Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones
25 de junio de 2016
Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.
El objetivo general de este procedimiento es generar y distinguir macrófagos similares a los alveolares de las células dendríticas en cultivos in vitro de células de médula ósea murina suplementados con GM-CSF. Este método in vitro puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función de las células dendríticas o de los macrófagos. La principal ventaja de la técnica es que puede generar un número suficiente de células y es capaz de distinguir entre células dendríticas y macrófagos similares a los alveolares.
Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la terapia de la proteinosis pulmonar, ya que facilita la obtención de macrófagos similares a los alveolares, los cuales pueden utilizarse para tratar esta enfermedad. En general, las personas nuevas en este método necesitarán práctica para aislar los huesos limpios y lavar la médula ósea. La demostración visual de este método es útil, ya que no todas las técnicas se entienden fácilmente únicamente mediante instrucciones escritas.
15 minutos antes de comenzar la disección, encienda una cabina de seguridad biológica para purificar el aire de la cabina y estabilizar el flujo de aire, y limpie la superficie de la cabina con etanol al 70%. Cuando la cabina esté lista, coloque un ratón encima de una o dos toallas de papel en posición prona y rocíe el animal con etanol al 70%. Luego, con la mano no dominante, levante la piel alrededor de la zona torácica y use tijeras para hacer una incisión.
Sujetando ambos extremos de la incisión, tire cuidadosamente hasta que los dos extremos de la incisión se encuentren en el estómago. Luego, coloque al ratón en posición supina y use una mano para tirar de la mitad inferior de la piel hacia abajo hasta que las patas queden expuestas. Sosteniendo el pie, corte los tendones de Aquiles por encima de la articulación del tobillo y los ligamentos que conectan los músculos con el pie en el extremo inferior de la tibia, para soltar el pie de los huesos de la pata.
Manteniendo la pata elevada, retire los músculos y ligamentos alrededor de la articulación de la rodilla en el extremo inferior del fémur para separar los músculos del muslo de la pierna inferior. Usando pinzas, tire suavemente de los músculos sueltos alejándolos de las superficies fibular y femoral. Luego, presionando las tijeras en posición abierta en la articulación de la cadera, gire la pata y tire suavemente del fémur para separar el hueso de la pata de la articulación de la cadera mientras corta la pata libre del cuerpo.
Sujetando ahora la pata por el extremo de la cadera con una pinza estéril, utilice otra pinza para separar el pie del extremo del tobillo. Luego, sujetando el extremo distal del fémur con una pinza y el extremo proximal de la tibia y el peroné con otra, doble cuidadosamente la tibia y el peroné en dirección opuesta a la articulación de la rodilla para separar la pierna inferior del fémur y la rótula. Utilice la pinza para eliminar los ligamentos, músculos y el peroné restantes de los huesos de la pierna inferior y coloque la tibia limpia sobre la tapa invertida de una placa de Petri que contenga uno a dos mililitros de HBSS/FCS.
Sujetando el extremo inferior del fémur con un par de pinzas y la rótula con otro par, doble la rodilla y los tejidos circundantes en dirección opuesta para extraer la articulación. A continuación, retire cualquier tejido conectivo restante del fémur y coloque el hueso sobre la tapa invertida de la placa de Petri. Cuando se hayan extraído todos los huesos, utilice pinzas para limpiar cualquier tejido residual aún adherido a los huesos y sumérjalos en 10 mililitros de HBSS/FCS dentro de la base de la placa de Petri.
Manteniendo el recipiente parcialmente protegido con una tapa estéril, corte con tijeras cada hueso limpio por la mitad. Luego, utilice una jeringa de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 26,5, para lavar un mililitro de HBSS/FCS desde el recipiente hacia el extremo de cada fragmento óseo hasta que se haya liberado toda la médula roja. Pase cualquier grumo visible de médula ósea a través de la jeringa varias veces para obtener una suspensión de células individuales, seguido de una mezcla completa con una pipeta de 10 mililitros.
Transfiera las células a un tubo de recolección y enjuague la placa de Petri una vez con cinco mililitros de HBSS/FCS para recoger cualquier célula residual. Luego, reúna el lavado en el tubo de recolección y coloque las células en hielo. Para establecer un cultivo de células de médula ósea, centrifugue las células recolectadas y aspire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio estéril conectada a succión al vacío.
Suelte el sedimento rico en glóbulos rojos golpeando suavemente. Luego, agregue 10 mililitros de tampón de lisis de GR y re suspenda las células mediante vortex. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, detenga la lisis con 10 mililitros de HBSS/FCS y centrifugue las células, re suspendiendo el sedimento en medio de células de médula ósea.
Cuente el número de células viables mediante la exclusión con azul de tripano y transfiera las células necesarias a un tubo nuevo con medio para células de médula ósea. A continuación, recupere las células por centrifugación y resuspenda el sedimento en una dilución de cuatro millones de células por mililitro en medio para células de médula ósea con 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF. Luego, agregue 9,5 mililitros de medio para células de médula ósea suplementado con 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a cada placa de Petri bacteriológica estéril por cultivo y añada 500 microlitros de células al centro de cada placa.
Incube las células a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2. En el día tres, agregue 10 mililitros de medio fresco para médula ósea suplementado con 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a cada cultivo, teniendo cuidado de minimizar cualquier perturbación a las células. En el día seis, transfiera cuidadosamente 10 mililitros de sobrenadante del cultivo celular a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.
Centrifugar las células y resuspender el sedimento en 10 mililitros de medio fresco para células de médula ósea, que contenga 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF. Luego, agitar suavemente la suspensión celular y devolver las células a la placa de cultivo. En el día uno, las células de la médula ósea son pequeñas y escasas, pero para el día tres, el número y tamaño de las células han aumentado, y algunas ya han comenzado a adherirse.
Al sexto día, hay más células y se observan fracciones adherentes y no adherentes. El cultivo puede cosecharse desde el día siete hasta el diez y seleccionarse por tamaño y células viables, obteniéndose un mayor porcentaje de células positivas para CD11c a partir de los cultivos del día diez. Al séptimo día, la fracción no adherente recolectada está altamente enriquecida en células con morfología dendrítica.
Las poblaciones positivas para CD11c y negativas para GR1, recolectadas en los días siete y diez, pueden dividirse en tres poblaciones principales. Macrófagos, células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras según la expresión de MHCII y la unión de FL-HA. Curiosamente, MerTK, aunque se considera un marcador de macrófagos, exhibe una expresión robusta tanto en las poblaciones de macrófagos como de células dendríticas inmaduras, recolectadas en los días siete y diez, con un bajo nivel de expresión observado en las células dendríticas maduras.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar el uso de técnicas estériles durante toda la extracción de médula ósea y el cultivo celular. Después de seguir este procedimiento, las células también pueden separarse para examinar las poblaciones celulares por separado, o pueden estimularse con agentes inflamatorios y analizarse posteriormente en cuanto a su producción de citoquinas mediante tinción intracelular y citometría de flujo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células de la médula ósea y cultivarlas en GM-CSF para generar tanto células dendríticas como macrófagos similares a los alveolares.
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Descripción general
Este estudio se centra en la generación y diferenciación de macrófagos similares a los alveolares a partir de células dendríticas mediante cultivos in vitro de células de médula ósea de ratón suplementados con GM-CSF. El método permite obtener un número suficiente de células y contribuye a comprender las funciones de estas células inmunitarias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Neurociencia
Antecedentes
- Las células de médula ósea pueden cultivarse con GM-CSF para producir macrófagos y células dendríticas.
- Los macrófagos generados en este cultivo se asemejan a los macrófagos alveolares.
- La diferenciación entre estos tipos celulares es fundamental para la investigación.
- La técnica podría tener implicaciones terapéuticas para la proteinosis pulmonar.
Objetivo del estudio
- Generar macrófagos similares a los alveolares a partir de células de la médula ósea.
- Diferenciar estos macrófagos de las células dendríticas.
- Facilitar la investigación sobre las funciones de estas células inmunitarias.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células de médula ósea murina con GM-CSF.
- Uso de la unión a MHCII y ácido hialurónico (HA) para la diferenciación.
- Aislamiento y lavado de huesos limpios para la extracción de células.
- Demuestras visuales para facilitar la comprensión del método.
Resultados principales
- El método genera con éxito una cultura heterogénea de macrófagos y células dendríticas.
- Los macrófagos exhiben características similares a las de los macrófagos alveolares.
- Se logra una clara diferenciación entre los tipos celulares mediante el uso de marcadores específicos.
- La técnica puede producir un número suficiente de células para fines de investigación.
Conclusiones
- Este método in vitro es eficaz para estudiar macrófagos similares a los alveolares.
- Proporciona información sobre los roles de los macrófagos y las células dendríticas.
- Los hallazgos podrían contribuir a estrategias terapéuticas para enfermedades pulmonares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la generación escalable de macrófagos y células dendríticas similares a los alveolares a partir de médula ósea de ratón, abordando un cuello de botella clave en la investigación inmunológica: la disponibilidad limitada de células primarias. Al proporcionar un sistema in vitro reproducible que imita fenotónica y funcionalmente a los macrófagos alveolares residentes en tejidos, apoya la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas y en la modelización preclínica de las respuestas inmunitarias pulmonares. El enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al permitir una interrogación consistente del papel de los macrófagos y las células dendríticas en las vías de defensa del huésped y en la inflamación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas que implican la función de los macrófagos alveolares en la inmunidad y la inflamación pulmonar.
- Valor operativo: Proporciona una fuente renovable de macrófagos y células dendríticas con fenotipo definido para el análisis de interacción con dianas y vías moleculares.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la modelización de respuestas de macrófagos similares a los alveolares humanos en un sistema in vitro controlado.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera poblaciones celulares estandarizadas adecuadas para cribado de alto contenido de compuestos inmunomoduladores.
- Valor operativo: Permite la reproducibilidad del ensayo mediante una diferenciación constante utilizando los marcadores MHCII y FL-HA para delimitar subconjuntos de macrófagos frente a células dendríticas.
- Escalabilidad: Permite la producción de un número suficiente de células para la optimización de ensayos y el cribado de bibliotecas de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia traslacional: Modela la biología de los macrófagos alveolares relacionada con enfermedades pulmonares como la proteinosis, facilitando las pruebas de eficacia preclínicas.
- Continuidad mecanicista: Conecta hallazgos de descubrimiento con la validación preclínica al mantener la fidelidad fenotípica respecto a los macrófagos residentes en tejidos.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación mecanicista de los efectos de compuestos sobre la función de células inmunitarias innatas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, ofreciendo una plataforma renovable para programas centrados en inmunología. Permite ciclos iterativos de pruebas en los que pueden analizarse, validarse y trasladarse a modelos relevantes para la enfermedad los fenotipos de macrófagos y células dendríticas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre mecanismos inmunitarios innatos mediante el uso de células derivadas de médula ósea murina genéticamente manipulables.
- Selección: Proporciona poblaciones celulares estandarizadas y listas para ensayos, con resultados cuantificables mediante citometría de flujo utilizando los marcadores CD11c, MHCII y FL-HA.
- Análisis: Permite la comparación cuantitativa de las respuestas de subpoblaciones celulares mediante estrategias de selección definidas y perfiles de expresión de marcadores.
- Investigación Traducional: Modela fenotipos de macrófagos alveolares para apoyar la continuidad en la investigación inmunitaria pulmonar y en la selección de terapias.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable y escalable para equipos de inmunología que estudian la función de células mieloides en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la dependencia de macrófagos alveolares primarios escasos.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de diferenciación inducida por citocinas y de inmunofenotipado.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia de los recursos y reduce la variabilidad en campañas de cribado inmunológico.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización basada en datos de candidatos inmunomoduladores según sus efectos mecanicistas en modelos celulares relevantes para el ser humano.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la obtención de médula ósea de ratón, cultivo celular estéril y citometría de flujo.
- Depende del acceso a cabinas de seguridad biológica, centrífugas y equipos de clasificación celular por fluorescencia.
- Necesita la estandarización de la concentración de GM-CSF y la duración del cultivo entre diferentes centros para obtener resultados reproducibles.
- La adaptación a sistemas humanos o modelos de enfermedad puede requerir la validación de la conservación de marcadores y la equivalencia funcional.
- La heterogeneidad del cultivo requiere estrategias de selección robustas para aislar subpoblaciones puras de macrófagos y células dendríticas para aplicaciones posteriores.
