de solución stock de LPC, 5 microlitros de cicloheximida 19,7 milimolar y 5 microlitros de citocalasina D 35,5 milimolar para inhibir la polimerización de actina.

Centrifugar las muestras en una centrífuga de mesa a 200 veces G durante un minuto, luego eliminar el exceso de tampón y usar un pistilo para triturar completamente los embriones. Colocar las muestras trituradas en un rotor de cubeta oscilante y centrifugar a 10.000 veces G y 16 grados Celsius durante 10 minutos. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, perforar la capa lipídica desde la parte superior y, utilizando una punta de pipeta limpia, retirar la capa citoplasmática de color ámbar intermedia hacia un tubo de tamaño adecuado.

Suplemente el extracto de embrión con los siguientes reactivos. Luego, invierta suavemente el tubo para mezclar. A continuación, después de visualizar los núcleos embrionarios endógenos en el extracto preparando un extendido según el protocolo descrito en el texto, elimine los núcleos del extracto añadiendo primero un volumen igual de ELB que contenga los reactivos enumerados aquí.

Invierta suavemente el tubo para mezclar. Centrifugue la muestra en un rotor de cubeta oscilante a 17.000 ×g a 16 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, recoja el sobrenadante, teniendo cuidado de evitar cualquier resto de lípido en la parte superior, y deje intacto el sedimento de núcleos en el fondo.

Prepare una calabaza según se describe en el protocolo del texto para asegurar que la mayoría de los núcleos hayan sido eliminados. Luego, use el extracto fresco o alícuote la muestra y almacénela a menos 80 grados Celsius. Aísle los núcleos ensamblados en el extracto de huevo diluyendo de 25 a 150 microlitros de núcleos preensamblados en un mililitro de ELB en un tubo de 1,5 mililitros.

Centrifugar a 1600 × g y 4 °C durante tres minutos. Luego, retire el tampón, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado. Añada al precipitado un volumen de extracto de embrión igual al volumen original del extracto de huevo, y golpee suavemente el tubo para desagregar el precipitado y resuspender los núcleos.

Incubar a temperatura ambiente durante 90 minutos, golpeando suavemente el tubo para mezclar cada 15 a 30 minutos. Después de la incubación, golpear el tubo para resuspender los núcleos justo antes de agregar 500 microlitros de ELB con 15% de glicerol y 2,6% de paraformaldehído. Invertir inmediatamente el tubo y colocarlo en un rotador a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Prepare los tubos para centrifugación equipando tubos de vidrio redondos de 15 mililitros con insertos plásticos de fondo redondo. Añada 5 mililitros de tampón de cojín nuclear, luego coloque una cubreobjetos circular de 12 milímetros en el tubo, asegurándose de que quede plana encima del inserto plástico. Utilizando una punta de pipeta de gran orificio, superponga suavemente la solución de núcleos fijados encima del cojín nuclear.

Centrifúguelo en un rotor de cubeta oscilante a 1,000 veces G y 16 grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, use un aspirador para eliminar todo el tampón y sostenga el inserto de plástico en la parte superior del tubo. Luego, con un par de pinzas finas, retire el cubreobjetos, teniendo cuidado de observar el lado del cubreobjetos sobre el cual se centrifugaron los núcleos.

Fije el cubreobjetos en metanol frío durante cinco minutos a temperatura ambiente. Transfiera el cubreobjetos, con el lado de los núcleos hacia arriba, sobre una hoja de película de parafina plástica que forre un plato de Petri plástico grande. Luego coloque toallitas desechables húmedas a lo largo del borde del recipiente para evitar la desecación.

Con 500 microlitros de PBS NP40, rehidrate los núcleos en la laminilla durante cinco a 10 segundos y aspire. Luego, aplique cuidadosamente 75 microlitros de PBS con 3 % BSA sobre la laminilla y deje que bloquee a temperatura ambiente durante una hora o durante la noche a cuatro grados Celsius. Retire el tampón de bloqueo e incube con el anticuerpo primario diluido en PBS con 3 % BSA.

Luego lave las muestras con cinco cambios inmediatos de PBS NP40. Repita estos pasos de incubación y lavado con anticuerpos secundarios. Incube con 10 microgramos por mililitro de Hoechst diluido en PBS 3 %BSA durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego, lave cinco veces con PBS NP40 y elimine todo el exceso de tampón. Finalmente, monte la laminilla sobre un portaobjetos con cinco microlitros de medio de montaje antifade. Use esmalte de uñas transparente para sellar la laminilla e inmediatamente obtenga imágenes mediante un microscopio de epifluorescencia, o almacene a 40 grados Celsius para su posterior análisis por imagen.

Esta figura muestra el ensamblaje de núcleos en extracto de huevo. De 30 a 45 minutos después del inicio de la reacción, los núcleos espermáticos delgados con forma de S deben comenzar a engrosarse y formar masas de cromatina con forma de babosa. Una vez que ocurre el ensamblaje nuclear, la forma del núcleo debe volverse más redondeada y el volumen nuclear debe aumentar a medida que se expande el envoltorio nuclear y se importan proteínas nucleares.

Como se muestra aquí, una preparación aplastada teñida con Hoechst de una pequeña alícuota del extracto de embrión muestra muchos núcleos teñidos, lo que indica que la preparación del extracto fue exitosa. Después de la eliminación de los núcleos mediante centrifugación, en comparación con la primera preparación aplastada, deberían quedar muy pocos núcleos en el extracto, como se revela en este panel, asegurando que los núcleos endógenos no interfieran con el análisis posterior. Si aún están presentes núcleos, se requiere una segunda ronda de centrifugación.

En este ensayo de reducción nuclear, los núcleos del extracto de huevo resuspendidos en extracto de embrión en estadio tardío se vuelven con éxito más pequeños con el tiempo. Sin embargo, los núcleos incubados con extracto de embrión inactivado por calor no lo hacen. Repetir el experimento varias veces es importante para abordar la variabilidad inherente del ensayo.

Una vez dominado, todo el protocolo puede realizarse en dos días, con el ensayo de encogimiento nuclear ocupando aproximadamente cuatro horas. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar verificar la calidad de los huevos y embriones durante todo el proceso y tener mucho cuidado para evitar la capa del precipitado y la capa lipídica al recoger el extracto citoplasmático tras la centrifugación. Los resultados obtenidos siguiendo este procedimiento deben ser validados.

Por ejemplo, mi microinyección de embriones o la transfección en cultivo celular. Además, este método podría utilizarse para explorar la regulación del tamaño de otras organelas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular nuclear exploraran los mecanismos reguladores del tamaño nuclear y el papel funcional del tamaño nuclear en el desarrollo y la carcinogénesis.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar y aislar núcleos de extracto de huevo de Xenopus, generar embriones de Xenopus y extracto embrionario, realizar el ensayo de reducción nuclear y visualizar los resultados.