Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

El objetivo general de este procedimiento es aislar y expandir células mesenquimales estromales derivadas del tejido de placenta humana. Hola, soy Mike Doran. Soy líder de grupo en la Universidad Tecnológica de Queensland en el Instituto de Investigación Traslacional de Brisbane, Australia.

Hola, mi nombre es Rebecca Pelekanos, y soy investigadora en el Centro de Investigación Clínica de la Universidad de Queensland. Hoy, demostraré el procedimiento de aislamiento de CMM. La placenta normalmente se descarta después del parto.

Dado que el tejido tiene un peso de cinco a 700 gramos, constituye una fuente excepcionalmente amplia de células madre mesenquimales alogénicas. Por lo general, las personas que son nuevas en el aislamiento de células madre mesenquimales de la placenta tendrán dificultades porque no están familiarizadas con la anatomía de la placenta, con la forma de procesar el tejido ni con el tipo de células, maternas o fetales, que poblarán su cultivo final de células madre mesenquimales. Para ayudar a los investigadores, discutimos estos detalles importantes en este video.

El primer paso en este procedimiento consiste en familiarizarse con la anatomía de la placenta. El segundo paso es diseccionar manualmente 10 gramos de tejido de la decidua, las vellosidades coriónicas o la placa coriónica, utilizando tijeras. Los dos primeros pasos se resumen nuevamente aquí de forma esquemática.

En el paso tres, los tejidos de la decidua, las vellosidades coriónicas o la placa coriónica se trituran aún más en trozos pequeños con tijeras. En el paso cuatro, las células se liberan de los pequeños fragmentos de tejido mediante una digestión de una a dos horas con dispasa y colagenasa I. En el paso cinco, las células se separan del tejido fibroso lavándolas a través de un filtro celular. Luego, las células se recogen, se resuspenden en medio de cultivo y se colocan en frascos de cultivo.

Las células estromales mesenquimales, MSCs, se seleccionarán según su tendencia a adherirse al plástico y su capacidad para sobrevivir y proliferar en el medio de cultivo celular. Finalmente, en la sección de resultados, las MSC expandidas pueden caracterizarse y almacenarse para su uso en experimentos futuros. La placenta es un órgano temporal que permite el intercambio de nutrientes y productos de desecho entre el feto y la madre durante el embarazo.

La placenta se puede recolectar fácilmente de forma aséptica tras una sección cesárea y el parto seguro del bebé. La placenta está compuesta predominantemente por vasos sanguíneos y membranas de origen fetal. Sin embargo, también contiene algunas células maternas.

La placenta está conectada al útero tanto por células deciduales derivadas del tejido materno como por trofoblastos invasores derivados del feto. Por lo general, no es posible distinguir a simple vista la interfaz precisa entre los tejidos materno y fetal. Sin embargo, el lado fetal de la placenta se identifica fácilmente como el lado donde se encuentra el cordón umbilical.

Una vez que el bebé es expulsado, solo queda una capa delgada de tejido decidual conectada a la placenta. Mediante la orientación física de la placenta, es posible identificar los tres tejidos que cosecharemos hoy. El primer tejido que se cosechará es la decidua materna.

El marcador verde señala el tejido decidua que permanece en la superficie tras la expulsión de la placenta de la pared uterina. El segundo tejido que se obtendrá del interior de la placenta son las vellosidades coriónicas fetales. Esto se indica mediante los círculos azules en los diagramas.

El tercer tejido que se obtendrá será la placa coriónica fetal. Este tejido se identifica mediante los marcadores rojos en los diagramas. Bien, comencemos.

Coloque la placenta en la cabina de seguridad biológica. Extienda las membranas fetales y oriente las partes de la placenta. El lado fetal con la inserción del cordón umbilical, el corioamniótico laeve o el saco amniótico.

La superficie fetal de la placenta presenta vasos sanguíneos grandes evidentes en la placa coriónica, con la membrana amniótica sobreyacente, que, nuevamente, se separa fácilmente mediante procedimientos mecánicos. El lado materno es opuesto al lado fetal, con cotiledones o lóbulos evidentes. Asegúrese de que la superficie materna quede orientada hacia arriba.

Corte trozos de 0,5 cm de grosor desde el lado materno de la placenta o del decidua. Durante las disecciones, coloque los trozos de tejido en una placa de Petri que contenga solución salina balanceada de Hank (HBSS) para mantener los tejidos húmedos. Agite los tejidos en las placas con HBSS para eliminar algo de sangre.

Transfiera suficiente tejido para llenar el tubo hasta la marca de 10 mililitros de un tubo de 50 mililitros, aproximadamente 10 gramos. Tenga en cuenta que se puede aislar más tejido en esta etapa si se requieren más células al final del procedimiento. Asegúrese de que la superficie fetal esté orientada hacia arriba.

Retire mecánicamente la membrana amniótica de la superficie fetal de la placenta, dejando intacta la lámina coriónica. Corte la lámina coriónica en tiras de aproximadamente medio centímetro de profundidad en el tejido de vellosidades debajo. Luego, diseccione el tejido de vellosidades coriónicas aproximadamente un centímetro de profundidad en la placenta desde donde se ha eliminado la lámina coriónica.

Coloque los tejidos en HBSS y mida aproximadamente 10 mililitros del tejido como se hizo previamente. Transfiera los trozos de tejido, con transferencia mínima de líquido, a una placa de Petri de 10 centímetros y córtelos en trozos finos de aproximadamente un milímetro cúbico, con tijeras. Transfiera el tejido picado nuevamente al tubo de 50 ml.

Repita el procedimiento para todas las muestras de tejido restantes. Añada el medio de digestión recién preparado en una proporción de al menos uno a uno con el tejido. Invierta el tubo varias veces para mezclar.

Incube los tejidos en el tubo con el medio de digestión durante una a dos horas, a 37 grados en un incubador con agitación. Cuando la solución de digestión del tejido haya cambiado a una apariencia turbia y los vasos sanguíneos blancos sean evidentes en la solución, agregue 15 mililitros de HBSS para diluir las enzimas en el medio de digestión. Centrifugue brevemente las muestras solo hasta que la centrifugadora alcance 340 g durante cinco segundos, y luego detenga.

Esto hará que los residuos grandes se acumulen en el fondo del tubo. Devuelva las muestras a la cabina de seguridad biológica. Coloque un filtro celular en un tubo nuevo de 50 mililitros.

Aspire el sobrenadante que contiene las células mononucleares hacia el filtro, recogiendo el eluato en el nuevo tubo. Deje los restos de tejido placentario en el primer tubo. Añada 15 mililitros de HBSS al residuo placentario, agite vigorosamente para recuperar más células y realice una centrifugación pulsada de la muestra.

Nuevamente, aspire el sobrenadante con la pipeta y transfiéralo al tubo con el filtro celular en el tubo de recolección. Verter el sobrenadante en el filtro celular puede ser más adecuado, dependiendo de la consistencia de la muestra. Lave el filtro celular con 5 mililitros de HBSS.

Deseche el tubo que contiene los restos de tejido placentario. Centrifugue la muestra del sobrenadante durante cinco minutos a 340 g para obtener un sedimento celular. Los glóbulos rojos son visibles como una capa en la parte inferior del sedimento, y las células mononucleares, incluidas las CMM, forman la capa superior más clara sobre los glóbulos rojos.

Devuelva las muestras a la cabina de seguridad biológica. Deseche cuidadosamente el sobrenadante. Agite el tubo varias veces con un dedo para despegar el botón celular y re suspenda el botón celular en 35 mililitros de medio para MSC.

Transfiera la suspensión celular a un matraz T175 por cada 10 mililitros de tejido y cultive en un incubador a 37 grados con 5% de CO2. Después del aislamiento, cambie el medio de cultivo a las 48 horas. Alimente los cultivos una vez por semana hasta alcanzar confluencia.

Los cultivos deben estar confluentes aproximadamente a los 14 días. Finalmente, amplíe y criopresérvese las células, analice las características de las CMM y utilícelas en experimentos. Tras 48 horas de cultivo, las CMM se habrán adherido al plástico para cultivo de tejidos, mientras que las poblaciones de células hematopoyéticas y otras no lo habrán hecho.

En este momento, el medio se reemplaza con 35 mililitros de medio de cultivo fresco. La apariencia del sobrenadante del cultivo puede variar considerablemente entre donantes de placenta. El ejemplo uno y dos demuestran esta variación.

Estas dos aislamientos se realizaron simultáneamente, pero a partir de dos placentas diferentes. Una vez lavadas, las culturas están libres de glóbulos rojos y restos de tejido, como se muestra en el ejemplo tres, y los resultados posteriores de expansión son generalmente consistentes. Después del cambio de medio a las 48 horas, solo unas pocas células están adheridas al frasco.

Siete días después del aislamiento, son visibles colonias de MSC fibroblásticas, aunque también están presentes células no MSC, como células redondeadas o débilmente adheridas. Trece días después del aislamiento, las colonias de MSC fibroblásticas son grandes, y a menudo el monocapa de MSC es suficientemente confluyente y está listo para ser pasado. A partir del primer pase en adelante, el monocapa de MSC desarrolla una morfología característica similar a un remolino al alcanzar la confluencia.

Las CMM de la placenta muestran un perfil clásico de marcadores de CMM mediante análisis de citometría de flujo. Las células son positivas para CD73, CD105 y CD90, y negativas para los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34 y HLA-DR. Las CMM de la placenta generalmente experimentan una diferenciación osteogénica robusta, pero una diferenciación adipogénica deficiente.

Muchas publicaciones asumen que las células aisladas del corion fetal producen MSC fetales tras el cultivo. Sin embargo, como hemos informado previamente, todos los cultivos derivados del corion fetal utilizando este protocolo se enriquecen rápidamente con MSC maternos, tal como se esperaría en cultivos de MSC deciduales maternos. Los datos mostrados aquí cuantifican la composición celular fetal y materna de los cultivos de MSC placentarios aislados de tejidos deciduales, vellosidades coriónicas y placas coriónicas.

Después de ver este video, debería tener una idea bastante clara de cómo aislar y cultivar CMM derivadas de tejido placentario. Esperamos que estos métodos le resulten útiles en sus investigaciones y aplicaciones clínicas que puedan utilizar CMM derivadas de la placenta.