Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

El objetivo general de este ensayo es determinar los efectos de los tratamientos de interés sobre la adhesión celular en condiciones de esfuerzo cortante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de las células inmunitarias, como por ejemplo, qué factores median la activación de la integrina. La principal ventaja de esta técnica es que los pares de integrinas de moléculas de adhesión simple se pueden estudiar en un sistema de flujo fácilmente replicable.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la activación de LFA1, también se puede aplicar al estudio de otras integrinas. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la configuración técnica debe ejecutarse con precisión. Para recolectar las células CHO-ICAM, trate el cultivo con EDTA al 0,5% de tripsina durante un minuto a temperatura ambiente con una agitación suave.

Cuando las células comiencen a desprenderse, neutralice la tripsina con cuatro mililitros de medio fresco y cuente el número de células disociadas. Diluya las células a una concentración de 0,75 veces 10 a la quinta célula por cámara y gírelas en una centrífuga. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 30 microlitros por cámara de flujo, en medio de cultivo CHO-ICAM completo, y siembre lentamente 30 microlitros de alícuotas de células por depósito de la cámara de flujo.

Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos. A continuación, añada 200 microlitros de medio de cultivo completo en ambos depósitos de cada cámara y devuelva la placa a la incubadora para el cultivo durante la noche. Después de recolectar las células T, cuente y diluya la suspensión celular a una concentración de dos veces 10 a la sexta célula por cámara.

A continuación, centrifugar las células y resuspender el pellet en un mililitro de PBS, suplementado con un 1% de glucosa por dos veces diez hasta la sexta célula T. A continuación, etiquete las células T en una dilución de 1 a 1000 de CFSE protegidas de la luz durante ocho minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, centrifugar las células y resuspender el pellet en 240 microlitros de medio RPMI sin suero por cámara.

A continuación, divida las celdas en un tubo de 1,5 mililitros por cada cámara y almacene los tubos en un bloque de calor a 37 grados centígrados hasta que se carguen. Antes de tomar imágenes, caliente la cámara de imágenes en vivo del microscopio a 37 grados centígrados y llene una botella de vidrio de 500 mililitros con agua. Haga dos orificios en la tapa etiquetados hacia adentro y hacia afuera, y pase la manguera de entrada de conexión de la jeringa a través del orificio de entrada y la manguera de conexión del depósito de entrada a través del orificio de salida.

Use una jeringa de 60 mililitros para enjuagar la manguera de entrada con 60 mililitros de agua, seguida de 60 mililitros de medio sin suero a 37 grados Celsius para eliminar el aire del sistema. Cuando la manguera esté cebada, transfiera toda la configuración de entrada a la cámara de imágenes en vivo del microscopio para mantener el sistema a 37 grados Celsius. Saque la manguera y la jeringa de la cámara y cargue la jeringa en la bomba de jeringa.

A continuación, haga un agujero en la tapa de una botella de 250 mililitros para que sirva como contenedor de residuos de salida y pase el tubo de salida a través del agujero hasta la botella. A continuación, asegure sin apretar la tapa de la botella de salida y coloque toda la configuración de salida en la cámara de imágenes en directo. Ahora coloque el portaobjetos de la cámara de flujo en la platina del microscopio y utilice el objetivo 20X para establecer el plano focal en la monocapa CHO ICAM.

Luego, comenzando con el control no estimulado, deseche tres volúmenes de 70 microlitros del depósito de salida de la primera cámara y agregue tres volúmenes de 70 microlitros de células T marcadas con CFCS al depósito de entrada. Mientras las células T se mueven desde la entrada hasta la salida, obtenga imágenes de cinco campos aleatorios de células T positivas para CFSE en cada cámara para obtener los recuentos de células de preflujo. A continuación, conecte simultáneamente las mangueras de entrada y salida a los depósitos de la cámara de flujo, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire, y comience el flujo de esfuerzo cortante a 0,3 mililitros por minuto, mientras continúa visualizando las células T teñidas con CFSC.

Tan pronto como se observe el movimiento de las células T, inicie un temporizador durante cinco minutos, finalizando el flujo al final del período de cinco minutos. A continuación, obtenga una imagen de cinco campos de células positivas para CFSE en cada cámara, eligiendo los campos al azar para obtener los recuentos de células posteriores al flujo. Para la estimulación de PMA, estimule un tubo de células T con PMA para que sirva como control positivo inmediatamente antes de cargar las células T en la segunda cámara de flujo para la obtención de imágenes, como se acaba de demostrar.

Para la estimulación de SDF-1 alfa, primero retire tres alícuotas de 70 microlitros de medio del depósito de salida de la tercera cámara y, a continuación, agregue 70 microlitros de SDF-1 alfa en el depósito de entrada. Después de cinco minutos, deseche tres alícuotas de 70 microlitros del depósito de salida y agregue el tubo restante de células T para la obtención de imágenes, como se acaba de demostrar. En estas imágenes representativas, se observa un número similar de linfocitos T antes del flujo en las diferentes condiciones de estimulación.

Después de cinco minutos de esfuerzo cortante continuo, el número de linfocitos T adherentes aumenta en las condiciones de estimulación de PMA y SDF-1 alfa, mientras que unos pocos linfocitos T no estimulados permanecen adheridos. De hecho, la activación de las células T alfa SDF-1, por ejemplo, induce un aumento de casi el doble en la adhesión de las células T, en comparación con las células de control no estimuladas. Además, cuando se calcula el porcentaje de adhesión de los linfocitos T positivos CD3 humanos primarios en presencia o ausencia de SDF-1 alfa, el 15% de los linfocitos T no estimulados se adhieren bajo estrés de cizallamiento, en comparación con el 50% de los linfocitos T bajo condiciones de activación de SDF-1 alfa.

Una vez dominada, esta técnica puede ampliarse razonablemente a seis cámaras experimentales en un ensayo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar solo con la monocapa ICAM confluente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de la forma de la celda, en las imágenes capturadas para responder a preguntas adicionales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la adhesión celular en condiciones de esfuerzo cortante. Gracias por ver este video y buena suerte con tus experimentos.