Name: Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprende a aislar y expandir células madre mesenquimales de placenta humana mediante disección manual, digestión enzimática y cultivo por adherencia plástica. Este protocolo detallado facilita la investigación en biología celular.

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RP fue apoyado por el Consejo Nacional de la Salud y la Investigación Médica (NHMRC) Postdoctoral becas de formación. VS fue apoyado por una beca de la Universidad de Queensland Estudiante Internacional de Postgrado. MRD fue apoyada por el NHMRC e Inner Wheel Australia. Damos las gracias al personal clínico y de enfermería para ayudar en el consentimiento del paciente y la toma de muestras. Agradecemos al Prof. Nickolas Fisk, el Prof. Dr. Kerry Atkinson y Rohan Lourie para discusiones interesantes en obstetricia, el desarrollo de la placenta y feto-placenta anatomía.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La placenta es un órgano grande físicamente maternofetal, a partir del cual el MSC fetal o materna puede aislarse 22. En este documento, hemos proporcionado una descripción detallada de la anatomía de la placenta y la instrucción sobre la forma de diseccionar específicamente decidua (materna), vellosidades coriónicas (fetal), y la placa coriónica (fetal) tejido (Paso 2,2-2,4). Posteriormente, hemos descrito un protocolo robusto que permite el aislamiento de MSC de cada uno de estos tres tejidos (paso 2,5-2,6). Expansión de la placenta MSC es eficiente y culturas parece similar al hueso cultivos de MSC derivadas de médula (Figuras 3 y 4). La diferenciación osteogénica es fiable (Figura 5B), mientras que la diferenciación adipogénica es generalmente menos eficiente (Figura 5C) 5. Muchos recién llegados al campo van a suponer que los cultivos derivados de vellosidades coriónicas o tejidos fetales placa coriónica se enriquecen de MSC fetal. Sin embargo, en nuestras manos FeTal enriquecimiento celular sólo es transitorio cuando el medio de expansión MSC estándar tal como DMEM-LG + 10% de FBS se utiliza 5. A continuación se muestran resultados representativos utilizando tejidos de la placenta derivados de un bebé de sexo masculino. Mediante el uso de tejido de la placenta de un bebé de sexo masculino, las células fetales son fácilmente identificables por tener cromosomas XY, mientras que las células maternas son identificables por tener cromosomas XX. La figura 6 muestra XY resultados de FISH para una cultura representativa. Mientras que el MSC fetal (XY) se enriquecen (hasta 80%) en los cultivos iniciales derivados de vellosidades coriónicas fetal o tejidos placa coriónica, estos mismos cultivos son superadas rápidamente (~ 100%) por la madre (XX) MSC durante los dos primeros pasajes . En medio estándar, compuesto de DMEM-LG + 10% de FBS, los pocos MSC-materna derivada que contaminan los tejidos fetales outcompete las células fetales obtenidas por cultivo. Un paso crítico descrito en este protocolo es una apreciación de la anatomía de la placenta y de donde fetaly tejido materno se puede cosechar más eficaz. Como se indica en la sección de resultados representativa, la disección de tejido fetal no permiten el enriquecimiento transitorio de MSC fetal derivado. Las mejoras en la formulación del medio de expansión, a través de la suplementación medio del factor de crecimiento exógena específica deben permitir la expansión selectiva de las poblaciones de MSC-fetales derivados, y la producción de un producto de células que se enriquece por fetal en lugar de células maternas (nuestro grupo está desarrollando actualmente dichas formulaciones de medio). La fabricación de las poblaciones de MSC fetales puede tener una serie de ventajas, como MSC fetal se supone que tienen una mayor angiogénesis y propiedades inmunosupresoras que las poblaciones de MSC maternas equivalentes 37. En cada uno de los protocolos de aislamiento descritas, se utilizó aproximadamente 10 g de tejido. Toda una placenta es típicamente 500-750 g, y en trabajos anteriores hemos demostrado que a través del tejido automatizado compendio y un proc biorreactor expansión celulareses que debería ser posible fabricar más de 7.000 dosis de células clínicos desde una única placenta 4. Estas cifras ponen de manifiesto la posible idoneidad de MSC placentaria derivada en terapias de MSC alogénicas, y la importancia de este método, independientemente del origen del MSC (fetal o materna). Desde una perspectiva terapéutica, es más crítico que los usuarios tienen una comprensión completa del producto celular y la capacidad de fabricar de forma fiable este producto celular. Esperamos que nuestro video ayudará a los investigadores a entender la anatomía placenta, aislar MSC de la placenta, y anticipar la composición celular fetal o materna probable de sus culturas.

Mesenquimales del estroma células madre / (MSC) están emergiendo como un candidato prometedor para su uso en terapias basadas en células 1. La mayoría de las aplicaciones parecen apuntar a la reparación de tejidos MSC o mediada por la regulación inmune 2. En muchas de estas aplicaciones, alogénico MSC puede ser tan eficaz como MSC autólogas 3. El uso de MSC alogénicas tiene la ventaja económica de ser compatible con la fabricación a gran escala de múltiples dosis de células a partir de un solo tejido fuente 4 para el tratamiento de muchos pacientes. Históricamente, los estudios preclínicos y clínicos han utilizado MSC-deriva de la médula ósea 4. La médula ósea se recoge generalmente de la cresta ilíaca de un donante voluntario. Este proceso es invasivo, y sólo una pequeña cantidad de médula ósea (~ 20 ml) se recoge en un solo pinchazo. La generación de números clínicamente significativas de MSC requiere una amplia expansión in vitro. potencia de la célula disminuye con el número de pases <sup&gt; 3, creando una paradoja que se aumenta más la población celular se expande el número teórico de células requeridas para la eficacia clínica. En contraste con aspirados de médula ósea, placenta a término es un físicamente grande de tejido de partida (por lo general 500 a 750 g 4), que se puede recoger de forma aséptica durante la cesárea, sin riesgo para el donante. MSC derivados de la placenta tienen la proliferación y 5 inmunomodulador capacidad a largo plazo 6, superior a la del hueso MSC derivadas de médula. En un estudio anterior, hemos demostrado que una sola placenta a término contenía suficientes MSC para la fabricación de hasta 7.000 dosis clínicas 4. Estas características hacen de placenta un tejido fuente ideal para la fabricación de MSC alogénicas. La placenta es un órgano maternofetal que consiste en tanto el tejido fetal y materna 7, y por lo tanto el MSC de origen fetal o materna puede ser, en teoría, aislado. Las siguientes referencias proporcionan deinformación de cola en el desarrollo y la patología, así como el examen microscópico y macroscópico de la placenta humana y sus anexos 8,9. La placenta adecuada se compone en gran parte de los vasos sanguíneos fetales y secretora y células de soporte llamadas trofoblastos, que constituyen las vellosidades coriónicas cubiertos por el corion frondoso (placa) 8. Las vellosidades placentarias ramificados se bañan en sangre materna liberado de las arterias espirales uterinas, lo que permite nutrientes, hormonas y el intercambio de gases entre el feto y la madre. La placenta se ancla al endometrio a través de las células del estroma de la decidua materna y trofoblastos fetales extravillious se intercalan en la matriz extracelular 8. Las vellosidades convergen sobre la placa coriónica fetal donde forman el cordón umbilical 8. Uno de los resultados del primer Taller Internacional sobre Células Madre provenientes de la placenta (2008) fue una apreciación de la necesidad de estandarizar el aislamiento y characterization de las células de la placenta humana a término 10. Debido a la anatomía de la placenta, la disección de los diferentes tejidos, el aislamiento de MSC y los resultados esperados de cultivo puede ser abrumador para los recién llegados al campo. En este protocolo, la cosecha de tejidos coriónicas de la placenta, seguido por el aislamiento y la expansión de MSC es bien detallada. Caracterización MSC a través de citometría de flujo y diferenciación in vitro se considera tratamiento rutinario 5,11-13, y por lo tanto se detalla brevemente aquí. Como se destacó en una reciente revisión sistemática de la literatura 14, MSC obtiene a partir de las vellosidades coriónicas de la placenta generalmente se supone que son fetal. A pesar de que sólo el 18% de los estudios examinó el origen del MSC obtenido, y de ellos, sólo la mitad de los estudios informó MSC fetal y la otra mitad informó poblaciones MSC maternos o mixtos. Cada uno de los tres componentes del tejido descritos en este documento (vellosidades coriónicas, coriónicas placa y decidua basal) son lososed principalmente de la membrana fetal / vellosidades, y una pequeña proporción de células maternas uterinos derivados, los cuales permanecen unidas a la placenta entregado. Proporcionamos datos que demuestran que el aislamiento de MSC desde el lado materno de la placenta, en lugar del lado fetal de la placenta, como hemos informado anteriormente de 5,11, es un material de partida más apropiado si se desean MSC materna. Este protocolo también describe el uso de XY FISH para validar contribución fetal o maternal a cultivos de células. Si bien este es un protocolo estándar del fabricante, este análisis es a menudo descuidado y su importancia subestimada 14.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>Nombre largo: Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nombre largo: Fetal Bovine Suero</td></tr><tr><td>sustituto de tripsina</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>Nombre largo: TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>Nombre largo: Dulbecco' s Águilas Modificadas Glucosa Media-Baja</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nombre largo: Dulbecco' s Águilas modificadas Glucosa media alta (4,5 g / L)</td></tr> <tr><td>PBS (libre de Mg + Ca+)</td> <td>Gibco / Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Nombre largo: Dulbecco Solución salina tamponada con fosfato, magnesio y calcio</td></tr><tr><td>libre Anti- anti-Gibco</td> <td>/ Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nombre largo: solución antibiótica-antimicótica x100</td></tr><tr><td>polvo de paraformaldehído o solución al 4%</td><td>cualquier&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&nbsp;</td><td>2.500 U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml en&nbsp; 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp;</td><td>10 mg/ml en agua (20.000 U/ml).</td></tr><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Desechables:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubos de centrífuga</td><td>Falcon o cualquier marca</td><td></td><td></td>placas de</tr><tr><td>Petri, estériles placticas (25 cm y 10 cm de diámetro)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células (100 &mu; m)</td><td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 y 75 cm2 (T175 y T75) matraces de cultivo de tejidos Nunc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml pipetas serológicas estériles de 5 ml, 10 ml,</td><td>de 25 ml, cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Centrífuga&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; incubadora para cultivo de tejidos 37 &deg; C, 5% CO2</td>Cabina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de <td>seguridad biológica</td></tr><tr><td>&nbsp; Tijeras y pinzas</td><td></td><td></td><td></td>estériles</tr><tr><td>Bastidores de tubos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas y puntas</td> estériles tipo Gilson equivalentes <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &micro; l, 200 y micro; l, 20 &micro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadora oscilante o agitadora (37 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr>soluciones de limpieza de <tr><td>equipos</td><td></td><td></td><td></td>de protección personal</tr><tr><td>(adecuados para sangre)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>contenedores de residuos, contenedores de eliminación correctos para tejidos/sangre</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><reactivos fuertes>para la caracterización de MSC</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpo (clon ID)</fuerte></td><td>Fabricante</td><td>Catalogación No.</td><td>Isotype</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>Ratón IgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>Ratón IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>Ratón IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>Ratón IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>Ratón IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>Ratón IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>Ratón IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>Ratón IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>Isotype Controls (Clone ID)</td><td>Fabricante</td><td>Ficha técnica</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td><td></td></tr><tr><td>Isotipo IgG1 de ratón (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td>Isotipo IgG1 de ratón (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a de ratón (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a de ratón (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>Tampón MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>diferenciación osteogénica</fuerte></td><td><fuerte>Fabricante</td><td>Nº de catálogo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nombre largo: Dulbecco' s Águilas modificadas Glucosa media alta (4,5 g / L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nombre largo: Suero fetal bovino</td></tr> <tr><td>Anti-anti-Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nombre largo: solución antibiótica-antimicótica x100</td><td></td></tr> <tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glicerol Hophate</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarina Roja S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>Para tinción de matriz</td></tr> <tr><td>de calcio<fuerte>Diferenciación adipogénica</fuerte></td><td><fuerte>Fabricante</fuerte></td><td><fuerte>Nº de catálogo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nombre largo: Dulbecco' s Águilas modificadas Glucosa media (4,5 g / L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nombre largo: Suero fetal bovino</td></tr> <tr><td>Anti-anti-Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nombre largo: solución antibiótica-antimicótica x100</td><td></td></tr> <tr><td>insulina</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metil xantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Red O solución</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td><td>Para tinción de vacuolas lipídicas</td></tr><tr><td><fuerte>XY kit FISH para determinar el origen fetal o materno de las células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY chomosome FISH kit</td><td>Vysis (Abbott Molecular)</td><td>07J20-050</td><td>Nombre largo: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Kit de sonda de ADN fluorescente marcado directamente</td></tr></tbody></table>

aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Las células madre/estroma mesenquimales (MSC) son candidatas prometedoras para su uso en terapias basadas en células. En la mayoría de los casos, la respuesta terapéutica parece depender de la dosis celular. La placenta a término humano es rica en MSC y es un tejido físicamente grande que generalmente se desecha después del nacimiento. La placenta es un material de partida ideal para la fabricación a gran escala de múltiples dosis celulares de MSC alogénicas. La placenta es un órgano fetomaterno del que se puede aislar tejido fetal o materno. Este artículo describe la anatomía de la placenta y el procedimiento para diseccionar el tejido decidua (materno), las vellosidades coriónicas (fetal) y la placa coriónica (fetal). A continuación, el protocolo describe cómo aislar las MSC de cada región de tejido diseccionado y proporciona un análisis representativo de las MSC ampliadas derivadas de los respectivos tipos de tejido. Estos métodos están destinados al aislamiento preclínico de MSC, pero también se han adaptado para la fabricación clínica de MSC placentaria para uso terapéutico humano.

En este documento se describen los métodos para la disección de tejidos fetales y maternas de placenta humana a término, seguido por el aislamiento y expansión de células madre mesenquimatosas / estroma (MSC) de estos tejidos.

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y expandir células mesenquimales estromales derivadas del tejido de placenta humana. Hola, soy Mike Doran. Soy líder de grupo en la Universidad Tecnológica de Queensland en el Instituto de Investigación Traslacional de Brisbane, Australia.Hola, mi nombre es Rebecca Pelekanos, y soy investigadora en el Centro de Investigación Clínica de la Universidad de Queensland. Hoy, demostraré el procedimiento de aislamiento de CMM. La placenta normalmente se descarta después del parto.Dado que el tejido tiene un peso de cinco a 700 gramos, constituye una fuente excepcionalmente amplia de células madre mesenquimales alogénicas. Por lo general, las personas que son nuevas en el aislamiento de células madre mesenquimales de la placenta tendrán dificultades porque no están familiarizadas con la anatomía de la placenta, con la forma de procesar el tejido ni con el tipo de células, maternas o fetales, que poblarán su cultivo final de células madre mesenquimales. Para ayudar a los investigadores, discutimos estos detalles importantes en este video.El primer paso en este procedimiento consiste en familiarizarse con la anatomía de la placenta. El segundo paso es diseccionar manualmente 10 gramos de tejido de la decidua, las vellosidades coriónicas o la placa coriónica, utilizando tijeras. Los dos primeros pasos se resumen nuevamente aquí de forma esquemática.En el paso tres, los tejidos de la decidua, las vellosidades coriónicas o la placa coriónica se trituran aún más en trozos pequeños con tijeras. En el paso cuatro, las células se liberan de los pequeños fragmentos de tejido mediante una digestión de una a dos horas con dispasa y colagenasa I. En el paso cinco, las células se separan del tejido fibroso lavándolas a través de un filtro celular. Luego, las células se recogen, se resuspenden en medio de cultivo y se colocan en frascos de cultivo.Las células estromales mesenquimales, MSCs, se seleccionarán según su tendencia a adherirse al plástico y su capacidad para sobrevivir y proliferar en el medio de cultivo celular. Finalmente, en la sección de resultados, las MSC expandidas pueden caracterizarse y almacenarse para su uso en experimentos futuros. La placenta es un órgano temporal que permite el intercambio de nutrientes y productos de desecho entre el feto y la madre durante el embarazo.La placenta se puede recolectar fácilmente de forma aséptica tras una sección cesárea y el parto seguro del bebé. La placenta está compuesta predominantemente por vasos sanguíneos y membranas de origen fetal. Sin embargo, también contiene algunas células maternas.La placenta está conectada al útero tanto por células deciduales derivadas del tejido materno como por trofoblastos invasores derivados del feto. Por lo general, no es posible distinguir a simple vista la interfaz precisa entre los tejidos materno y fetal. Sin embargo, el lado fetal de la placenta se identifica fácilmente como el lado donde se encuentra el cordón umbilical.Una vez que el bebé es expulsado, solo queda una capa delgada de tejido decidual conectada a la placenta. Mediante la orientación física de la placenta, es posible identificar los tres tejidos que cosecharemos hoy. El primer tejido que se cosechará es la decidua materna.El marcador verde señala el tejido decidua que permanece en la superficie tras la expulsión de la placenta de la pared uterina. El segundo tejido que se obtendrá del interior de la placenta son las vellosidades coriónicas fetales. Esto se indica mediante los círculos azules en los diagramas.El tercer tejido que se obtendrá será la placa coriónica fetal. Este tejido se identifica mediante los marcadores rojos en los diagramas. Bien, comencemos.Coloque la placenta en la cabina de seguridad biológica. Extienda las membranas fetales y oriente las partes de la placenta. El lado fetal con la inserción del cordón umbilical, el corioamniótico laeve o el saco amniótico.La superficie fetal de la placenta presenta vasos sanguíneos grandes evidentes en la placa coriónica, con la membrana amniótica sobreyacente, que, nuevamente, se separa fácilmente mediante procedimientos mecánicos. El lado materno es opuesto al lado fetal, con cotiledones o lóbulos evidentes. Asegúrese de que la superficie materna quede orientada hacia arriba.Corte trozos de 0,5 cm de grosor desde el lado materno de la placenta o del decidua. Durante las disecciones, coloque los trozos de tejido en una placa de Petri que contenga solución salina balanceada de Hank (HBSS) para mantener los tejidos húmedos. Agite los tejidos en las placas con HBSS para eliminar algo de sangre.Transfiera suficiente tejido para llenar el tubo hasta la marca de 10 mililitros de un tubo de 50 mililitros, aproximadamente 10 gramos. Tenga en cuenta que se puede aislar más tejido en esta etapa si se requieren más células al final del procedimiento. Asegúrese de que la superficie fetal esté orientada hacia arriba.Retire mecánicamente la membrana amniótica de la superficie fetal de la placenta, dejando intacta la lámina coriónica. Corte la lámina coriónica en tiras de aproximadamente medio centímetro de profundidad en el tejido de vellosidades debajo. Luego, diseccione el tejido de vellosidades coriónicas aproximadamente un centímetro de profundidad en la placenta desde donde se ha eliminado la lámina coriónica.Coloque los tejidos en HBSS y mida aproximadamente 10 mililitros del tejido como se hizo previamente. Transfiera los trozos de tejido, con transferencia mínima de líquido, a una placa de Petri de 10 centímetros y córtelos en trozos finos de aproximadamente un milímetro cúbico, con tijeras. Transfiera el tejido picado nuevamente al tubo de 50 ml.Repita el procedimiento para todas las muestras de tejido restantes. Añada el medio de digestión recién preparado en una proporción de al menos uno a uno con el tejido. Invierta el tubo varias veces para mezclar.Incube los tejidos en el tubo con el medio de digestión durante una a dos horas, a 37 grados en un incubador con agitación. Cuando la solución de digestión del tejido haya cambiado a una apariencia turbia y los vasos sanguíneos blancos sean evidentes en la solución, agregue 15 mililitros de HBSS para diluir las enzimas en el medio de digestión. Centrifugue brevemente las muestras solo hasta que la centrifugadora alcance 340 g durante cinco segundos, y luego detenga.Esto hará que los residuos grandes se acumulen en el fondo del tubo. Devuelva las muestras a la cabina de seguridad biológica. Coloque un filtro celular en un tubo nuevo de 50 mililitros.Aspire el sobrenadante que contiene las células mononucleares hacia el filtro, recogiendo el eluato en el nuevo tubo. Deje los restos de tejido placentario en el primer tubo. Añada 15 mililitros de HBSS al residuo placentario, agite vigorosamente para recuperar más células y realice una centrifugación pulsada de la muestra.Nuevamente, aspire el sobrenadante con la pipeta y transfiéralo al tubo con el filtro celular en el tubo de recolección. Verter el sobrenadante en el filtro celular puede ser más adecuado, dependiendo de la consistencia de la muestra. Lave el filtro celular con 5 mililitros de HBSS.Deseche el tubo que contiene los restos de tejido placentario. Centrifugue la muestra del sobrenadante durante cinco minutos a 340 g para obtener un sedimento celular. Los glóbulos rojos son visibles como una capa en la parte inferior del sedimento, y las células mononucleares, incluidas las CMM, forman la capa superior más clara sobre los glóbulos rojos.Devuelva las muestras a la cabina de seguridad biológica. Deseche cuidadosamente el sobrenadante. Agite el tubo varias veces con un dedo para despegar el botón celular y re suspenda el botón celular en 35 mililitros de medio para MSC.Transfiera la suspensión celular a un matraz T175 por cada 10 mililitros de tejido y cultive en un incubador a 37 grados con 5% de CO2. Después del aislamiento, cambie el medio de cultivo a las 48 horas. Alimente los cultivos una vez por semana hasta alcanzar confluencia.Los cultivos deben estar confluentes aproximadamente a los 14 días. Finalmente, amplíe y criopresérvese las células, analice las características de las CMM y utilícelas en experimentos. Tras 48 horas de cultivo, las CMM se habrán adherido al plástico para cultivo de tejidos, mientras que las poblaciones de células hematopoyéticas y otras no lo habrán hecho.En este momento, el medio se reemplaza con 35 mililitros de medio de cultivo fresco. La apariencia del sobrenadante del cultivo puede variar considerablemente entre donantes de placenta. El ejemplo uno y dos demuestran esta variación.Estas dos aislamientos se realizaron simultáneamente, pero a partir de dos placentas diferentes. Una vez lavadas, las culturas están libres de glóbulos rojos y restos de tejido, como se muestra en el ejemplo tres, y los resultados posteriores de expansión son generalmente consistentes. Después del cambio de medio a las 48 horas, solo unas pocas células están adheridas al frasco.Siete días después del aislamiento, son visibles colonias de MSC fibroblásticas, aunque también están presentes células no MSC, como células redondeadas o débilmente adheridas. Trece días después del aislamiento, las colonias de MSC fibroblásticas son grandes, y a menudo el monocapa de MSC es suficientemente confluyente y está listo para ser pasado. A partir del primer pase en adelante, el monocapa de MSC desarrolla una morfología característica similar a un remolino al alcanzar la confluencia.Las CMM de la placenta muestran un perfil clásico de marcadores de CMM mediante análisis de citometría de flujo. Las células son positivas para CD73, CD105 y CD90, y negativas para los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34 y HLA-DR. Las CMM de la placenta generalmente experimentan una diferenciación osteogénica robusta, pero una diferenciación adipogénica deficiente. Muchas publicaciones asumen que las células aisladas del corion fetal producen MSC fetales tras el cultivo. Sin embargo, como hemos informado previamente, todos los cultivos derivados del corion fetal utilizando este protocolo se enriquecen rápidamente con MSC maternos, tal como se esperaría en cultivos de MSC deciduales maternos. Los datos mostrados aquí cuantifican la composición celular fetal y materna de los cultivos de MSC placentarios aislados de tejidos deciduales, vellosidades coriónicas y placas coriónicas. Después de ver este video, debería tener una idea bastante clara de cómo aislar y cultivar CMM derivadas de tejido placentario. Esperamos que estos métodos le resulten útiles en sus investigaciones y aplicaciones clínicas que puedan utilizar CMM derivadas de la placenta.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas durante el desarrollo. Encontramos que las células madre hematopoyéticas (HSC), son generados y ampliado en la placenta en el único nichos microambientales. A continuación, describimos las técnicas experimentales necesarias para el aislamiento y la visualización de la CMH en la placenta del ratón.

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial de diferenciación hacia el linaje osteoblástico cuando se estimulan con factores solubles o biomateriales específicos. Este trabajo presenta una opción novedosa para la administración de MSCs de la membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emplea la matriz ósea bovina Nukbone (NKB) como andamio.

El aislamiento de células madre mesenquimales humanas y su cultivo en la matriz del hueso poroso

Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

Cordón umbilical humano (UC) puede obtenerse durante el período perinatal como consecuencia de la prematuro, término y entrega de postterm. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-derivados de células madre mesenquimales (MSCs-UC) de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.

Aislamiento y caracterización de humanas derivadas de cordón Umbilical las células madre mesenquimales de prematuros y recién nacidos a término

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

El aislamiento delas MSCsBAMBI altasen MFGE8, uno de los tres subgrupos principales que constituyen las UC-MSCs humanas heterogéneas, es útil para comprender completamente las características y funciones de este subtipo para su futura aplicación para mejorar la eficacia clínica en enfermedades específicas. Aquí, presentamos un método para clasificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.

Aislamiento de células estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical BAMBIhumano con altocontenido de MFGE8

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Aprende a aislar y expandir células madre mesenquimales de placenta humana mediante disección manual, digestión enzimática y cultivo por adherencia plástica. Este protocolo detallado facilita la investigación en biología celular.

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

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