Name: Un ensayo libre de células Utilizando Xenopus laevis Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo libre de células utilizando extractos de Xenopus laevis para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear. Este método permite investigar la dinámica nuclear en biología celular.

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Los miembros de los laboratorios Levy y Gatlin, así como colegas del Departamento de Biología Molecular, ofrecieron consejos útiles y debates. Rebecca Heald brindó apoyo en las primeras etapas del desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por los NIH/NIGMS (R15GM106318) y la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-15-035-01-DDC).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se presenta un método novedoso para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear durante el desarrollo de X. laevis . La progresión del desarrollo se asocia con cambios dramáticos en la fisiología celular, el metabolismo, las tasas de división y la migración, así como alteraciones en el tamaño de las células y las estructuras intracelulares. Estos procesos variados son complejos y esenciales, por lo que es difícil estudiar solo uno de estos aspectos del desarrollo en un entorno in vivo ...

Los tamaños de los orgánulos celulares típicamente escala con el tamaño de la célula, y esto ha sido quizás mejor documentado para el escalado de tamaño nuclear con tamaño de celda 1-10. Esto es particularmente cierto durante la embriogénesis y la diferenciación celular, cuando reducciones dramáticas en tanto celular y tamaño nuclear se observan a menudo 11,12. Además, alterado tamaño nuclear es un parámetro clave en el diagnóstico de cáncer y el pronóstico 13-17. Mecanismos que contribuyen a la regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocidos, en parte debido a la complejidad y la naturaleza esencial de la estructura y la función nuclear. El método aquí descrito se desarrolló como un ensayo in vitro para la escala del tamaño nuclear que es susceptible a la manipulación bioquímica y la elucidación de los mecanismos de regulación del tamaño nuclear. Xenopus laevis extracto de huevo es un sistema bien establecido para recapitular y estudiar procesos celulares complejos en un in vitro </em&gt; Contexto. Estos extractos han revelado nueva información fundamental acerca de varios procesos celulares, incluyendo el montaje y la función del huso mitótico, retículo endoplasmático, y el núcleo 18-22. Una ventaja clave del sistema es que el extracto de X. extractos de huevo laevis representan un citoplasma casi sin diluir cuya composición puede ser alterado fácilmente, por ejemplo mediante la adición de proteínas o immunodepletion recombinantes. Además, uno es capaz de manipular los procesos esenciales mediante el empleo de tratamientos que de otro modo podrían ser letales en un contexto in vivo. Las modificaciones del procedimiento de extracto de huevo permiten para el aislamiento de extractos de X. laevis embriones en lugar de huevos, y estos extractos de embriones son igualmente susceptibles de manipulación bioquímica 23. Durante X. laevis desarrollo, el embrión fertilizado de una sola célula (~ 1 mm de diámetro) se somete a una serie de doce divisiones celulares rápidas (etapas 1-8) para generar varios miles de 50 μm de diámetro y células más pequeñas, llegando a una etapa de desarrollo denominan la transición midblastula (MBT) o 24-26 de la etapa 8. El MBT se caracteriza por el inicio de la transcripción cigóticos, la migración celular, divisiones celulares asíncronos, la adquisición de fases Gap, y el establecimiento de tamaños de estado estable nucleares en lugar de la expansión nuclear continua como en el embrión de pre-MBT. Desde la etapa 4 a la gastrulación (etapas 10,5-12), el volumen de los núcleos individuales se reduce en más de 10 veces 11. Aquí, el objetivo es identificar los mecanismos responsables de estas reducciones en el tamaño nuclear durante la progresión del desarrollo. El enfoque es montar primero núcleos en X. laevis huevo y el extracto de aislar esos núcleos desde el citoplasma del huevo / extracto. Estos núcleos se resuspendieron a continuación en el citoplasma de embriones en estadio de gástrula tardía. Después de un período de incubación, los núcleos de extracto de huevo se hacen más pequeños a finales de extracto de la etapa embrionaria. Pensamos que este would ser un ensayo útil para la identificación de los componentes citoplasmáticos presentes en los embriones en etapas avanzadas que contribuyen al desarrollo de escala del tamaño nuclear. Utilizando este ensayo, junto con la validación in vivo, hemos demostrado que la proteína quinasa C (PKC) contribuye a la reducción del desarrollo en el tamaño nuclear en X. laevis 23.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Burro anti-ratón Sondas moleculares IgG</td><td></td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor centrífugo</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>quimostatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de creatina disódico</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>citocalasina D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>desechable toallitas (kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cristal de vidrio (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - bisBenzimide H 33342 triclorhidrato Sigma</td><td>Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - Gonadotropina coriónica humana&nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lysolecithin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr>Ciencias <td>de la Microscopía Electrónica</td><td>de Paraformaldehído</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina + Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>PIPAS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Película de parafina plástica (parafilm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Suero de yegua embarazada Gonadotropin</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Mortle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de vidrio de fondo redondo, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario (Alexa Fluor 568 burro anti-ratón IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (medio de montaje anti-decoloración)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo libre de células utilizando<em&gt; xenopus laevis</em&gt; embrión extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Una pregunta fundamental en biología celular es cómo se regulan los tamaños de células y orgánulos. Durante mucho tiempo se ha reconocido que el tamaño del núcleo escalas generalmente con el tamaño de la celda, en particular durante la embriogénesis cuando se producen reducciones dramáticas en tanto celular y tamaños nucleares. Mecanismos de regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocida y puede ser relevante para el cáncer, donde el tamaño nuclear alterada es un parámetro clave de diagnóstico y pronóstico. En vivo para la identificación de los reguladores nucleares de tamaño se complica por la naturaleza esencial y compleja de la función nuclear. El enfoque in vitro descrito aquí para estudiar el control del tamaño nuclear se aprovecha de las reducciones normales en tamaño nuclear que se producen durante el desarrollo de Xenopus laevis. En primer lugar, los núcleos se ensamblan en X. laevis extracto de huevo. A continuación, estos núcleos se aíslan y se resuspendieron en el citoplasma de embriones de etapa tardía. Después de un 30 - 90 min período de incubación, la superficie nucleardisminuye en 20 a 60%, proporcionando un ensayo útil para identificar los componentes citoplasmáticos presentes en embriones de etapa tardía que contribuyen al desarrollo de escala tamaño nuclear. Una ventaja importante de este enfoque es la facilidad relativa con la que los extractos de huevo y embrión puede ser bioquímicamente manipulados, lo que permite la identificación de nuevas proteínas y actividades que regulan el tamaño nuclear. Como con cualquier enfoque en vitro, la validación de los resultados en un sistema in vivo es importante, y la microinyección de X. laevis embriones es particularmente apropiado para estos estudios.

Asamblea de los núcleos en extracto de huevo Los primeros pasos de este protocolo son para preparar X. extracto de huevo laevis (Protocolo 1) y núcleos de los espermatozoides demembranated (Protocolo 2). Estos reactivos se utilizan para ensamblar núcleos de novo (Protocolo 3). La figura 1 muestra algunos datos representativos. La adición de calcio conduce el extracto...

Los mecanismos de escalamiento celular e intracelular siguen siendo esquivos. El uso de extractos de embriones de Xenopus se ha vuelto cada vez más común para dilucidar los mecanismos de regulación del tamaño de los orgánulos. Este método describe la preparación de extractos embrionarios y un nuevo ensayo de escalamiento nuclear a través del cual se pueden identificar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.

Un ensayo libre de células Utilizando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar extractos de huevo y embrión de Xenopus para desarrollar un ensayo en el que núcleos grandes reduzcan el tamaño de núcleos más pequeños. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología celular nuclear, como por ejemplo cuáles son los mecanismos que regulan el tamaño nuclear. La principal ventaja de esta técnica es que la composición y las actividades del extracto acelular de Xenopus se pueden manipular fácilmente para evaluar los factores que afectan el tamaño nuclear.Después de preparar los extractos de óvulos de Xenopus, espermatozoides desprovistos de membrana y núcleos ensamblados según el protocolo descrito, recolecte óvulos recién puestos sosteniendo las ranas sobre un plato de Petri de vidrio reutilizable. Fomente la puesta de óvulos aplicando presión suave en la parte baja de la espalda cerca de la cloaca. Coloque el plato inclinado aproximadamente a 45 grados para permitir que los óvulos se acumulen a lo largo del borde del plato.Luego, retire el tampón en exceso y agregue suficiente MMR al tercio de X para cubrir apenas los huevos. Usando un pistilo bien ajustado, macere y homogenice una cuarta p

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Biología

Ensamblaje membrana nuclear es un paso esencial en el ciclo de división celular, proceso que puede ser replicado en el tubo de ensayo por la combinación de la cromatina espermática de Xenopus, el citosol y la membrana fracciones ligeras. Núcleos completos están formados, incluyendo las membranas nucleares con los complejos de los poros, y estos núcleos son capaces de reconstituir el proceso normal nuclear.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Un protocolo para la preparación de los sólidos, los pequeños extractos nucleares HeLa se describe. Este protocolo es muy valioso para los ensayos que requieren el uso de pequeñas poblaciones de células, como las células tratadas con drogas o RNAi. El método debe ser aplicable a una amplia variedad de ensayos de expresión de genes y otros tipos de células, incluyendo células del paciente.

Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

Los mecanismos moleculares de la descondensación de la cromatina mitótica altamente compactada están mal definidos. Presentamos un ensayo libre de células basado en clústeres de cromatina mitótica aislados de células HeLa y extracto de huevo de Xenopus laevis que reconstituye fielmente el proceso de descondensación in vitro.

Una célula de ensayo libre para el Estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis

Describimos los pasos que permiten muestreo rápido in situ de una pequeña porción de una célula individual de alta precisión y mínima invasión, mediante micro-muestras basadas en el tubo capilar, para facilitar la caracterización química de una instantánea de la actividad metabólica en embriones vivos utilizando una plataforma de espectrometría de masas y electroforesis capilar célula hecha a la medida.

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Describimos un método de constricción física para producir mini embriones a partir de embriones de Xenopus laevis de 1 célula.

Manipulación física para generar embriones de Xenopus Mini

Describimos un método para aislar células individuales de embriones tempranos de Xenopus laevis y clasificarlas por tamaño celular.

Aislamiento de células individuales de embriones tempranos de Xenopus y clasificación por tamaño

Aprende a desarrollar un ensayo libre de células utilizando extractos de Xenopus laevis para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear. Este método permite investigar la dinámica nuclear en biología celular.

Un ensayo libre de células Utilizando Xenopus laevis Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear (Video) | JoVE Journal

Un ensayo libre de células Utilizando

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