Name: Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprende a generar e identificar macrófagos alveolares y células dendríticas a partir de médula ósea de ratones usando GM-CSF. Este método permite obtener suficientes células para estudiar sus funciones inmunológicas.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (Grant RP-119503) y el Consejo de Ciencias e Ingeniería de la Naturaleza de Canadá (NSERC). CRSNG también apoyó becas de verano para YD YD y AA es apoyado por la Universidad de Columbia Británica (UBC), con un premio de beca de 4 años, AA es apoyado por CIHR con la concesión de un Maestro estudiante graduado (CGS-M). Agradecemos a Calvin Roskelley para obtener ayuda con el microscopio utilizado para generar las imágenes en la Figura 2. También reconocemos el apoyo de los animales y el flujo de Instalaciones de citometría de UBC.

Los ratones fueron sacrificados de acuerdo con el Consejo Canadiense para el manejo de estos animales para la investigación con animales ética mediante procedimientos aprobados por la Universidad de Cuidado de Animales Columbia Británica. 1. La adquisición de una sola célula de médula ósea de ratón Suspensión de fémur y tibia <ol><li> Cambiar en una cabina de seguridad biológica (BSC) 15 minutos antes de comenzar el procedimiento para purgar el aire del gabinete y permitir la estabilización del flujo de aire, superficie BSC continuación, limpia / el aerosol con un 70% de etanol. Mantener todo lo más estéril posible para la totalidad del protocolo. No cortar los huesos en condiciones no estériles. </li><li> Preparar herramientas de disección por inmersión en etanol al 70% (1 par de tijeras de disección, 2 pares de pinzas), solución salina equilibrada de Hank con 5% de suero de ternera fetal (HBSS-FCS), placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), 1 jeringas ml, 26½ agujas de calibre, tubos de recogida cónicos (15 ml o 50 ml), y toallas de papel en el BSC. </li><li> La eutanasia del ratón usandolos protocolos aprobados por el comité de ética de la investigación institucional de animales. Poner en el BSC, colocar en la parte superior de una o dos toallas de papel y rociar el ratón con un 70% de etanol. </li><li> En el BSC, abra una asépticamente estéril placa de Petri, alícuota de 10 ml de HBSS-FCS a la base y de 1 - 2 ml a la tapa. </li><li> Coloca el ratón sobre su estómago con la espalda hacia arriba y levantar la piel alrededor de las secciones torácica con los dedos de la mano no dominante. Use las tijeras para hacer una incisión en la piel se tersa. </li><li> Aferrarse a ambos extremos de la corte, un extremo con cada mano y con cuidado separar la piel alrededor del ratón desde la parte posterior al estómago, continuará tirando hasta dos extremos de la incisión se reúnen en el estómago. </li><li> Da la vuelta al ratón para el estómago hacia arriba, y con una mano tire de la mitad inferior de la piel hacia abajo hacia la pierna, seguir tirando hacia atrás la piel hasta que las patas están expuestos. </li><li> Mantenga los pies del ratón hacia arriba y cortar los tendones de Aquiles por encima de la articulación del tobillo ylos ligamentos que conectan los músculos a los pies en el extremo inferior de la tibia con unas tijeras. Esto afloja los pies de los huesos de la pierna. </li><li> Mientras sostiene la pata por el pie, cortar los músculos y ligamentos con tijeras todo alrededor de la articulación de la rodilla en el extremo inferior del fémur para cortar los músculos del muslo de la pierna inferior. El uso de fórceps para tirar suavemente los músculos aflojados lejos del peroné y superficies femorales. Tenga cuidado de no cortar la arteria femoral para evitar el sangrado abundante. </li><li> Con una mano se aferra a los pies, prensa tijeras abajo abierto en el extremo superior del fémur en la articulación de la cadera, rotar la pierna y tirar suavemente para separar el fémur de la articulación de la cadera durante el uso de las tijeras para hacer el corte final a la libre la pierna del cuerpo. </li><li> Desde este punto en adelante, solamente mantener el tejido con pinzas estériles. Aferrarse a la pierna en un extremo y sacar el pie en el otro. NOTA: Esto no debería requerir mucha fuerza, como ligamentos que conectan se cortan en el paso1.9. Alternativamente, cortar la tibia justo por encima del tobillo en el que se fusiona el hueso. </li><li> Mantenga la pierna por el extremo distal del fémur con un juego de fórceps y el extremo proximal de la tibia y el peroné con otra, doblar cuidadosamente la tibia y el peroné en la dirección opuesta de la articulación de la rodilla para separarlos de fémur y la rótula. </li><li> El uso de fórceps para tirar hacia abajo los ligamentos y los músculos que quedan todavía unido a los huesos inferiores de la pierna. Aquí, retire el peroné junto con los tejidos conectivos con pinzas, ya que es demasiado pequeño para ser lavado para células de la médula ósea. Coloque la tibia limpiado en la tapa invertida placa de Petri. </li><li> Mantenga el extremo inferior del fémur con un juego de fórceps y la rótula con otra, doblar la rótula y los tejidos circundantes en la dirección opuesta de la articulación para su eliminación. Después se limpia restante tejidos conectivos del fémur; tirar a la basura con fórceps, y colocarlo en la tapa invertida placa de Petri. Desechar la rótula. </li><li> repetir 1,7- 1.13 con la otra pierna, si es necesario. La transferencia de los huesos de 1,6 ml tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de HBSS estéril-FCS para el transporte si es necesario. </li><li> Coloque los huesos en la tapa de la placa Petri invertida, con 1 - 2 ml de HBSS-FCS, el uso de fórceps para limpiar cualquier tejido residual todavía unido a la tibia y el fémur, a continuación, transferir los huesos a la base de placa de Petri que contiene 10 ml de HBSS FCS. Alternativamente, limpiar los huesos y eliminar el tejido muscular unida mediante un tejido empapado de etanol al 70%. </li><li> Cortar cada uno de los huesos por la mitad con unas tijeras. Parcialmente proteger la placa de Petri con una tapa estéril durante el corte para asegurar que los huesos se mantengan en el plato. Alternativamente, cortar el extremo de cada hueso que permite la purga en la siguiente etapa. </li><li> Una el 26½ aguja G en la jeringa de 1 ml, y elaborar 1 ml de HBSS-FCS de la placa de Petri. Inserte la punta de la aguja en el extremo de un trozo de hueso y eliminar las células de la médula ósea (tejido rojo suave dentro de los huesos). Insertar la aguja en la cabezadel hueso y el extremo abierto, hasta que se quite toda la médula de color rojo. Observar los huesos de color blanco. </li><li> Pasar los grumos visibles de la médula ósea a través de la jeringa un par de veces para formar una sola suspensión celular. </li><li> Desechar los huesos enrojecidas. Usar una pipeta de 10 ml para mezclar la suspensión de células bien y transferir al tubo de recogida. Enjuagar la placa de Petri una vez con 5 ml de HBSS-FCS para recoger las células residuales en el plato. Colocar las células en hielo. NOTA: La suspensión de células de médula ósea es todavía viable si se almacena por 2 - 3 horas a 4 ° C. </li></ol> 2. Chapado y cultivo de células de médula ósea (BMC) <ol><li> Preparar los siguientes reactivos y materiales de construcción. <ol><li> Preparar tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) haciendo cloruro de amonio 0,84% en una solución final de 2 mM Tris pH 7,2, y luego esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. </li><li> Preparar medios BMC mediante la adición de 10% de FCS, HEPES 20 mM, 1x aminoácido no esencial, 55 y #181; M 2-mercaptoetanol, 50 U / ml de penicilina y estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, y 2 mM L-glutamina al medio RPMI 1640. </li><li> Obtener disponible comercialmente GM-CSF recombinante o usar GM-CSF que contiene sobrenadante de células de mieloma AG8.653 transfectadas con el gen de GM-CSF 20. Determinar la concentración de GM-CSF en el sobrenadante por ELISA y añadir el equivalente a 20 ng / ml a los medios de BMC. </li></ol></li><li> Centrifugar las células de médula ósea a 314 xg durante 5 min. El sedimento es rojo, debido a los glóbulos rojos. En el BSC, aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio estéril unida a la succión del vacío, afloje el sedimento tocando, a continuación, añadir 10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Vortex para resuspender las células y se incuba en tampón de lisis RBC a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Añadir 10 ml de HBSS-FCS a continuación, girar las células a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Observe el sedimento celular como el color blanco. Resuspender las células en volumen deseado de los medios de BMC. </li><li> Contar el resuspended células utilizando un hemocitómetro después de teñir las células muertas con 0,4% de azul de tripano. NOTA: Si se utiliza la médula ósea de una pierna (solo la tibia y el fémur), se vuelve a suspender en 5 ml de medio de BMC, tomar 10 l de suspensión celular y se diluye con 70 l de 0,4% azul de tripano, mezclar bien y la transferencia de 10 l de la dilución 1/8 de células a la cámara de hemocitómetro. Contar las células viables en cuatro cuadrantes: el promedio de los cuatro cargos cuadrante x factor de dilución x 10 4 = número de células por ml. Un fémur y una tibia de una pierna lo general, resultados aproximadamente de 2 - 4 x 10 7 células después de la lisis de glóbulos rojos. </li><li> Estimar el número de 10 ml platos de cultivos de médula ósea necesarias para los experimentos de aguas abajo basado en el número total de células necesarias para los experimentos en el final del cultivo. NOTA: Cada plato requiere 2 x 10 6 células de médula ósea de siembra inicial y los rendimientos de 5 - 10 x 10 6 células en el día 7. <ol><li> Aliquot el número total de células para el recubrimiento en un nuevo tubo, girar hacia abajo a 314 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 4 x 10 6 células / ml en medio BMC. </li></ol></li><li> Prepare un nuevo 100 mm estéril x 15 mm placa de Petri con 9,5 ml de medio de BMC que contiene 200 ng de GM-CSF (recombinante o de GM-CSF que contiene sobrenadante). Añadir 500 l de las células de médula ósea 4 x 10 6 células / ml en el centro de la placa de Petri para la concentración final de 2 x 10 5 células / ml en 10 ml. NOTA: Es importante no utilizar una placa de Petri estéril de una placa de cultivo de tejidos. Además, cuando la adición de las células, las células garantizar siguen concentradas en el centro y minimizar las molestias a los platos después de la siembra y durante los cambios de los medios de comunicación. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2. Este es el día 0 en la cultura. </li><li> El día 3, se añaden 10 ml de medio fresco que contenía BMC 200 ng de GM-CSF a cada placa de células. Tener cuidado para minimizar la perturbación of las células concentradas en suspensión. Volumen total de cultivo celular es ahora de 20 ml. </li><li> Observar las células bajo el microscopio óptico con un aumento de 100X. Observar numerosas células no adherentes (redondos) y unas pocas células adherentes (planas). Las células en grupos de tres o cuatro pétalos que se asemejan de una flor se puede ver, lo que indica proliferación. </li><li> En el día 6 realizar un cambio de la mitad de los medios de comunicación. Retirar con cuidado 10 ml de medio en un tubo cónico de 50 ml estéril, centrifugar a 314 xg durante 5 minutos, aspirar y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio BMC frescas que contienen 20 ng / ml de GM-CSF, suavemente vórtice y añadir a la placa de cultivo celular original para un volumen total de 20 ml. Observar las células bajo el microscopio. NOTA: El día 7 de cultivo debe ser al 70% o mayor en la confluencia con células adherentes planas y densas nubes de células no adherentes redondas. </li></ol> 3. Recolección y Preparación BMDC y BMDMs por Citometría de Flujo <ol> &lt;li&gt; Mantenga todos los tampones a 4 ° C. </li><li> Recoger las células de día 7 al día 10. Para cosechar las células, primera transferencia de 10 ml del sobrenadante del cultivo a un tubo de recogida cónico de 50 ml, a continuación, inclinar el plato vertical en aproximadamente 30 grados y se lava el plato pipeteando los restantes 10 ml de la cultura de la parte superior del plato. Repita este lavado 5 veces, cada vez rotación de la placa por tercera. </li><li> La transferencia de los restantes 10 ml de células con el mismo tubo de recogida y desechar la placa y las células adherentes. NOTA: Los lavados se eliminar las células no adherentes y de baja adherencia; las células adherentes planas son resistentes a los lavados. Por lo general, entre 5 - Se espera que 10 x 10 6 células no adherentes de una placa en el día 7 y 2 - 5 x 10 6 células en el día 10, aunque Lutz et al. reportadas 10 x 10 6 células en el día 10. No se toman normalmente las células adherentes. Sin embargo, si estas células tienen que ser en comparación con las células no adherentes, Que se puede quitar de la siguiente manera. Añadir 5 ml de EDTA 0,7 mM en 1 x PBS, pH 7,4 a la placa después se retiran las células no adherentes, se incuba a 37 ° C durante 5 min, la pipeta hacia arriba y abajo para eliminar las células adherentes y recoger en un tubo separado. </li><li> Centrifugar las células recogidas en 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Volver a suspender en 5 ml de medio BMC estériles a 4 ° C y agitar suavemente para mezclar, y contar usando azul tripán y un hemocitómetro. NOTA: Cada plato rendirá 5 - 10 x 10 6 células no adherentes de un cultivo de 7 días. A partir de ahora, realizar todos los pasos a 4 ° C. </li><li> Para el análisis de citometría de flujo, la transferencia de 2 x 10 5 células para cada muestra en 5 ml de poliestireno tubos de fondo redondo, añadir 300 l de tampón de FACS a 4 ° C (1x salina tamponada con fosfato, EDTA 2 mM y 2% de suero de albúmina bovina) a cada muestra. </li><li> Girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Observar un sedimento blanco opaco visible en la parteparte inferior del tubo. </li><li> Resuspender las células en 100 l de receptor Fc no marcado Ab para bloquear los receptores Fc de unión (Uso décimo sobrenadante de 2.4G2 producir la línea celular de mieloma) y se incuba durante 20 min a 4 ° C. A continuación, añadir 300 l de tampón de FACS a cada muestra, suavemente vórtice, a continuación, girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 100 l de CD11c-PeCy7 en 0.2 g / ml, azul Gr1-Pacífico en 0.25 g / ml, MHCII-APC en 0.05 g / ml, y FL-HA en aproximadamente 2 mg / ml para identificar los macrófagos y las DC. NOTA: FL-HA fue preparado en casa usando fluoresceína y sal sódica del ácido hialurónico cresta de gallo como se describió previamente 21. </li><li> Incubar durante 20 min a 4 ° C para permitir la unión a la superficie celular. Añadir 300 l de tampón de FACS a cada muestra, suavemente vórtice, a continuación, girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. NOTA: Si biotinylated anticuerpos se utilizan en 3.8, 3.8 repetir - 9 con fluorescente-estreptavidina. </li><li> Lavar las células con otra 300 l de tampón de FACS, suavemente vórtice para mezclar y centrifugar las células a 314 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de tampón FACS que contiene 0,1 a 0,2 g por ml de yoduro de propidio o DAPI para marcar las células no viables. Las células están ahora listas para el análisis de citometría de flujo 22. NOTA: Ver resultados y la Figura 3 para más detalles de las poblaciones y cómo fueron con acceso a las células. </li></ol>

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<li>Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Activated+Dendritic+Cells%3A+%27Exhausted%27+or+Alert+and+Waiting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting.</a> J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).</li>
<li>Contreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Leishmania+mexicana+Infection+on+Dendritic+Cell+Signaling+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).</li>
<li>Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li>
<li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

En este manuscrito, se proporciona un método para la generación de los macrófagos y las CD GM-CSF derivados de una sola cultivo de médula ósea de ratón que está adaptado de Lutz et al. 6. MHCII expresión y FL-HA distingue entre países en desarrollo inmaduro y macrófagos vinculante en esta cultura (ver Figura 3C), que previamente ha sido difícil. Esto, junto con otro informe de Helft et al. 19, demuestra la heterogeneidad dentro de las culturas BMDC inducidos GM-CS...

Varios métodos de cultivo in vitro se han descrito para generar macrófagos de médula derivadas de médula (BMDMs) y las DC derivadas de médula ósea (BMDCs) utilizando uno o una combinación de factores de crecimiento. BMDMs se puede generar mediante el cultivo de células de médula ósea usando factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Para BMDCs, la adición de ligando FLT3 para el cultivo de médula ósea da lugar a DCs plasmacitoides clásicos y no adherentes (CD11c alta MHCII alta y CD11c lo /, B220 +, respectivamente) después de 9 días en cultivo 3,4. En contraste, las células no adherentes generan después de 7 a 10 días en cultivo con GM-CSF solo 5,6, GM-CSF e IL-4 7, o GM-CSF y FLT3 ligando 8,9 generan BMDCs se parece más a los países en desarrollo inflamatorias (alta CD11c, CD11b + MHCII alta) 10. Si bien se utilizan estos cultivos in vitro para generar los macrófagos oLos países en desarrollo, no está claro si cada cultura da lugar a poblaciones puras. Por ejemplo, aunque se describen las células adherentes en los cultivos GM-CSF para ser macrófagos 5, las células no adherentes de la misma cultura se utilizan como los DC 6,11-13, con la presunción de que son homogéneos y cualquier variabilidad observada es debido a las diferentes etapas de desarrollo 14,15. Además, los estudios han encontrado GM-CSF para ser un factor de crecimiento esencial para el desarrollo de los macrófagos alveolares in vivo 16,17, y se pueden utilizar in vitro para generar los macrófagos alveolares como 16,17,18. Aparte de la adhesión, los procedimientos para la generación de los macrófagos y los países en desarrollo de cultivos de médula ósea tratados con GM-CSF son muy similares sugiriendo heterogeneidad puede existir dentro de cultivos de médula ósea de GM-CSF. De hecho, esto parece ser el caso como dos documentos informan de la presencia de BMDMs en la fracción no adherente de las culturas BMDC. En uno de papel, que identified una población de células como CD11c +, CD11b +, MHCII mediados, MerTK + y CD115 +, que expresa una expresión genética que se parecía más estrechamente los macrófagos alveolares y tenía una capacidad reducida para activar las células T 19. El segundo papel utilizado MHCII y FL-HA para identificar una población de macrófagos alveolares similar (CD11c +, MHCII media / baja, FL-HA de alto) que era distinta de inmaduros (CD11c +, MHCII mediados, FL-HA baja) y madura DC (CD11c +, MHCII alta), tanto fenotípicamente y funcionalmente 18. Estos documentos ilustran que ambos cultivos GM-CSF BMDC son heterogéneos, que contiene tanto los macrófagos y DC poblaciones que indica que se debe tener cuidado al interpretar los datos a partir de cultivos de BMDC. Este protocolo describe cómo aislar de la médula ósea, células de médula ósea en cultivo GM-CSF, e identificar el alveolar similar a macrófagospoblación de los países en desarrollo inmaduro y maduros en el cultivo de médula ósea mediante citometría de flujo utilizando la unión y la expresión MHCII FL-HA. Este procedimiento se basa en el procedimiento establecido de Lutz et al 6 y es capaz de generar. 5 - 10 x 10 6 células no adherentes en el día 7 de un cultivo de 10 ml. El cultivo se puede utilizar desde días 7 a 10 y se obtiene una población heterogénea de macrófagos, células dendríticas inmaduras y maduras, así como algunos progenitores en el día 7. Esto proporciona un método simple para crecer y aislar in vitro macrófagos alveolares-como en grandes cantidades.

<table><tbody><tr><td>citómetro de flujo</td><td>BD&nbsp;</td>Microscopio invertido automatizado <td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Centrífuga DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Armario de Bioseguridad</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 Aguja de calibre 26 BD</td><td>305111</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Cónico&nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de la marca Falcon (1,5 ml)</td><td>Tubos de</td> fondo redondo de poliestireno <td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>de 5 ml</td><td>Herramientas de</td> disección de <td>352052</td><td></td>Corning</tr><tr><td></td><td>Herramientas de ciencia fina&nbsp;</td><td>*Varios&nbsp;</td><td>*Tijeras de disección, pinza Dumont y pinza estándar;</td></tr><tr><td>Hemocitómetro&nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 100 mm x 15 mm Placa</td><td>de Petri Corning</td><td>351029</td><td>*Marca Falcon</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potasio</td><td>Monobásico BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Potasio</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Peine de Gallo Hialuronato de Sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td> <td>* Utilizado para hacer hialuronano fluorescente</td></tr><tr><td>RPMI-1640 &nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>Sin piruvato de sodio, sin glutamina. Medios cálidos a 37&nbsp; &#176; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>5271-10 y 5271-10 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fc Receptor (sin etiquetar), Supernadante de cultivo de tejidos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Clon: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Clon: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Clon: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Clon: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinilado Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>IgG policlonal de cabra</td></tr><tr><td>Estreptavidina PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

generación e identificación de gm-csf derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas a partir de médula ósea de ratones

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Los macrófagos y células dendríticas (DC) son células inmunes innatas que se encuentran en tejidos y órganos linfoides que juegan un papel clave en la defensa contra los patógenos. Sin embargo, son difíciles de aislar en número suficiente para estudiar en detalle, por lo tanto, los modelos in vitro se han desarrollado. Cultivos in vitro de macrófagos derivados de médula ósea y células dendríticas son valiosos métodos bien establecidos y para estudios inmunológicos. Aquí, se describe un método para el cultivo y la identificación de ambos DCs y macrófagos a partir de un único cultivo de células de médula ósea primaria de ratón utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos de citoquinas (GM-CSF). Este protocolo se basa en el procedimiento establecido primera desarrollada por Lutz et al. en 1999 para los países en desarrollo derivadas de médula ósea. El cultivo es heterogénea, y MHCII y hialuronano fluoresceinado (FL-HA) se utilizan para distinguir los macrófagos de CD inmaduras y maduras. Estos GM-CSF derivado macrófagos procionar una fuente conveniente de in vitro macrófagos derivados que se parecen mucho macrófagos alveolares tanto en fenotipo y la función.

Un diagrama de flujo que resume los principales pasos de este método se muestra en la Figura 1. La densidad y morfología del cultivo de médula ósea en diferentes momentos del cultivo se muestra en la Figura 2. En el día 1, las células son pequeñas y escaso pero por día 3, hay más células, algunas son más grandes y algunos han comenzado a adherirse. Por día 6 hay un adherente definido y la fracción no adherente (Figura 2A). El cultivo se ...

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

El objetivo general de este procedimiento es generar y distinguir macrófagos similares a los alveolares de las células dendríticas en cultivos in vitro de células de médula ósea murina suplementados con GM-CSF. Este método in vitro puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función de las células dendríticas o de los macrófagos. La principal ventaja de la técnica es que puede generar un número suficiente de células y es capaz de distinguir entre células dendríticas y macrófagos similares a los alveolares.Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la terapia de la proteinosis pulmonar, ya que facilita la obtención de macrófagos similares a los alveolares, los cuales pueden utilizarse para tratar esta enfermedad. En general, las personas nuevas en este método necesitarán práctica para aislar los huesos limpios y lavar la médula ósea. La demostración visual de este método es útil, ya que no todas las técnicas se entienden fácilmente únicamente mediante instrucciones escritas.15 minutos antes de comenzar la disección, encienda una cabina de seguridad biológica para purificar el aire de la cabina y estabilizar el flujo de aire, y limpie la superficie de la cabina

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Este video describe un protocolo para la generación de células dendríticas--células presentadoras de antígenos clave que activan las células T-- a partir de la médula ósea de un ratón adulto.

Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.

Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Aprende a generar e identificar macrófagos alveolares y células dendríticas a partir de médula ósea de ratones usando GM-CSF. Este método permite obtener suficientes células para estudiar sus funciones inmunológicas.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones (Video) | JoVE Journal

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

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