Name: Protocolo experimental para la producción de biodiesel con Aislamiento de alquenonas como Coproductos de Comercial Isochrysis La biomasa de algas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a producir biodiesel a partir de biomasa de Isochrysis con aislamiento simultáneo de alquenonas como coproductos valiosos. Este método sostenible utiliza extracción Soxhlet y transesterificación para obtener rendimientos superiores al 90%.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (CHE-1151492), el Noroeste avanzada Renovables Alianza (beca de J. Wilson-Peltier), ya través de una donación privada de los amigos de WHOI. Damos las gracias a Kevin R. Steidley y Kim Ascherl (USDA / ARS / NCAUR) por su excelente asistencia técnica.

1. biomasa de microalgas y Preparación Nota: La marina microalgas Isochrysis sp. &quot;T-iso&quot; utilizado en el presente estudio se puede comprar (ver Lista de Materiales). Cantidades de varios kilogramos de Isochrysis se pueden comprar como una pasta húmeda congelada (Iso -paste) que contiene aproximadamente 80% de agua y 20% de la biomasa, y es de color verde oscuro casi negro / color con un olor penetrante olor del mar. Isochrysis también puede se puede comprar como una seca (95% de materia seca) polvo de color amarillo-marrón (Iso -Polvo) con un olor similar. <ol><li> Con el fin de secar la pasta Isochrysis, abrir un paquete de 1 kg cortando un 1 - 2 pulgadas agujero en la esquina de los envases de plástico con unas tijeras. </li><li> Apriete aproximadamente 300 g de esta pasta a través de Isochrysis el agujero en un 150 mm x 75 mm cristalizar plato para crear una capa delgada (~ 20 mm). </li><li> Agregar la pasta se seque al aire a temperatura ambiente hasta que se vuelve seca y escamosa (por lo general, 48 -96 h). Nota: Los tiempos de secado reales pueden variar y dependen de la temperatura. Sin embargo, no hay diferencia se observó en los rendimientos o la calidad del producto con el tiempo de secado aún más largas (hasta dos semanas). El proceso de secado también se puede hacer más uniforme y / o acelerado por la colocación de la placa de cristalización en una placa caliente (30-40 ° C). </li><li> Raspar la biomasa seca de la placa de cristalización con una espátula y colecte en un dedal de extracción de celulosa (Longitud: 123 mm, 43 mm de diámetro). Anotar el peso de la biomasa seca Isochrysis. </li></ol> 2. Soxhlet Extracción de biomasa seca Isochrysis <ol><li> Cargar un Isochrysis -Con la extracción de celulosa dedal (típicamente 50 - 60 g de biomasa seca) en un aparato de extracción Soxhlet. </li><li> Llenar el matraz de Soxhlet con hexano (400 ml), encienda la fuente de agua del condensador y el calor, y permitir que el Soxhlet para desplazarse por 24 - 48 h (hasta que el color del disolvente ha pasado de verde oscuro a unaamarillo tenue). </li><li> Apagar el fuego y dejar que el aparato se enfríe a temperatura ambiente, a continuación, desconecte el matraz del extractor Soxhlet. </li><li> Quitar los hexanos usando un evaporador rotatorio y registrar el peso del material de hexanos-extraíbles ( &quot;aceite de algas hexano&quot; (h-AO)). </li></ol> 3. La saponificación del aceite de algas y separación de los ácidos grasos y lípidos neutros <ol><li> Se vuelve a disolver el h-AO en el mismo matraz de fondo redondo de la Etapa 2.4 anterior con metanol: diclorometano (2: 1, volumen = 10 x masa de aceite de alga). </li><li> Añadir una barra de agitación y adjuntar un condensador de reflujo (la bobina: 500 mm de longitud). </li><li> Añadir H 2 O (volumen = 2,67 x masa de aceite de algas) y KOH (50% w / w aceite de algas) y calentar el contenido con agitación a 60 ° C durante 3 hr. </li><li> Después de enfriar a temperatura ambiente, eliminar los disolventes orgánicos (metanol y diclorometano) en un evaporador rotatorio. </li><li> Transfiera la mezcla acuosa restante vertiendo en un 1embudo de separación -L. Añadir hexanos (equivalente en volumen a la solución acuosa), agitar el embudo de separación, y permitir que las capas se separen. </li><li> Escurrir la capa acuosa inferior en un matraz Erlenmeyer, y se vierte fuera de la fase orgánica superior en un Erlenmeyer separado. </li><li> Repetir los pasos 3.5 y 3.6 hasta que la capa orgánica es incoloro (típicamente 1-2 más veces). </li><li> Se concentran los extractos orgánicos combinados en un evaporador rotatorio para aislar los lípidos neutros como un sólido de color verdoso (pf ≈ 60 -. 70 ° C). </li><li> Se acidifica la fase acuosa con HCl (6 M, hasta pH ~ 2 como se indica por el papel de pH). </li><li> Extraer los ácidos grasos libres (AGL) de la fase acuosa se acidificó con hexanos (Equivolume a la fase acuosa), utilizando un embudo de separación 1 L como se describe en los pasos 3.5 y 3.6. </li><li> Quitar los hexanos en un evaporador rotatorio para obtener los ácidos grasos libres como un residuo de color verde oscuro casi negro oleoso (líquido a temperaturas&gt; 30 ° C). </li></ol> 4.La esterificación catalizada por ácido de los ácidos grasos libres y Producción de Biodiesel de un verde <ol><li> La transferencia de los ácidos grasos libres utilizando metanol: cloroformo (1: 1, 6 x volumen de aceite de algas) para disolver primero los ácidos grasos libres y después vertiendo en un matraz de reacción de alta presión de pared gruesa equipado con una barra de agitación. </li><li> Añadir H 2 SO 4 concentrado (20% w / w aceite de alga), sellar el frasco, y se calienta la mezcla a 90 ° C mientras se agita durante 1 hr. </li><li> Después de enfriar a temperatura ambiente, transferir la mezcla mediante el vertido en un embudo separador. </li><li> Añadir H2O (2 x volumen de aceite de algas), agite el embudo de separación, y dejar que las fases se separen. </li><li> Drenar la capa inferior en un matraz de fondo redondo previamente pesado y se concentra en un evaporador rotatorio. Se registra la masa del biodiesel resultante. </li><li> Analizar el perfil de ácidos grasos por cromatografía de gases con detector de ionización de llama (GC-FID) 28 (cromatógrafo de gases equipado con un conector DB-88 [(88% cyanopropyl) methylarylpolysiloxane] columna (30 mx 0,25 mm de espesor DI x 0,20 micras película). Nota: Los ésteres metílicos de ácidos grasos comunes son verificados por la retención de la comparación con muestras auténticas vez obtenidos comercialmente. Además, la espectrometría de cromatografía de masa de gas (GC-MS; cromatógrafo de gases acoplado a un detector selectivo de masas) se realiza en condiciones idénticas de programa de temperatura y la columna para analizar componentes tales como C18: 4 para los que no hay patrones auténticos están disponibles con los resultados aplican a GC cuantificación. </li></ol> 5. El biodiesel decoloración <ol><li> Calentar el biodiésel de color verde oscuro a 60 ° C en un matraz de fondo redondo equipado con una barra agitadora. </li><li> Añadir K 10 (MK10) polvo de montmorillonita (10-20% w / w de la biodiesel) y se agita durante 1 hr. </li><li> Retire la parte inferior redonda del fuego y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. </li><li> Preparar un aparato de filtración que consiste en un matraz de fondo redondo y la diversión de filtronel contiene un papel de filtro de celulosa (Ash 0,007%). </li><li> Verter el biodiesel enfriado se decolora a través del embudo de filtración utilizando una cantidad mínima de hexanos para enjuagar el matraz de fondo redondo. </li><li> Desconecte el embudo de filtración desde el matraz de fondo redondo (esto ahora contiene una solución de hexanos del biodiesel se decolora) y retirar los hexanos con un evaporador rotatorio para dar un / biodiesel rojo anaranjado. </li><li> Conservar las muestras a 4 ° C durante este tiempo (~ 10% w / w) se producirá cierta sedimentación de material insoluble. </li><li> Eliminar el material insoluble por decantación o filtración como se describe en el paso 5.4 y 5.5 para producir un biodiesel clara y homogénea para el análisis. </li></ol> 6. Aislamiento y purificación de alquenonas de los lípidos neutros <ol><li> Disolver los lípidos neutros (del Paso 3.8) en una cantidad mínima de diclorometano (aproximadamente 50 ml por 10 g de lípidos neutros) y añadir la solución con una pipeta a la parte superior de una columna de cromatografía (O.D 60 mm, ID 55 mm, longitud de 18 &quot;) que contiene gel de sílice (malla 230-400, 100 g). </li><li> Eluir la solución a través de la sílice con la presión (~ 5 psi) usando diclorometano (aproximadamente 150 ml) como disolvente y se recoge el eluyente en un matraz de 250 ml de fondo redondo. </li><li> Eliminar el diclorometano con un evaporador rotatorio para dar un sólido de color naranja. </li><li> Se recristaliza el sólido utilizando hexanos mediante la adición de aproximadamente 100 ml de hexanos en ebullición, seguido por cantidades adicionales incrementales de hexanos en ebullición hasta que la solución es homogénea (volumen total ~ 150 ml). A continuación, enfriar lentamente la solución a temperatura ambiente para promover la cristalización. </li><li> Recoge los alquenonas cristalizado utilizando un aparato de filtración como se describe en el paso 5.4 utilizando una pequeña cantidad de (0 ° C) de hexanos fríos para enjuagar el matraz. </li></ol>

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<li>Valenzuela-Espinoza, E., Millán-Núñez, R., Protein Núñez-Cebrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein%2C+carbohydrate%2C+lipid+and+chlorophyll+a+content+in+Isochrysis+aff.+galbana+%28clone+T-Iso%29+cultured+with+a+low+cost+alternative+to+the+f%2F2+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Eng%22%5BJournal%5D)">Protein, carbohydrate, lipid and chlorophyll a content in Isochrysis aff. galbana (clone T-Iso) cultured with a low cost alternative to the f/2 medium.</a> Aquacult. Eng. 25, 207-216 (2002).</li>
<li>Kulkarni, M. G., Dalai, A. K., Bakshi, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+green+seed+canola+oil+for+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Utilization of green seed canola oil for biodiesel production.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 81, 1886-1893 (2006).</li>
</ol>

La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de EE. UU. El USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.

Isochrysis es uno de sólo un selecto número de especies de algas cultivadas, cosechadas industrialmente como un componente principal de alimentación de mariscos, y por lo tanto representativo de la actividad necesaria para la producción de biocombustibles. La disponibilidad de las algas y utilizado métodos estándar empleados en este estudio, hacen que el protocolo presentado ampliamente accesible a otros grupos de más investigaciones. Los pasos críticos incluyen aire de secado de las algas (en oposición a la liofilización de 33), extracciones de disolventes, saponificación y esterificación. A través de estas operaciones se puede examinar el rendimiento de lípidos y otros coproductos procedentes de los distintos Isochrysis disponibles 30. Se prevé que estos pueden diferir como resultado de diferentes cepas y métodos de cultivo, 31 y también puede ser afectada por la naturaleza del producto y cualquier procesamiento adicional (por ejemplo, secado o congelación) utilizado por el proveedor. Como se demuestra aquí, el protocolo de desarrollared se puede aplicar con éxito a los diferentes tipos de productos de Isochrysis, que van desde una pasta húmeda a un polvo molido seco. Los rendimientos de biodiesel eran sin embargo inferior de la biomasa en polvo (7% w / w vs. biomasa seca 12% w / w de la pasta seca), que corresponde con menores cantidades de aceite de algas (h-AO) extraído. Esto puede sugerir que un protocolo de extracción alternativo 32 que no sea un aparato Soxhlet puede ser más adecuado para los productos de Isochrysis secos en polvo. El polvo Isochrysis utilizada en este estudio se anuncia como que contiene 23-25% de lípidos, que similar a lo que hemos obtenido experimentalmente a partir de pasta de Isochrysis seca. 33,34,26 A pesar de los diferentes colores de la biomasa seca de partida, el Iso-pasta-Hao y -Polvo Iso-Hao fueron esencialmente indistinguibles, ambos de color verde oscuro / negro cerca de los sólidos con puntos de fusión de aproximadamente 50 ° C. Curiosamente, la proporción de ácidos grasos libres a labio neutralids dentro de los dos extractos de hexano era diferente. Después de saponificación y separación de los lípidos neutros, se obtuvo un 60% (w / w) AGL y 40% (w / w) lípidos neutros desde el Iso--paste Hao. El Iso- polvo-HAO produce, en promedio, 46% (w / w) AGL y 54% (w / w) lípidos neutros. Los resultados sugieren que o bien la biomasa en polvo de partida pueden contener mayores cantidades de lípidos neutros relativos a derivados de FA de la pasta de Isochrysis, o que la extracción Soxhlet de polvo Isochrysis es algo selectivo para lípidos neutros. No sólo los rendimientos de los productos obtenidos a partir de los dos Isochrysis comercial biomasas diferente, sino también los perfiles de ácidos grasos de la biodiesel resultante. Esto es importante, ya que las propiedades de los combustibles de biodiesel dependen directamente de la naturaleza y el contenido de FAME individuales. 35 Para ser comercializado, todo el biodiésel debe ser conforme a las normas descritas en la norma ASTM documentosD6751 o EN 14214 en los EE.UU. o Europa, respectivamente. Las especificaciones incluyen rangos de lubricidad y viscosidad cinemática, y valores mínimos para el número de cetano y la estabilidad oxidativa. Otras recomendaciones importantes están relacionados con las propiedades de flujo en frío bajo la forma de un punto de enturbiamiento (CP) o el punto de obstrucción de filtros en frío (CFPP). Hemos informado anteriormente de los resultados de las pruebas de combustible integral de biodiesel preparado a partir de pasta de Iso. 36 Dado que el perfil FAME del biodiesel producido a partir de la -Polvo Iso en este estudio es similar a los ensayados anteriormente, podemos predecir ciertas propiedades del combustible a ser similares tanto para los combustibles de biodiesel. Por ejemplo, la cuenta de los ácidos grasos poliinsaturados (PuFAMEs, más de dos dobles enlaces) por aproximadamente 40% de ambas mezclas de FAME (35,2% y 39,9%, Tabla 2). Esto dará lugar a una pobre estabilidad oxidativa y de flujo frío favorable. 35 Hay, sin embargo, pequeñas diferencias en los perfiles de fama de los dos biodiesel combustibles. Biodiesel producido a partir del polvo Isochrysis contenía cantidades más altas de 14: 0 (19,4 mg / g vs. 16,4 mg / g), 18: 3 (13,5 mg / g vs. 8,5 mg / g), y 22: 6 (11,0 mg / g vs. 6,9 mg / g) FAMEs, sin embargo, cantidades menores de 18: 4 (10,4 mg / g vs. 19,8 mg / g). La magnitud del impacto de estas diferencias en las distintas propiedades de los combustibles contenidos en las normas ASTM queda por investigar. El biodiesel inicial obtenida a partir de tanto comerciales Isochrysis algas fueron igualmente de color verde oscuro que se puede explicar por la presencia de clorofilas. 36 clorofila y sus derivados se han reportado para tener un efecto negativo sobre la estabilidad de los aceites vegetales, y sus combustibles biodiesel correspondientes. 36,29 Basado en el método de Issariyakul y Dalai para decolorar el aceite de canola Greenseed en relación con la producción de biodiesel, 29 de agitar nuestra biodiesel verde sobre 10% (w / w) MK10 a 60 ° C durante 1 hora dio como resultado un dramáticoreducción en el contenido de pigmento mediante inspección visual (ref. la figura 2). recuperaciones de masa del proceso de decoloración fueron en promedio de 90%. Los rendimientos de alquenonas purificadas de Iso- pasta-Hao y lípidos neutros Aísle polvo-HAO fueron comparables al 40% y 46% w / w, respectivamente (Tabla 1). Dado que los lípidos neutros representan una mayor proporción de material contenido en el polvo de Iso-Hao (54% w / w vs. 40% w / w), alquenona rendimiento a partir del polvo de Iso-Hao supera el rendimiento alquenona pasta-Hao Iso en aproximadamente un 10% (25% w / w vs. 16% w / w). Sin embargo, teniendo en cuenta que los rendimientos de la misma Iso-Hao en polvo fueron inferiores a Iso-pasta-Hao (15% frente a 20% w / w), los rendimientos globales de alquenonas de ambas biomasas Isochrysis secos son más similares (0,2 x 0,4 x 0,4 = 3,2% w / w de la pasta de Isochrysis seca y 0,15 x 0,54 x 0,46 = 3,7% a partir de polvo Isochrysis).

Recientemente ha habido un gran resurgimiento del interés en los biocombustibles a partir de algas, en particular para la producción de combustibles líquidos como el biodiesel 1 y otros aceites derivados de la biomasa. 2 Los beneficios propuestos incluyen la evitación de ciertos alimentos vs. combustible controversias 3 y productividades más altas según los informes y las capacidades de mitigación de CO2 que los cultivos agrícolas tradicionales. 4 Esto sigue a la de casi 20 años del Departamento del Programa de especies acuáticas de Energía (ASP) Estados Unidos comenzó en 1978 con el propósito de investigar el transporte de combustible a partir de algas. Como se indica en el informe de Sheehan, 5 el programa terminó en 1996, principalmente debido a los costos proyectados no eran competitivos con el petróleo crudo en ese momento ($ 18,46 por barril (159 L)). Si bien el costo del petróleo ha aumentado dramáticamente desde entonces ($ 87,39 por barril en 2014) 6, que está conectado con el renacimiento en la investigación de biocombustibles de algas, algunas hAve argumentó que, no obstante, los biocombustibles de algas van a resultar demasiado costoso. 7 Como una estrategia para compensar los costos de producción de biocombustibles, la noción de co-productos de valor añadido ha surgido entre ambos críticos 7,8 y 9,10 proponentes y características como una de las principales razones de la búsqueda de biocombustibles de algas en los Estados Unidos Departamento de Energía (DOE) &quot;Nacional de algas biocombustibles Plan tecnológico». 11 Aquí se describe un método para la coproducción de dos corrientes de combustible separado a partir de microalgas comercial Isochrysis. Nos hemos centrado en Isochrysis, en parte, debido a que ya se produce industrialmente, se recogieron para los propósitos de la maricultura, y también porque Isochrysis es uno de sólo unas pocas especies de algas que, además de los lípidos tradicionales (es decir, ácidos grasos) biosintetizar una clase única de compuestos conocidos como alquenonas de cadena larga poliinsaturados. 12 estructuras alquenona se caracterizan por muy l<html> cadenas de hidrocarburos ong (36-40 carbonos), de dos a cuatro de metileno no interrumpidos bonos -double trans, y una cetona de metilo o etilo (Figura 1). Alquenona insaturación es sensible a la temperatura de crecimiento de algas, 13,14 de tal manera que la proporción de la alquenona de metilo C37 diinsaturado (el llamado &quot;índice de insaturación&quot;) se puede utilizar como sustituto de la últimos temperaturas superficiales del mar 15 -. 20 alquenonas son se cree que residen en los cuerpos de lípidos citoplasmáticos y pueden ser más abundantes que los triglicéridos (TAGs) 21,22. en nitrógeno o limitación de fósforo, hasta un 10-20% de carbono celular en la fase estacionaria se acumula como alquenonas 23,24. de una punto de vista evolutivo, alquenonas puede haber sido favorecida sobre TAGs porque su geometría doble enlace trans proporciona una forma más estable de almacenamiento de energía. 21 189fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Estructuras de alquenonas de cadena larga poliinsaturados alquenona común de metilo. 37: 3 aislada de Isochrysis ejemplificando longitudes de cadena larga de hidrocarburos (36 - 40 carbonos), trans no metileno dobles enlaces interrumpidos, y que termina en una cetona de metilo o etilo. La nomenclatura es similar a los ácidos grasos donde #: # se refiere al número de carbonos:. Número de dobles enlaces <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig1large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Se argumenta que alquenonas representan una materia prima de carbono renovable prometedor de un alga común con una historia de cultivo industrial. 25 Biodiesel producido directamente a partir del extracto de lípidos total de Isochrysis contiene una cantidad significativa (10-15% w / w) de alquenonas y la contaminación por estos compuestos de alto punto de fusión da lugar a malas propiedades de flujo en frío del combustible. Sin embargo, el uso de tque las técnicas de saponificación / extracción descritos aquí, alquenonas se puede retirar y se recuperó lo que mejora la calidad del biodiesel mientras que produce una corriente de producto secundario. Recientemente hemos demostrado la conversión de alquenonas a un combustible líquido por metátesis cruzada con 2-buteno (butenolysis). 26 La reacción butenolysis emplea un rutenio comercial metátesis-iniciador, se produce rápidamente a baja temperatura, y limpiamente ofrece una mezcla predecible de combustible de avión hidrocarburos en el rango. Esta reacción se lleva a cabo en paralelo con la síntesis de biodiesel a partir de ácidos grasos, que representa los primeros pasos hacia un enfoque de &quot;bio-refinería&quot; 27 para la producción de biocombustibles comercialmente viable Isochrysis.

<table><tbody><tr><td>Isochrysis</td><td>Reed</td><td>Mariculture Iso, crudo, sin procesar, 20%dw</td><td>Pasta de cultivo vivo, 20% p/p biomasa</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Necton, S.A</td><td>AADISS004</td><td>PhytoBloom Prof Isochrysis (liofilizado)</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Chemical</td><td>H291-4</td><td>ACS Certified</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-4</td><td>Grado de HPLC</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Chemical</td><td>D37-4</td> Aparato Soxhlet <td>certificado/estabilizado</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>Aldrich</td><td>64826</td><td></td></tr><tr><td>Dedal de extracción</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64842</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; embudo chner</td><td>Chemglass</td><td>CG-1406-25</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de reacción a alta presión</td><td>Chemglass</td><td>CG-1880-12</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman</td><td>GE Life Sciences</td><td>1442-042</td><td>Grado 42, Ceniza 0,007%, círculo, 42,5 mm</td></tr><tr><td>Biodiésel (B100)</td><td>Bellingham Shell</td><td></td><td>El biodiésel (B100) en <fuerte>Figura 3</fuerte> se compró en una estación de servicio local: Bellingham Shell, Bellingham, WA 98226</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Aquacave</td><td></td><td>Además de Reed y Necton, Isochrysis también se puede comprar en Aquacave (Gurnee, IL) en: www.aquacave.com (consultado el 30 de septiembre de 2015).</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Isochrysis también se puede comprar en Brine Shrimp Direct (Ogden, UT) en: www.brineshrimpdirect.com (consultado el 30 de septiembre de 2015).</td></tr></tbody></table>

protocolo experimental para la producción de biodiesel con aislamiento de alquenonas como coproductos de comercial<em&gt; isochrysis</em&gt; la biomasa de algas

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

La necesidad de sustituir a los combustibles derivados del petróleo con las alternativas de fuentes renovables y sostenibles con el medio ambiente es más de creciente importancia. biocombustibles derivados de la biomasa han ganado considerable atención en este sentido, sin embargo biocombustibles de primera generación de cultivos comestibles, como el etanol de maíz o biodiesel de soja han caído en desgracia en general. Por tanto, existe gran interés en el desarrollo de métodos para la producción de combustibles líquidos a partir de fuentes no comestibles domésticos y superior. Aquí se describe un procedimiento detallado para la producción de un biodiesel purificado a partir de la Isochrysis microalgas marinas. Además, un conjunto único de los lípidos conocidos como alquenonas de cadena larga poliinsaturados están aislados en paralelo como co-productos potencialmente valiosos para compensar el coste de la producción de biodiesel. Cantidades de varios kilogramos de Isochrysis se adquieren a partir de dos fuentes comerciales, uno en forma de pasta húmeda (agua 80%) que se seca antes de la primera transformación, y los otella un polvo molido seco (95% de materia seca). Los lípidos se extrajeron con hexanos en un aparato de Soxhlet para producir un aceite de algas ( &quot;aceite de algas hexano&quot;) que contiene tanto las grasas tradicionales (es decir, triglicéridos, 46-60% w / w) y alquenonas (16-25% w / w). La saponificación de los triglicéridos en el aceite de algas permite la separación de los ácidos grasos libres (AGL) resultantes de lípidos neutros que contiene alquenona. Ácidos grasos libres se convierten entonces en biodiesel (es decir, ésteres de metilo de ácidos grasos, FAMEs) mediante la esterificación catalizada por ácido, mientras que alquenonas se aíslan y purifican a partir de los lípidos neutros por cristalización. Se demuestra que el biodiésel de ambos biomasas comerciales Isochrysis tienen perfiles FAME similares pero no idénticos, que se caracteriza por el contenido de ácidos grasos poliinsaturados elevadas (aproximadamente 40% w / w). Los rendimientos de biodiésel fueron consistentemente más altas cuando se parte de la pasta húmeda Isochrysis (12% w / w vs. 7% w / w), que se puede remontar a bajar cantidades de algas oi hexanol obtenido a partir del producto Isochrysis en polvo.

<html> Antes del procesamiento, se secó primero la pasta de Isochrysis (pasta de Iso). Esto se realiza convenientemente en mayor escala mediante la adición de la -paste Iso a un gran plato de cristalización y permitiendo que el material se seque al aire a temperatura ambiente. Durante el secado, algunas formas de agua combinados (generalmente de color rojizo) que se puede quitar por decantación o pipeteo para acelerar el proceso de secado. Después de aproximadamente un 48 - 96 horas, el Isochrysis ahora seca podría ser raspada fuera del cristalizador y obtuvo en forma de un material en forma de escamas negro / verde con un olor parecido a algas (Figura 2). Los rendimientos de biomasa seca fueron generalmente 20% w / w de la pasta como se anuncia. Por el contrario, el producto Isochrysis en polvo (polvo Iso-) fue un color amarillo-marrón, finamente molido, en polvo seco (95% seco) que se utilizó directamente sin posterior procesamiento (Figura 2). gura 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54189 / 54189fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Comparación de la pasta de Isochrysis. Isochrysis comercial (80% de humedad) se extiende a lo largo de la parte inferior de un plato de cristalización y se dejó secar al aire a temperatura ambiente durante 48 a 96 horas antes del procesamiento. El Isochrysis seco resultante se obtiene como un material en forma de escamas de color oscuro (derecha) que es diferente en apariencia que el polvo seco comercial Isochrysis (izquierda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La extracción de cualquiera de los Iso polvo -paste o Iso-seca mediante Soxhlet con hexano dio, después de la eliminación de los hexanos, aceites de algas (h-AO) que eran similares en apariencia como de color verde oscuro / sólidos casi negro (pf. 50 ~ -60 ° C). Los rendimientos de h-AO cuando se parte de la pasta ( &quot;Iso-pasta-Hao&quot;) Eran por lo general 20% w / w de la biomasa seca Isochrysis, consistente con nuestros resultados anteriores, mientras que los rendimientos de 26 h-AO por extracción Soxhlet de la Isochrysis polvo comercial (&quot; Iso-Hao polvo &quot;) fueron 15% w / w (Tabla 1). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Producto (g) </td><td> -paste iso </td><td> Iso -Polvo-1 </td><td> Iso -Polvo-2 </td></tr><tr><td> La biomasa seca </td><td> 30 </td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Aceite de algas hexano </td><td> 5.86 </td><td> 2.87 </td><td> 3.11 </td></tr><tr><td> Los AGL </td><td> 3.52 </td><td> 1.34 </td><td> 1.38 </td></tr><tr><td> Los lípidos neutros </td><td> 2.34 </td><td> 1.38 </td><td> 1.61 </td></tr><tr><td> alquenonas </td><td> 0.94 </td><td> 0.63 </td><td> 0.74 </td></tr><tr><td colspan="4"> Notas: Iso-polvo-1 e Iso-polvo-2 representan los resultados de dos muestras de Isochrysis polvo que se procesaron en paralelo. Para otros informes con rendimientos de estos productos de pasta de Iso-véanse las referencias 26, 32 y 33. </td></tr></tbody></table> Los rendimientos del producto Tabla 1 a partir de biomasa. Isochrysis comercial. Acilgliceroles de la h-AO se convirtieron a las sales de carboxilato soluble en agua correspondientes (es decir, jabones) tras la adición de KOH acuoso en metanol / CH 2 Cl 2. Los lípidos neutros incluyendo alquenonas se extrajeron después de esta mezcla acuosa mediante la separación selectiva con hexanos. Después de la eliminación de los lípidos neutros, reacidificación de los jabones a continuación, produce los ácidos grasos libres (AGL) correspondientes que podrían ser extraídos de manera similar desde el aqfase ueous con hexanos. Las recuperaciones de masa total de los ácidos grasos libres y lípidos neutros combinados de ambos Iso-Hao pasta o Iso--Polvo Hao eran constantemente cerca cuantitativa. Sin embargo, la relación de los productos (es decir, lípidos neutros + AGL) era diferente. Desde el Iso- pasta-HAO se obtuvo 60% (w / w) AGL y 40% (w / w) lípidos neutros (Tabla 1). Por el contrario, Iso-Hao polvo resultó enriquecido en lípidos neutros (media = 54% de lípidos neutros + 46% AGL) que se detallan en la Tabla 1. La esterificación de los ácidos grasos libres con H 2 SO 4 y metanol y después se produce ésteres de ácidos grasos metílicos (FAME, es decir, el biodiesel) como un color verde oscuro cerca de líquido oleoso negro con un rendimiento mayor que 90% (Figura 3). La decoloración por calentamiento de más de montmorillonita K10 29 (MK10) de arcilla a continuación dio un producto de color amarillo / naranja, similar en apariencia a otra bi comercialodiesel combustibles (ver Lista de Materiales) (Figura 3). Los resultados del análisis FAME de combustibles biodiesel Isochrysis decolorados se muestran en la Tabla 2. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54189/54189fig3.jpg" /> Figura 3. Comparación de Isochrysis y soja combustibles biodiesel. Verde Isochrysis biodiesel (en el medio) se produce por esterificación de ácidos grasos libres extraídos y purificados. Decoloración produce un producto (derecha) con propiedades similares a las de biodiesel comercial (izquierda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Un FAME </td><td> -paste iso </td><td> -Polvo iso </td></tr><tr><td> 14:00 </td><td> 16.4 </td&gt; <td> 19.4 </td></tr><tr><td> 14:01 </td><td> - </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> 15:00 </td><td> rastro </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> 16:00 </td><td> 10.1 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> 16: 1 Δ9 </td><td> 7.6 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> 16:02 </td><td> DAKOTA DEL NORTE </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> 16:03 </td><td> DAKOTA DEL NORTE </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 18:00 </td><td> Rastro </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> 18: 1 B </td><td> 12.1 </td><td> 14.3 </td></tr><tr><td> 18:02 </td><td> 8.1 </td><td> 7.1 </td></tr><tr><td> 18: 3 C </td><td> 8.5 </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td> 18:04 </td><td> 19.8 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> 18:05 </td><td> DAKOTA DEL NORTE </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 20:05 </td><td> DAKOTA DEL NORTE </td><td> - </td></tr><tr><td> 22:05 </td><td> DAKOTA DEL NORTE </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 22:06 </td><td> 6.9 </td&gt; <td> 11 </td></tr><tr><td> Σ D </td><td> 89.8 </td><td> 96.2 </td></tr><tr><td colspan="3"> Notas: Una nomenclatura de ácidos grasos es #carbons.: # Cis bonos -double B combinadas de 18: 1 Δ9 + 18:.. 1 Δ11 C combinada Δ6,9,12 y Δ9,12,15 isómeros D El material restante es más o menos 50 : otros 50 FAME y componentes no FAME (total ~ 95% FAME). ND = No detectado. </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Composición FAME del biodiesel producido a partir de -pasado comercial Iso e Iso -Polvo biomasa Isochrysis. Los lípidos neutros se obtuvieron como una mezcla sólida de color verdoso a 40% w / w de la Iso -paste-Hao y el 54% (promedio.) A partir del polvo-Hao Iso (Tabla 1). Filtrado de los lípidos neutros disueltos a través de sílice usandoDCM dio después de la eliminación del disolvente, un sólido de color rojizo / naranja que se podría recristalizó con hexanos para dar alquenonas analíticamente puro como un sólido blanco. Este procedimiento dio lugar a un 16% (w / w) de rendimiento aislado alquenonas de Iso-pasta-Hao y un rendimiento del 25% a partir de Iso -Polvo-Hao (Tabla 1).

Métodos detallados se presentan para la producción de biodiesel junto con el co-aislamiento de alquenonas como coproductos valiosos a partir de microalgas comercial Isochrysis.

Protocolo experimental para la producción de biodiesel con Aislamiento de alquenonas como Coproductos de Comercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; La biomasa de algas

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

El objetivo general de este procedimiento es producir biodiésel a partir de Isochyrsis Algal disponible comercialmente, al tiempo que se permite el aislamiento simultáneo de alquenonas de cadena larga como subproducto valioso. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la energía renovable, como, por ejemplo, si nuestros biocombustibles derivados de algas son alternativas viables a los combustibles basados en petróleo.La principal ventaja de esta técnica es que la alga que utilizamos ya se cultiva industrialmente y puede adquirirse en cantidades de varios kilogramos de varios proveedores comerciales. Además, estas algas en particular biosintetizan un tipo único de lípidos conocidos como alquenonas de cadena larga, que pueden aislarse como un producto secundario. El procedimiento lo demostrará John Williams, un estudiante de posgrado en mi laboratorio.Para preparar la pasta húmeda de isocrixis disponible comercialmente, corte un pequeño orificio en un paquete de un kilogramo y exprima aproximadamente 300 gramos sobre un recipiente cristalizador de 150 por 75 milímetros. La pasta contiene aproximadamente un 80 % de agua, es de color verde oscuro, casi negro, y tiene un olor fuerte. Seque la pasta al aire para crear una capa de aproximadamente 20 milímetros de espesor.Recoger la biomasa seca en un cartucho de extracción de celulosa de masa conocida. Luego registrar el peso de la biomasa de isocrixis. Transferir aproximadamente de 50 a 60 gramos de isocrixis seca a un aparato de extracción Soxhlet.Luego, llene el matraz Soxhlet con 400 mililitros de hexanos. Encienda el agua del condensador y la fuente de calor, y permita que el Soxhlet realice ciclos durante uno o dos días. Cuando el color del disolvente pase de verde oscuro a un amarillo tenue, la extracción habrá finalizado.Enfríelo hasta temperatura ambiente y utilice un evaporador rotatorio para eliminar los hexanos. Finalmente, pese el aceite algal en hexano. Comience disolviendo el aceite algal en hexano en su matraz con 10 volúmenes de una mezcla de metanol-diclorometano dos a uno.A continuación, agregue una barra de agitación, dos partes y dos tercios de agua en comparación con el volumen del aceite, y agregue una masa de hidróxido de potasio que sea la mitad del peso del aceite. Ahora, conecte el matraz a un condensador de reflujo de 500 milímetros de largo. Caliente la mezcla con agitación a 60 grados celsius durante tres horas en una campana extractora de gases.Después de enfriar la reacción, elimine los disolventes orgánicos en un evaporador rotatorio. A continuación, vierta la mezcla acuosa restante en un embudo de separación de un litro y agregue un volumen igual de hexanos. Enjuague el matraz con los hexanos para asegurar que todo el material pase al embudo.Agite el embudo y deje que las capas se separen. A continuación, vierta la capa acuosa inferior en un matraz y decante la capa orgánica superior en un segundo matraz. Conserve ambas capas.Repita la extracción con hexano hasta que la capa orgánica sea un verde amarillento tenue. Luego, combine los extractos orgánicos recolectados y condénselos en un evaporador rotatorio para aislar los lípidos neutros. Estos lípidos aparecen como un sólido verdoso y tienen un punto de fusión entre 60 y 70 grados Celsius.A continuación, acidifique la fase acuosa hasta un pH de dos utilizando ácido clorhídrico 6 M. Luego, extraiga los ácidos grasos libres de la fase acuosa acidificada usando hexanos y un embudo de separación como antes. Finalmente, elimine los hexanos de los extractos orgánicos combinados mediante un evaporador rotatorio para obtener ácidos grasos libres purificados.Un residuo oleoso de color verde oscuro, casi negro, que se funde ligeramente por encima de 30 grados celsius. Disuelva los ácidos grasos utilizando seis volúmenes de metanol cloroformo y luego vierta la solución en un matraz de reacción de alta presión con pocillo profundo y una barra de agitación, enjuagando para asegurar que todos los ácidos grasos pasen al matraz de reacción. A continuación, bajo una campana extractora, agregue ácido sulfúrico concentrado.Cierre el matraz y caliente la mezcla a 90 grados Celsius durante una hora con agitación. Después de enfriar la reacción a temperatura ambiente, viértala en un embudo de separación y agregue dos volúmenes de agua. Agite ahora el embudo de separación, deje que las fases se separen y deseche la capa inferior en un matraz redondo de fondo plano previamente pesado.Luego, concentre la solución en un evaporador rotatorio y registre la masa del biodiésel resultante; la sustancia ahora puede analizarse mediante cromatografía de gases. Los lípidos neutros pueden rasparse del fondo redondo, pesarse y transferirse a un matraz para su purificación. Comience disolviendo los lípidos neutros en una cantidad mínima de diclorometano.Luego, aplique la solución en la parte superior de una columna de cromatografía que contiene 100 gramos de gel de sílice. A continuación, utilice una presión ligera para hacer pasar la solución a través de la sílice con aproximadamente 150 mililitros de diclorometano. Se añade una pequeña capa de arena en la parte superior de la columna para evitar que la sílice se perturbe al llenar con disolvente.Recolecte la yelia wint en un matraz redondo de 250 mililitros. Luego elimine el diclorometano con un evaporador rotatorio. El resultado debe ser un sólido de color naranja.Re-cristalice los sólidos en hexanos hirviendo. Primero, agregue inicialmente 100 mililitros y luego siga agregando hexanos hirviendo hasta que la solución sea homogénea. Ahora, enfríe lentamente la solución a temperatura ambiente para favorecer la cristalización y recolecte las alquenonas cristalizadas utilizando un equipo de filtración.Utilice un pequeño volumen de hexanos fríos para enjuagar el matraz. Antes del procesamiento, la pasta de isocrixis se secó primero para obtener un material negro, verde y escamoso con olor a alga marina. En contraste, la isocrixis en polvo era un polvo seco molido finamente de color amarillo-marrón que se utilizó sin procesamiento adicional.La extracción de cualquiera de los materiales mediante soxhlet con hexanos produjo aceites algales con rendimientos considerablemente más altos a partir de la pasta que del polvo. Los acilglicéridos en el aceite algal se convirtieron en carboxilato soluble en agua, del cual se extrajeron lípidos neutros y ácidos grasos libres en un volumen casi cuantitativo a partir de cualquiera de los materiales iniciales. Sin embargo, la proporción de los productos fue diferente.La esterificación produjo ésteres metílicos de ácidos grasos. También conocido como biodiésel, un líquido oleoso verde oscuro, casi negro. El rendimiento superó el 90 %. El producto se decoloró según se describe en el protocolo del texto.El análisis de MEAG de los combustibles biodiésel purificados mostró perfiles similares pero no idénticos a partir de los dos materiales iniciales. Al filtrar los lípidos neutros disueltos a través de sílice utilizando DCM, se obtuvo un sólido de color anaranjado rojizo que fue re-cristalizado con hexanos para obtener alquenonas puras desde el punto de vista analítico. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo procesar la isocrysis disponible comercialmente para producir biodiésel, con el aislamiento de alquenonas puras como subproducto.Una vez dominada, esta técnica puede generar consistentemente cantidades significativas de biodiésel de algas y alquenonas para su posterior estudio. Con su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que examinemos críticamente las propiedades del combustible del biodiésel de algas al proporcionar cantidades suficientes para realizar diversas pruebas de combustible, en lugar de depender de predicciones o simulaciones. No olvide que trabajar con ácidos o bases fuertes y calentar los contenidos dentro de un recipiente sellado puede ser extremadamente peligroso.Asegúrese de usar equipo de protección personal adecuado y trabaje en una campana extractora al realizar estos pasos.

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Fuente: Ginies, C., et al. Identificación de ácidos grasos en Bacillus cereus. J. Vis. Exp. (2016)Este video muestra el proceso de preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) a partir de muestras bacterianas mediante el tratamiento de la biomasa con una solución alcalina, seguida de separación de fases y evaporación de solventes para el análisis posterior.

Preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) a partir de biomasa bacteriana

Un método para la determinación del contenido de ácido graso y la composición en microalgas basado en disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, de transesterificación, y la cuantificación e identificación de los ácidos grasos utilizando cromatografía de gases se describe. Un estándar interno tripentadecanoin se utiliza para compensar las posibles pérdidas durante la extracción y la transesterificación incompleta.

Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas

Un protocolo simple para determinar el contenido de lípidos neutros de células de algas utilizando un procedimiento de tinción de Rojo Nilo se describe. Esta técnica de ahorro de tiempo ofrece una alternativa a los protocolos de cuantificación de lípidos basados ​​en gravimétricos tradicionales. Ha sido diseñado para la aplicación específica de la supervisión del rendimiento de bioprocesos.

Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

La integración del cultivo de microalgas con los gases de combustión industriales introducirá en última instancia metales pesados y otros compuestos inorgánicos en los medios de crecimiento. Este estudio presenta un procedimiento utilizado para determinar el destino final y el impacto de los metales pesados y contaminantes inorgánicos en el crecimiento de Nannochloropsis salina cultivada en fotobiorreactores.

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Se describe un método de espectrometría de masas bidimensional de cromatografía de gases en tiempo de vuelo para la caracterización de la fracción acuosa de biocrudo producida a partir de la licuefacción hidrotermal de algas. Este protocolo también se puede emplear para analizar la fracción acuosa de productos líquidos de pirólisis rápida, pirólisis rápida catalítica, desoxigenación catalítica e hidrotratamiento.

Caracterización cualitativa de la fracción acuosa de hidrotérmico Licuefacción de algas mediante 2D cromatografía de gases con espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Este artículo describe el proceso de ensamblaje y operación de un biorreactor fotosintético a escala de laboratorio que puede usarse, junto con otros métodos, para estimar parámetros de crecimiento cinético pertinentes. Este sistema monitorea continuamente el pH, la luz y la temperatura usando sensores, una unidad de adquisición y control de datos y software de adquisición de datos de fuente abierta.

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Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.

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La contaminación del aire afecta la calidad de vida de todos los organismos. Aquí, describimos el uso de la biotecnología de microalgas para el tratamiento de biogás (eliminación simultánea de dióxido de carbono y sulfuro de hidrógeno) y la producción de biometano a través de estanques semiindustriales abiertos de algas de alta tasa y el posterior análisis de la eficiencia del tratamiento, el pH, el oxígeno disuelto y el crecimiento de microalgas.

Purificación de biogás mediante el uso de un sistema de microalgas-bacterias en estanques semiindustriales de algas de alta tasa

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Protocolo experimental para la producción de biodiesel con Aislamiento de alquenonas como Coproductos de Comercial Isochrysis La biomasa de algas (Video) | JoVE Journal

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