Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

El objetivo general de este procedimiento es aislar y expandir las células estromales del estroma mesenquimal derivadas del tejido de la placenta humana. Hola, soy Mike Doran. Soy líder de grupo en el Instituto de Investigación Traslacional de la Universidad Tecnológica de Queensland en Brisbane, Australia.

Hola, mi nombre es Rebecca Pelekanos y soy investigadora en el Centro de Investigación Clínica de la Universidad de Queensland. Hoy voy a hacer una demostración del procedimiento de aislamiento de MSC. Normalmente, la placenta se desecha después del parto.

Debido a que el tejido pesa de cinco a 700 gramos, ofrece una fuente única de células madre mesenquimales alogénicas. Por lo general, las personas que son nuevas en el aislamiento de MSC placentario tendrán dificultades porque no están familiarizadas con la anatomía de la placenta y no están familiarizadas con cómo procesar el tejido y no están familiarizadas con qué tipo de células, maternas o fetales, poblarán su cultivo final de MSC. Para ayudar a los investigadores, discutimos estos detalles importantes en este video.

El primer paso en este procedimiento es orientarse con la anatomía de la placenta. El segundo paso en este procedimiento es diseccionar manualmente 10 gramos de tejido de la decidua, las vellosidades coriónicas o la placa coriónica, usando tijeras. Los dos primeros pasos se resumen de nuevo aquí de forma esquemática.

En el paso tres, la decidua, las vellosidades coriónicas o los tejidos de la placa coriónica se pican en trozos finos con unas tijeras. En el paso cuatro, las células se liberan de los pequeños trozos de tejido a través de una digestión de una a dos horas en dispasa y colagenasa I.In paso cinco, las células se separan del tejido fibroso lavándolas a través de un colador de células. A continuación, se recogen las células, se resuspenden en un medio de cultivo y se colocan en matraces de cultivo.

Las células estromales mesenquimales, MSC, se seleccionarán en función de su propensión a la adherencia plástica y su capacidad para sobrevivir y proliferar en el medio de cultivo celular. Finalmente, en la sección de resultados, el MSC expandido se puede caracterizar y almacenar para su uso en futuros experimentos. La placenta es un órgano temporal que permite el intercambio de nutrientes y productos de desecho entre el feto y la madre durante el embarazo.

La placenta se puede recoger fácilmente de forma aséptica después de la cesárea y el parto seguro del bebé. La placenta está compuesta predominantemente por vasculatura y membranas derivadas del feto. Sin embargo, también contiene algunas células maternas.

La placenta está conectada al útero tanto por células deciduales maternas derivadas del útero como por trofoblastos invasores derivados del feto. Por lo general, no es posible discernir a simple vista la interfaz precisa entre los tejidos maternos y fetales. Sin embargo, el lado fetal de la placenta se identifica fácilmente como el lado donde se encuentra el cordón umbilical.

Cuando el bebé nace, solo queda una capa delgada de tejido decidual conectado a la placenta. A través de la orientación física de la placenta, es posible localizar los tres tejidos que vamos a recolectar hoy. El primer tejido que se recolectará es la decidua materna.

El marcador verde señala el tejido decidual que permanece en la superficie después de que la placenta se desprende de la pared uterina. El segundo tejido que se extrae del interior de la placenta son las vellosidades coriónicas fetales. Esto se indica mediante los círculos azules en los diagramas.

El tercer tejido a recolectar será la placa coriónica fetal. Este tejido se identifica por los marcadores rojos en los diagramas. Bien, comencemos.

Coloque la placenta en el gabinete de seguridad biológica. Abre las membranas fetales y oriéntate con las partes de la placenta. El lado fetal con la inserción del cordón umbilical, el cojeo corioamniótico o el saco amniótico.

La superficie fetal de la placenta tiene grandes vasos sanguíneos evidentes en la placa coriónica, con una membrana amniótica suprayacente, que, de nuevo, se separa fácilmente mecánicamente. El lado materno es opuesto al lado fetal, con los obvios cotiledones o lóbulos. Asegúrese de que la superficie materna esté hacia arriba.

Cortar trozos de 0,5 cm de grosor del lado materno de la placenta o decidua. Durante las disecciones, coloque los trozos de tejido en una placa de Petri que contenga la solución salina equilibrada de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés) para mantener los tejidos húmedos. Agite los pañuelos de papel en los platos con HBSS para eliminar un poco de sangre.

Transfiera suficiente tejido para llenar el tubo hasta la marca de 10 mililitros de un tubo de 50 mililitros, aproximadamente 10 gramos. Tenga en cuenta que se puede aislar más tejido en esta etapa si se requieren más células al final del procedimiento. Asegúrese de que la superficie fetal esté hacia arriba.

Extraer mecánicamente la membrana amniótica de la superficie fetal de la placenta, dejando intacta la placa coriónica. Corta la placa coriónica en tiras de aproximadamente medio centímetro de profundidad en el tejido de las vellosidades que se encuentra debajo. Luego, diseccione el tejido de las vellosidades coriónicas aproximadamente un centímetro de profundidad en la placenta de donde se ha extraído la placa coriónica.

Coloque los tejidos en HBSS y mida aproximadamente 10 mililitros del tejido como se hizo anteriormente. Transfiera los trozos de tejido, con una transferencia mínima de líquido, a una placa de Petri de 10 centímetros y corte en trozos finos de aproximadamente un mililitro cúbico, con unas tijeras. Transfiera el pañuelo picado nuevamente al tubo de 50 milésimas de pulgada.

Repita el procedimiento para todas las muestras de tejido restantes. Agregue el medio de digestión recién preparado en al menos una proporción de uno a uno con el pañuelo. Invierta el tubo varias veces para mezclar.

Incubar los tejidos en el tubo con medios de digestión durante una o dos horas, a 37 grados en una incubadora agitadora. Cuando la solución de digestión del tejido haya cambiado a una apariencia turbia y los vasos sanguíneos blancos sean obvios en la solución, agregue 15 mililitros de HBSS para diluir las enzimas en el medio de digestión. Centrifugar brevemente las muestras solo hasta que la centrífuga alcance los 340 g durante cinco segundos y luego detenerse.

Esto obligará a que los residuos grandes se acumulen en el fondo del tubo. Devuelva las muestras a la cabina de seguridad biológica. Coloque un colador de células en un tubo nuevo de 50 mililitros.

Pipetear el sobrenadante que contiene las células mononucleares en el filtro, atrapando el eluido en el nuevo tubo. Deje los restos de tejido placentario en el primer tubo. Agregue 15 mililitros de HBSS a los restos de placenta, agite vigorosamente para recuperar más células y centrifugue la muestra por pulsos.

Nuevamente, pipetee el sobrenadante en el tubo con el filtro de células en el tubo de recolección. Verter el sobrenadante en el colador de células puede ser más adecuado, dependiendo de la consistencia de la muestra. Lave el colador de celdas con 5 mililitros de HBSS.

Deseche el tubo que contiene los restos de tejido placentario. Centrifugar la muestra sobrenadante durante cinco minutos a 340 g para granular las células. Los glóbulos rojos son visibles como una capa en la parte inferior de la pastilla, y las células mononucleares, incluidas las MSC, son la capa más ligera encima de los glóbulos rojos.

Devuelva las muestras a la cabina de seguridad biológica. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y desecharlo. Golpee el tubo varias veces con un dedo para desalojar el pellet de celda y vuelva a suspender el pellet de celda en 35 mililitros de medio MSC.

Transfiera la suspensión celular a un matraz T175 por cada 10 milésimas de pulgada de tejido y cultive en una incubadora de 37 grados con 5% de CO2. Después del aislamiento, cambie el medio de cultivo después de 48 horas. Alimente los cultivos una vez por semana hasta que confluyan.

Los cultivos deben ser confluentes aproximadamente a los 14 días. Por último, expandir y criopreservar células, analizar las características de las MSC y utilizarlas en experimentos. Después de 48 horas de cultivo, MSC se habrá adherido al plástico de cultivo de tejidos, mientras que las poblaciones de células hematopoyéticas y otras no lo harán.

En este momento, el medio se reemplaza con 35 mililitros de medio de cultivo fresco. La apariencia del sobrenadante del cultivo puede variar sustancialmente entre los donantes de placenta. Los ejemplos uno y dos demuestran esta variación.

Estos dos aislamientos se realizaron simultáneamente, pero a partir de dos placentas diferentes. Una vez lavados, los cultivos están libres de glóbulos rojos y restos de tejido, como se muestra en el ejemplo tres, y los resultados de expansión posteriores son generalmente consistentes. Después del cambio de medio de 48 horas, solo se unen unas pocas células al matraz.

Siete días después del aislamiento, las colonias fibroblásticas de MSC son visibles, aunque también hay células no MSC, como células redondas o poco adheridas. 13 días después del aislamiento, las colonias fibroblásticas de MSC son grandes y, a menudo, la monocapa de MSC es lo suficientemente confluente y está lista para pasar. A partir de su paso, la monocapa MSC desarrolla una morfología característica similar a un remolino en la confluencia.

Las MSC placentarias muestran un perfil de marcador MSC clásico mediante análisis de citometría de flujo. Las células son positivas para CD73, CD105 y CD90, y negativas para los marcadores hematopoyéticos de CD45, CD34 y HLA-DR. Las MSC placentarias generalmente experimentan una diferenciación osteogénica robusta, pero una diferenciación adipogénica pobre.

Muchas publicaciones asumen que las células aisladas del corion fetal producen MSC fetal en el cultivo. Sin embargo, como hemos informado anteriormente, todos los cultivos derivados del corion fetal que utilizan este protocolo se enriquecen rápidamente para las MSC maternas, como se esperaría para los cultivos de MSC deciduales maternos. Los datos que se muestran aquí cuantifican la composición de células fetales y maternas de los cultivos de MSC placentarios aislados de tejidos de placas deciduales, coriónicas y coriónicas.

Después de ver este video, debería tener una idea bastante clara de cómo aislar y cultivar MSC derivado del tejido placentario. Esperamos que estos métodos le resulten útiles en sus investigaciones y aplicaciones clínicas que puedan utilizar MSC derivadas de la placenta.