Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

El objetivo general de este ensayo es determinar los efectos de tratamientos de interés sobre la adhesión celular bajo condiciones de estrés cortante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de células inmunitarias, como, por ejemplo, qué factores median la activación de las integrinas. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden estudiar pares individuales de moléculas de adhesión, integrinas, en un sistema de flujo fácilmente reproducible.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la activación de LFA1, también puede aplicarse al estudio de otras integrinas. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la configuración técnica debe ejecutarse con precisión. Para recoger las células CHO-ICAM, trate el cultivo con tripsina EDTA al 0,5 % durante un minuto a temperatura ambiente con agitación suave.

Cuando las células comiencen a desprenderse, neutralice la tripsina con cuatro mililitros de medio fresco y cuente el número de células disociadas. Diluya las células hasta una concentración de 0,75 veces 10 a la quinta células por cámara y centrifúguelas. A continuación, re suspenda el sedimento en 30 microlitros por cámara de flujo, en medio de cultivo completo CHO-ICAM, y siembre lentamente alícuotas de 30 microlitros de células por reservorio de la cámara de flujo.

Incube las células en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos. Luego añada 200 microlitros de medio de cultivo completo en ambos depósitos de cada cámara y regrese la placa al incubador para un cultivo nocturno. Después de recolectar los linfocitos T, cuente y diluya la suspensión celular hasta una concentración de dos veces 10 a la sexta células por cámara.

Luego, centrifugar las células y resuspender el precipitado en un mililitro de PBS, suplementado con 1 % de glucosa por dos veces diez a la sexta células T. A continuación, marcar las células T en una dilución 1:1000 de CFSE protegida de la luz durante ocho minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, centrifugar las células y resuspender el precipitado en 240 microlitros de medio RPMI sin suero por cámara.

Luego, separe las células en un tubo de 1,5 mililitros por cada cámara y almacene los tubos en un bloque térmico a 37 grados Celsius hasta el momento de cargarlos. Antes de la adquisición de imágenes, caliente la cámara de adquisición en vivo del microscopio a 37 grados Celsius y llene una botella de vidrio de 500 mililitros con agua. Haga dos orificios en la tapa etiquetados como entrada y salida, y pase la manguera de conexión de la jeringa a través del orificio de entrada, y la manguera de conexión del depósito de entrada a través del orificio de salida.

Utilice una jeringa de 60 mililitros para lavar la manguera de entrada con 60 mililitros de agua, seguido de 60 mililitros de medio sin suero a 37 grados Celsius para eliminar cualquier aire del sistema. Una vez que la manguera esté cebada, transfiera todo el sistema de entrada a la cámara de imagen en vivo del microscopio para mantener el sistema a 37 grados Celsius. Pase la manguera y la jeringa fuera de la cámara y coloque la jeringa en la bomba de jeringa.

A continuación, haga un orificio en la tapa de un frasco de 250 mililitros para utilizarlo como recipiente de desecho de salida y pase el tubo de salida a través del orificio hacia el interior del frasco. Luego sujete ligeramente la tapa del frasco de salida y coloque todo el conjunto de salida dentro de la cámara de imagen en vivo. Ahora coloque la portaobjetos de la cámara de flujo sobre la platina del microscopio y utilice el objetivo de 20X para ajustar el plano focal sobre la monocapa de CHO ICAM.

Luego, comenzando con el control no estimulado, deseche tres volúmenes de 70 microlitros del depósito de salida de la primera cámara y agregue tres volúmenes de 70 microlitros de linfocitos T marcados con CFCS al depósito de entrada. Mientras los linfocitos T se desplazan desde la entrada hasta la salida, capture imágenes de cinco campos aleatorios de linfocitos T positivos para CFSE en cada cámara para obtener los recuentos celulares previos al flujo. A continuación, conecte simultáneamente las mangueras de entrada y salida a los depósitos de la cámara de flujo, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire, e inicie el flujo con estrés cortante a 0,3 mililitros por minuto, continuando al mismo tiempo la visualización de los linfocitos T marcados con CFSC.

En cuanto se observe el movimiento de las células T, inicie un cronómetro durante cinco minutos, deteniendo el flujo al finalizar este período. Luego, obtenga imágenes de cinco campos de células positivas para CFSE en cada cámara, seleccionando los campos al azar para obtener los conteos celulares posteriores al flujo. Para la estimulación con PMA, estimule un tubo de células T con PMA para utilizarlo como control positivo inmediatamente antes de cargar las células T en la segunda cámara de flujo para la adquisición de imágenes, tal como se acaba de demostrar.

Para la estimulación con SDF-1 alfa, primero retire tres alícuotas de 70 microlitros de medio del reservorio de salida de la tercera cámara, y luego agregue 70 microlitros de SDF-1 alfa al reservorio de entrada. Después de cinco minutos, deseche tres alícuotas de 70 microlitros del reservorio de salida, y agregue el tubo restante de linfocitos T para la obtención de imágenes, tal como se acaba de demostrar. En estas imágenes representativas, se observa un número similar de linfocitos T antes del flujo bajo las diferentes condiciones de estimulación.

Tras cinco minutos de estrés cortante continuo, el número de linfocitos T adheridos aumenta bajo las condiciones de estimulación con PMA y SDF-1 alfa, mientras que unos pocos linfocitos T no estimulados permanecen adheridos. De hecho, la activación de los linfocitos T con SDF-1 alfa, por ejemplo, induce un aumento cercano a dos veces en la adhesión de los linfocitos T, en comparación con las células de control no estimuladas. Además, cuando se calcula el porcentaje de adhesión de linfocitos T primarios humanos positivos para CD3 en presencia o ausencia de SDF-1 alfa, el 15 % de los linfocitos T no estimulados se adhieren bajo estrés cortante, en comparación con el 50 % de los linfocitos T bajo condiciones de activación con SDF-1 alfa.

Una vez dominada, esta técnica puede ampliarse razonablemente hasta seis cámaras experimentales en un solo ensayo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar únicamente con la monocapa confluente de ICAM. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de la forma celular, sobre las imágenes capturadas para responder preguntas adicionales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la adhesión celular bajo condiciones de estrés cortante. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.