Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

El objetivo general de este procedimiento es generar y distinguir macrófagos de tipo alveolar de células dendríticas en cultivos de células de médula ósea murina in vitro suplementados con GM-CSF. Este método in vitro puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función de las células dendríticas o macrófagos. La principal ventaja de la técnica es que puede generar un número suficiente de células y puede distinguir entre células dendríticas y macrófagos de tipo alveolar.

Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia la terapia de la proteinosis pulmonar, ya que facilita la adquisición de macrófagos de tipo alveolar, que pueden utilizarse para tratar esta enfermedad. Por lo general, las personas nuevas en este método necesitarán práctica para aislar los huesos limpios y lavar la médula ósea. La demostración visual de este método es útil, ya que no todas las técnicas utilizadas se entienden fácilmente solo con la instrucción escrita.

15 minutos antes de comenzar la disección, encienda una cabina de seguridad biológica para purgar el aire de la cabina y estabilizar el flujo de aire, y limpie la superficie del gabinete con etanol al 70%. Cuando el armario esté listo, coloque un ratón encima de una o dos toallas de papel en posición prona y rocíe al animal con etanol al 70%. Luego, con la mano no dominante, levante la piel alrededor del área torácica y use unas tijeras para hacer una incisión.

Agarrando ambos extremos de la incisión, tire con cuidado hasta que los dos extremos de la incisión se unan en el estómago. A continuación, coloque el ratón en posición supina y utilice una mano para tirar de la mitad inferior de la piel hacia abajo hasta que las patas queden expuestas. Sosteniendo el pie, corte los tendones de Aquiles por encima de la articulación del tobillo y los ligamentos que conectan los músculos con el pie en el extremo inferior de la tibia para aflojar el pie de los huesos de la pierna.

Manteniendo la pierna levantada, retire los músculos y ligamentos alrededor de la articulación de la rodilla en el extremo inferior del fémur para separar los músculos del muslo de la parte inferior de la pierna. Con fórceps, retire suavemente los músculos sueltos de las superficies fibular y femoral. Luego, presionando las tijeras en la posición abierta en la articulación de la cadera, gire la pierna y tire suavemente del fémur para separar el hueso de la pierna de la articulación de la cadera mientras corta la pierna para liberarla del cuerpo.

Ahora, sosteniendo la pierna en el extremo de la cadera con una pinza estéril, use otra pinza para quitar el pie del extremo del tobillo. Luego, sosteniendo el extremo distal del fémur con una pinza y el extremo proximal de la tibia y el peroné con otra, doble cuidadosamente la tibia y el peroné en la dirección opuesta a la articulación de la rodilla para separar la parte inferior de la pierna del fémur y la rótula. Use las pinzas para extraer los ligamentos, músculos y peroné restantes de los huesos de la parte inferior de la pierna y coloque la tibia limpia en una tapa de placa de Petri invertida, que contenga de uno a dos mililitros de HBSS/FCS.

Sosteniendo el extremo inferior del fémur con un juego de pinzas y la rótula con otro, doble la rodilla y los tejidos circundantes en la dirección opuesta para extirpar la articulación. A continuación, retire los tejidos conectivos restantes del fémur y coloque el hueso en la tapa de la placa de Petri invertida. Cuando se hayan extraído todos los huesos, use pinzas para limpiar cualquier tejido residual que aún esté adherido a los huesos y sumerja los huesos en 10 mililitros de HBSS/FCS dentro de la base de la placa de Petri.

Manteniendo el plato parcialmente protegido con una tapa estéril, corte cada uno de los huesos limpios por la mitad con unas tijeras. A continuación, utilice una jeringa de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 26,5 para enjuagar un mililitro de HBSS/FCS de la placa hasta el extremo de cada pieza de hueso hasta que se haya liberado toda la médula roja. Pase los grumos visibles de médula ósea a través de la jeringa varias veces para formar una suspensión unicelular, seguida de una mezcla completa con una pipeta de 10 mililitros.

Transfiera las células a un tubo de recolección y enjuague la placa de Petri una vez con cinco mililitros de HBSS/FCS para recolectar las células residuales. A continuación, acumula el lavado en el tubo de recogida y coloca las células en hielo. Para establecer un cultivo de células de médula ósea, centrifugue las células recolectadas y aspire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio estéril conectada a la succión al vacío.

Afloje la bolita rica en glóbulos rojos con golpecitos. A continuación, añada 10 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos y vuelva a suspender las células con vórtice. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, detenga la lisis con 10 mililitros de HBSS/FCS y centrifuga las células, resuspendiendo el pellet en el medio celular de la médula ósea.

Cuente el número de células viables por exclusión de azul de tripano y transfiera las células necesarias a un nuevo tubo con medio de células de médula ósea. A continuación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet a una dilución de cuatro millones de células por mililitro en medio de células de médula ósea con 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF. A continuación, agregue 9,5 mililitros de medio de células de médula ósea suplementado con 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a una placa de Petri bacteriana estéril por cultivo y agregue 500 microlitros de células al centro de cada placa.

Incubar las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2. En el tercer día, agregue 10 mililitros de médula ósea fresca suplementada con 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a cada cultivo, teniendo cuidado de minimizar cualquier alteración en las células. Al sexto día, transfiera cuidadosamente 10 mililitros de sobrenadante de cultivo celular a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.

Centrifugar las células y resuspender el pellet en 10 mililitros de médula ósea fresca de médula ósea media, que contenga 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF. A continuación, vórtice suavemente la suspensión celular y devuelva las células a la placa de cultivo. El primer día, las células de la médula ósea son pequeñas y escasas, pero al tercer día, las células han aumentado en número y tamaño, y algunas han comenzado a adherirse.

Al sexto día, hay más células y se observan fracciones adherentes y no adherentes. El cultivo se puede cosechar desde el día siete hasta el día 10 y se puede delimitar por tamaño y células vivas con un mayor porcentaje de células CD11c positivas obtenidas de los cultivos del día 10. Al séptimo día, la fracción no adherente recolectada se enriquece en gran medida para las células con una morfología dendrítica.

Las poblaciones CD11c positivas y GR1 negativas, cosechadas en los días siete y 10, se pueden dividir en tres poblaciones principales. Macrófagos, células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras por expresión de MHCII y unión a FL-HA. Curiosamente, MerTK, aunque se considera un marcador de macrófagos, exhibe una expresión robusta tanto en poblaciones de macrófagos como de células dendríticas inmaduras, recolectadas en los días siete y 10, con un bajo nivel de expresión observado en células dendríticas maduras.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de técnicas estériles durante la recolección de médula ósea y el cultivo celular. Siguiendo este procedimiento, las células también se pueden clasificar para examinar las poblaciones celulares por separado, o se pueden estimular con agentes inflamatorios y posteriormente analizar su producción de citocinas mediante tinción intracelular y citometría de flujo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células de médula ósea y cultivarlas en GM-CSF para generar células dendríticas y macrófagos similares a los alveolares.