Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

El objetivo general de este procedimiento es fabricar una cubierta de complejación de polielectrolitos. Un portador que puede atrapar y regular la liberación de una amplia gama de factores de crecimiento con un dominio de unión a la heparina. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos ortopédicos para un atrapamiento eficiente y la administración de factores de crecimiento dedicados.

Las principales ventajas de esta técnica es que no requiere el uso frecuente de productos orgánicos. Lo que se sabe que afecta las actividades biológicas de los factores de crecimiento. Disuelva 200 miligramos de alginato de sodio no irradiado o 400 miligramos de alginato de sodio irradiado de ocho megarad en 10 mililitros de agua bidestilada.

Y agitar durante una hora. Almacene la solución de alginato a cuatro grados centígrados durante la noche. Filtre la solución de alginato con un filtro de jeringa estéril de 0,2 micras antes de la fabricación de microesferas de alginato.

Desinfecte el generador electrostático de BE y la bomba de jeringa con etanol al 70% y colóquelos en un gabinete de seguridad biológica de clase dos. A continuación, coloque un recipiente de vidrio con una barra agitadora magnética dentro del generador BE. Coloque el electrodo del brazo del generador BE a nueve centímetros por encima de la cuenca.

Conecte el cable del electrodo del generador BE al tornillo neurológico dos del electrodo del brazo. Y vierta 80 mililitros de solución de cloruro de estroncio en el recipiente. A continuación, cargue cinco mililitros de solución de alginato filtrado de 0,2 micras en la jeringa en un tubo de goma.

Después de conectar el tubo de goma al electrodo del brazo, encienda la bomba de jeringa a cinco mililitros por hora. Durante dos minutos. Para expulsar el aire dentro del tubo y entregar la solución de alginato a la punta de la boquilla.

Luego, apague la bomba de jeringa. Para comenzar la generación de microperlas, configure el encapsulador a 5,8 kilovoltios. Seguido de la bomba de jeringa a un caudal de alginato de cinco mililitros por hora.

Deseche las microperlas generadas durante los primeros dos minutos, ya que estas microperlas tienden a tener un tamaño y una forma irregulares. Recoja las microperlas posteriores en la solución de cloruro de estroncio 0,2 molar. Apague la bomba de jeringa seguida del encapsulador.

Después de bombear el volumen preplanificado de solución de alginato. Repita esto para los lotes posteriores de fabricación de microperlas. Almacene las microperlas en 20 mililitros de solución de cloruro de estroncio 0,2 molar a cuatro grados centígrados durante la noche para completar la reticulación y estabilizar el gel.

Recoja 0,5 mililitros de microesferas de alginato con una pipeta de plástico. Y colócalo en un portaobjetos de vidrio. Observe las microperlas bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x.

Tome 10 imágenes de las microperlas con una cámara CCD de microscopio. Guarde las imágenes con una barra de escala de 500 micras en formato TIFF con una resolución de 2048 por 1536. Usando las herramientas de longitud en la imagen J, mida el tamaño de las microcuentas.

Y la barra de escala. A continuación, convierta la longitud de las microperlas de píxeles a micrómetros. Haz clic en las herramientas de línea y dibuja una línea en el centro de la cuenta de alginato.

Haga clic en analizar en la barra de menú y seleccione medir. Aparecerá una ventana emergente. Repita estos pasos para medir todas las perlas de alginato dentro de la imagen.

Mide la barra de escala en la imagen. Recoja las microperlas con el colador de nailon de 100 micras. Y lavar las cuentas con agua destilada doble.

Con una espátula, transfiera todas las microperlas hechas con 0,1 mililitros de la solución de alginato a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y cúbralo con una gasa para evitar que se seque. Finalmente, esterilice las microperlas mediante corte automático usando el modo líquido o de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Agregue 1,5 litros de agua destilada a la cámara para evitar que las perlas se sequen.

Dentro de la campana BSL2, incube las microperlas estériles con un mililitro de solución de protamina esterilizada de dos miligramos por mililitro durante una hora a temperatura ambiente. Lave las microperlas recubiertas de protamina dos veces con agua destilada doble. A continuación, gire hacia abajo, utilizando una centrífuga de sobremesa a 200 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, aspire el agua con una jeringa. Incubar microperlas recubiertas de protamina con un mililitro de solución de heparina esterilizada de 0,5 miligramos por mililitro durante 30 minutos. Esto crea una capa de complejación de polielectrolitos con ávida afinidad por los factores de crecimiento que se unen a la heparina.

Después de la incubación, aspire la hepraína con una jeringa. Y lavar la heparina no unida de los complejos de polielectrolitos lavando dos veces con agua destilada doble. Cargue 13,3 microlitros de 1,5 miligramos por mililitro de proteína morfogenética ósea 2 o molécula similar NELL 1 en 100 microgramos del complejo polielectrolítico.

Incubar el complejo de polielectrolito a cuatro grados centígrados a 30 RPM, agitando durante 10 horas. A continuación, sumerja las microperlas en un mililitro de solución salina tamponada con fosfato, o PBS, a 37 grados centígrados con agitación constante. Recoja un mililitro del sobrenadante y reemplácelo por un mililitro de PBS después de uno, tres, seis, 10 y 14 días.

Evalúe la eficiencia de absorción y liberación de la molécula similar a NELL uno utilizando el método de ensayo de proteínas CBQCA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Alternativamente, realice elisa. La bioactividad de la molécula similar a NELL liberada del complejo polielectrolítico se evalúa midiendo su capacidad para aumentar la expresión de fosfatasa alcalina en células madre de médula ósea de conejo.

Siembra 20.000 células madre de médula ósea de conejo por pocillo en una placa de 24 pocillos. Y déjalos crecer durante un día con un mililitro de medio de águila modificada de dulbecco más un 10% de suero fetal bovino a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Después de 24 horas, reemplace el medio con un mililitro de un medio osteogénico durante siete días a 37 grados centígrados.

Y 5%CO2. Coloque 300 microgramos de complejo de polielectrolito y complejo de polielectrolito NELL como molécula uno dentro de los insertos de cultivo celular para mantener los complejos separados de las células. Coloque el inserto en la placa de 24 pocillos para evitar el lavado de las microperlas del complejo de polielectrolito durante el cambio de medio osteogénico.

Una vez cada tres días, aspire un mililitro del medio osteogénico colocando una aguja fuera del inserto. Y reemplácelo con un mililitro de medio osteogénico fresco. Después de siete y 14 días de incubación, determine la actividad de la fosfatasa alcalina con un kit de ensayo de fosfatasa alcalina.

De acuerdo con el protocolo del fabricante del kit. Empaque los complejos de polielectrolitos en los poros de un andamio de fosfato tricálcico de policaprolactona de grado médico biorreabsorbible. Usando una espátula esterilizada dentro de una cámara BSL2.

Agregue una solución de 1,5 miligramos o mililitros de proteína morfogenética ósea dos o una molécula similar a NELL en el andamio lleno de complejo polielectrolítico. E incubar toda la noche a 4 grados centígrados. Las microperlas de alginato se inspeccionan bajo un microscopio para controlar su tamaño y morfología.

Las microesferas de alginato no irradiadas son esféricas y la contraparte irradiada tiene forma de lágrima. La distribución del tamaño es un factor importante de la absorción del factor de crecimiento. Y la reducción del tamaño aumenta la relación superficie-área.

Al medir microperlas de alginato con el software image J, un promedio de 100 microperlas proporciona una buena estimación de la distribución del tamaño en cada coincidencia de microperlas. Dado que la absorción del factor de crecimiento depende de la técnica de recubrimiento adecuada, el espesor de la capa de cada recubrimiento se observa mediante microsopía confocal. Aquí, se muestran imágenes de microscopía de escaneo láser confocal de microperlas de alginato incubadas con análogos fluorescentes de protamina, heparina, molécula similar a NELL uno y proteína morfogenética ósea dos.

La actividad de la fosfatasa alcalina se utiliza para medir la bioactividad del factor de crecimiento liberado. Se observó un aumento de 2,2 veces en la actividad de la fosfatasa alcalina después de la incubación con el complejo polielectrolítico NELL similar a la molécula uno el día 14. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las concentraciones de alginato afectan la estabilidad de las microperlas. Para los alginatos irradiados, requerimos un porcentaje de cuatro vías. Para las contrapartes no irradiadas, requerimos un porcentaje de dos vías.

Siguiendo estos procedimientos, podemos aumentar aún más la carga del factor de crecimiento mediante el recubrimiento multicapa. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos explorar la administración del factor de crecimiento en otros modelos de enfermedades. Después de ver este video, puede fabricar un complejo de polielectrolito con una distribución de tamaño estrecha.