El nervio peroneo Método de lesiones: un ensayo fiable para identificar y Factores de prueba de que la reparación neuromusculares uniones

Hemos desarrollado un método de lesión nerviosa para examinar de forma fiable la reinervación muscular y, por tanto, la regeneración de las uniones neuromusculares en ratones. Esta técnica consiste en lesionar el nervio fibular común mediante una cirugía sencilla y altamente reproducible. La reinervación muscular se evaluó mediante el montaje completo del músculo extensor largo de los dedos.

El objetivo general de este método de lesión de nervios periféricos es examinar de forma fiable las uniones neuromusculares en regeneración en ratones. Este método nos ayudará a identificar los cambios moleculares, celulares y funcionales asociados con la regeneración de las uniones neuromusculares. La principal ventaja de este procedimiento es que la tasa de regeneración de la unión neuromuscular se puede comparar de forma fiable entre grupos experimentales, en gran medida en ausencia de cambios miogénicos.

William Dalkin, un estudiante de medicina de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Antes de comenzar el procedimiento, use etanol al 80% para limpiar el sitio quirúrgico, el tablero y los instrumentos, seguido de la desinfección con povidona yodada. A continuación, coloque el ratón sobre la tabla quirúrgica y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie.

Alinee las extremidades dentro de las sujeciones con la extremidad posterior objetivo en una posición anatómicamente natural y las articulaciones de la rodilla ligeramente extendidas sin rotación interna o externa. Luego, transfiera al animal bajo un microscopio quirúrgico y ajuste la tabla hasta que la articulación ósea de la rodilla y la cresta entre el tibial anterior y los músculos gastrocnemio sean visibles a través del objetivo. Con un bisturí y fórceps, haga una incisión de aproximadamente tres centímetros a través de la piel, perpendicular al curso subyacente del nervio fibular común.

Continúe la incisión a través de la fascia superficial exponiendo los músculos bíceps femoral y vasto lateral, seguida de una incisión de uno a dos centímetros a través de la fascia profunda de conexión para separar los músculos. A continuación, utilice retractores mecánicos para retraer el músculo bíceps femoral caudalmente para revelar el nervio peroné común. Traza el nervio proximalmente hasta encontrar su intersección con el tendón de la cabeza lateral del músculo gastrocnemio.

Luego, use una pinza fina para agarrar el nervio alineando las puntas paralelas al borde lateral del tendón gastrocnemio y aplique una presión constante y concentrada durante cinco segundos para aplastar el nervio fibular común. Sosteniendo las pinzas perpendiculares a la fibra, agarre el tejido con el área justo detrás de la punta de las pinzas y aplique una presión firme pero suave para un aplastamiento limpio y lineal del nervio a lo largo del borde del tendón. Inspeccione visualmente el nervio a través del microscopio quirúrgico para confirmar un aplastamiento completo del tejido.

El nervio aparecerá translúcido en el sitio de la lesión. Si se utilizan ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos, la fluorescencia desaparecerá del sitio de la lesión. Si el nervio se ha dañado lo suficiente, retire los retractores y realinee los músculos en sus posiciones anatómicas.

Luego, use suturas de seda 6-0 para cerrar el sitio de la incisión con una a tres suturas interrumpidas simples y coloque el ratón en una almohadilla térmica en una jaula limpia con monitoreo hasta que se recupere por completo. Comprimir el nervio durante cinco segundos con una pinza fina da como resultado la desaparición de YFP del sitio de la lesión. El epineuro permanece contiguo, sirviendo como conducto para la regeneración precisa de los axones a sus objetivos originales.

En ratones hembra de 70 días de edad, la lesión nerviosa es suficiente para causar la degeneración de todos los segmentos axonales distales del soma neuronal, a los cuatro días después del aplastamiento. A los siete días después del aplastamiento, las terminaciones nerviosas vuelven a ocupar activamente los sitios postsinápticos vacíos. En el día 12, las terminaciones nerviosas continúan diferenciándose en sitios presinápticos y las uniones neuromusculares están completamente reinervadas.

Hay poca variabilidad entre los ratones denervados durante el mismo período de tiempo, lo que demuestra que el aplastamiento del nervio peroné se puede utilizar como un ensayo para comparar la reinervación de los músculos entre animales de la misma edad y sexo. Como era de esperar, se producen una serie de cambios en los axones motores alfa a medida que reinervan las fibras musculares. Los conos de crecimiento axonal se expanden y ramifican a medida que entran en contacto con los sitios postsinápticos, creciendo sobre regiones específicas de la postsinapsis, y culminando en la yuxtaposición casi completa de las terminaciones axonales con los sitios postsinápticos.

Como se demostró mediante PCR cuantitativa, los genes asociados a la unión neuromuscular aumentan después de la denervación y disminuyen a medida que las uniones neuromusculares se reinervan. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 15 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo, visualizar todas las estructuras y verificar dos veces que se haya obtenido un aplastamiento completo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la QPCR para responder preguntas adicionales sobre qué genes se están regulando al alza o a la baja. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la neurobiología exploraran las regeneraciones sinápticas en ratones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un aplastamiento del nervio peroné para examinar las tasas de reinervación de la unión neuromuscular en ratones.