Name: Fémur Window Cámara Modelo de En Vivo Seguimiento de la célula de la médula ósea murina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a realizar imagen intravital de largo plazo de neutrófilos en la médula ósea femoral murina mediante un modelo de cámara ventana. Esta técnica utiliza microscopía de fluorescencia multifotón para estudiar dinámicas inmunes y oncológicas in vivo.

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Los autores desean agradecer al Fondo para Microscopía Óptica Avanzada (www.aomf.ca) en la Red de Salud de la Universidad para obtener ayuda con la microscopía, y el Sr. Jason Ellis de la princesa Margarita Centro de Cáncer de máquinas para la fabricación del WC y la etapa de formación de imágenes. También nos gustaría agradecer al Dr. Iris Kulbatski para la edición de manuscritos.

NOTA: Todo el trabajo con animales se llevó a cabo bajo el protocolo # 2615 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Health Network. 1. Preparación quirúrgica de ratón <ol><li> Antes de la cirugía, esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y la cámara de ventana (WC) por tratamiento en autoclave. Complementar el agua potable con 50 mg / kg de peso corporal de amoxicilina 2 días antes de la cirugía. Inyectar el ratón con 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por vía intraperitoneal 4 h antes de la cirugía. </li><li> Anestesiar el ratón nude atímicos mediante inyección intraperitoneal de solución salina 350-400 l que contiene 80 mg / kg de ketamina y 13 mg / kg de xilazina (Nota: Esto fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional, y no hemos tenido ninguna experiencia con los efectos adversos ). Confirmar la anestesia adecuada mediante pruebas de reflejo del pie. Para continuar observando el patrón respiratorio, color de las mucosas y el reflejo del pie durante el procedimiento. </li><li> Realice la pr quirúrgicaocedures bajo una campana de bioseguridad para mantener condiciones estériles durante la cirugía. Coloque el ratón sobre una manta eléctrica cubierto con un paño quirúrgico para mantener la temperatura del cuerpo durante la cirugía. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo el microscopio estereoscópico. </li><li> Aplicar ungüento para los ojos para mantener los ojos húmedos durante la cirugía. Repetir si es necesario durante el procedimiento quirúrgico. Esterilizar la zona de funcionamiento del ratón limpiando con un 7,5% de povidona yodada, el 70% de alcohol isopropílico y 10% de povidona yodada en forma consecutiva, y repetir este procedimiento dos veces. </li><li> Hacer una incisión en la piel longitudinal 10 mm usando escalpelo con una cuchilla (# 15), se acerca el fémur desde el lado lateral. Exponer el fémur entre los músculos flexores y extensores mediante disección roma con unas pinzas hemostáticas y para asegurar la funcionalidad muscular. </li><li> Inserte la barra en forma de U por debajo del hueso, e instalar el WC (Figura 1). Asegurar la barra con la ventana con dos tuercas y apriete las tuercas porceps. Llenar el espacio entre el hueso y el WC con cemento dental. </li><li> Triturar el hueso cortical en una región 6 x 2 mm 2 con un micro-taladro para tener acceso óptico a la cavidad ósea. Nota: Inspeccione cuidadosamente el adelgazamiento del hueso cortical bajo el microscopio, mientras que la realización de este procedimiento. Deja una capa de periostio intacto, casi transparente del hueso. </li><li> Coloque el cubreobjetos 8 mm en la ventana, y asegurar el cubreobjetos con un anillo de retención para mantenerlo en su lugar. </li><li> Reajuste la musculatura de los músculos flexores y extensores de la espalda a sus ubicaciones originales mediante el uso de fórceps para mantener su función después de la cirugía. Suturar la dermis utilizando 5-0 sutura y un soporte de aguja. </li><li> Monitorear el ratón para la recuperación, hasta que está consciente y es capaz de moverse libremente. Poner el animal en una jaula nueva cuando se recuperan. </li><li> Después de la recuperación, realice la adquisición de imágenes en el animal en el mismo día o los días siguientes (véase la sección 2). Supervisar el physicondición de cal del ratón diaria. Nota: Monitorear las condiciones físicas, tales como la carga de peso en el miembro, encorvando, rápida o poco profunda respiración, hinchazón de las extremidades posteriores, la automutilación, celulitis y dermatitis severa. </li><li> Dar la inyección intraperitoneal de 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina durante 3 días, y 1 mg / kg de peso corporal de meloxicam durante 5 días después de la cirugía para el tratamiento de dolor post-quirúrgico y la inflamación. Continuar proporcionando el agua amoxicilina-complementado por 5 días. </li><li> En el punto final experimental, la eutanasia a los animales por CO 2 narcosis seguido de un método secundario (por ejemplo, la dislocación cervical). </li></ol> 2. Adquisición de imágenes por Combinada multi-fotón y microscopía confocal <ol><li> Antes de la formación de imágenes, anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de una solución salina 350 a 400 l que contiene 80 mg / kg de ketamina y 13 mg / kg de xilazina. Como alternativa, utilice anestésico inhalable, cuando esté disponible.Aplicar ungüento para los ojos. </li><li> Inyectar la mezcla de colorantes intravasculares para vasculatura etiquetado (0,65 mg de 2 MDa de fluoresceína (FITC) dextrano) y los neutrófilos (4 g de aloficocianina (APC) de anticuerpo-Ly6G -anti). </li><li> Utilice un multi-fotón vertical combinada y el microscopio confocal equipado con un láser de múltiples fotones que van desde 705 hasta 980 nm para la excitación de dos fotones, así como láseres de fotones individuales que proporciona longitudes de onda de excitación de azul a rojo. </li><li> Establecer una etapa de formación de imágenes a medida en el microscopio (Figura 1B). Asegure el ratón en la etapa de sujeción por los dos extremos del WC con pinzas de cocodrilo. Nota: Los componentes críticos de la etapa son: dos pinzas de cocodrilo para mantener el aseo, y un elemento de calefacción para mantener la temperatura fisiológica (37 ° C) del ratón durante la exploración. </li><li> Encienda el láser de dos fotones y el sistema confocal, y poner en marcha el software de adquisición de la imagen haciendo clic en &quot;Inicio del sistema&quot;. Una ventana con 4 pestañas (Localizar,Adquisición, procesamiento, y Mantener) se abrirá. </li><li> Configurar los canales de imagen. Haga clic en &quot;Configuración inteligente&quot; en la pestaña de Adquisición y elegir los colorantes que se utilizarán para la imagen: FITC (488 nm de excitación, 493 a 588 nm de emisión) y APC (633 nm de excitación y 638 a 743 nm de emisión). Elija &quot;mejor señal&quot; y haga clic en &quot;Aplicar&quot;. </li><li> Añadir el segundo canal de adquisición de imágenes generación armónica (SHG) manualmente. Encienda el láser de dos fotones debajo de la ventana &quot;láser&quot; en la pestaña de Adquisición. Bajo la ventana de Canales, haga clic en el signo &quot;+&quot; para añadir una pista. </li><li> Configure la pista SHG. Cambiar la longitud de onda de 840 nm bajo la ventana de canales con las flechas hacia arriba y hacia abajo, y elegir el rango de detección para ser 415-425 nm bajo la ventana &quot;Light Path&quot; usando la barra deslizante. </li><li> Haga clic en &quot;oculares en línea&quot; en la pestaña Buscar. Haga clic FITC con la configuración de filtro para FITC para ver la región de interés y ajustar el enfoque manualmente girando tque se centran perilla en el lado del microscopio. Cuando se encuentra la región de interés, haga clic en &quot;oculares fuera de línea&quot; en la pestaña Buscar. </li><li> Haga clic en la ficha Adquisición. Seleccionar la pista FITC bajo la ventana Canales y hacer clic en &quot;vivo&quot; para previsualizar la imagen de FITC-dextrano, con el objetivo de 5X. Ajuste el enfoque si es necesario, y haga clic en &quot;Stop&quot; en la pestaña de Adquisición para detener la vista previa. </li><li> gire manualmente a 20X objetivo agua moviendo una rueda por encima de los lentes. Ver la imagen de nuevo por FITC-dextrano usando el objetivo 20X, y ajuste maestro de ganancia y del agujero de alfiler bajo la ventana de canales para lograr la señal y un contraste óptimo. Repita para otros canales mediante la selección de APC y los grupos de autoayuda pistas debajo de la ventana Canales. </li><li> Elija los parámetros de imagen. Haga clic en &quot;Modo de adquisición&quot; para abrir su ventana. Ajuste el tamaño del cuadro sea 1.024 x 1.024 píxeles, y el promedio de 4X para obtener imágenes de alta calidad. </li><li> Adquirir una instantánea 2D. Seleccionar todos los canales bajo Canales gananDow y haga clic en &quot;Snap&quot; en la pestaña de Adquisición. Comprobar la calidad de la imagen y cambiar los parámetros de imagen si es necesario. </li><li> Adquirir imagen de lapso de tiempo 2D. <ol><li> Marque &quot;series de tiempo&quot; en la pestaña de Adquisición para abrir la ventana de series temporales. Escriba 0 en virtud de los intervalos, y 40 para el número total de exploraciones para tomar 40 imágenes continuas sin intervalo de tiempo. Nota: 40 exploraciones genera aproximadamente 5 minutos largo de series de tiempo con una velocidad de barrido de 7,5 seg / bastidor y el tamaño de la imagen de 600 micras x 600 micras. Ajuste el intervalo y número de análisis en función del microscopio, la configuración de adquisición de imágenes y la velocidad de cuadros de la cámara. Un intervalo de tiempo fijo (&gt; 0 seg) se puede usar para comparar las imágenes con lapso de tiempo adquiridos en diferentes puntos temporales. Una duración de imagen de lapso de tiempo más largo puede ser necesario en función de la velocidad media esperada de los neutrófilos (u otras células de interés) en la condición experimental. </li></ol></li><li> Adquirir imagen en 3D.<ol><li> Marque &quot;Z-Stack&quot; en la pestaña de Adquisición para abrir la ventana de Z-Stack. Iniciar el modo de vista previa &quot;en vivo&quot; de FITC-dextrano. Se centran en la parte superior de la muestra y haga clic en &quot;Set primero&quot;, y se centran en el otro extremo de la muestra y haga clic en &quot;Último conjunto&quot; en la ventana de Z-pila. </li><li> Establecer el intervalo a ser de 10 micras bajo la ventana de Z-pila. Dependiendo de la primera y la última rebanada óptico seleccionado en el paso anterior, esto generará 10-20 rebanadas, con espesor óptico global de 90 a 180 micras. Nota: El intervalo z-pila depende del tamaño de la del agujero de alfiler, que determina el espesor de la rebanada óptica. Ajuste el intervalo de ser menor que el espesor de la rebanada de óptica. </li><li> Haga clic en &quot;Experimento de inicio&quot; en la pestaña de adquisición para iniciar la recopilación de imágenes. </li></ol></li><li> Adquirir imagen de lapso de tiempo 3D. <ol><li> Marque &quot;Time Series&quot; y &quot;Z-pila&quot; en la pestaña de Adquisición para abrir la serie temporaly las ventanas Z-pila. </li><li> Creó la serie de tiempo y parámetros de adquisición de pila Z como se describe en los pasos 2.14 y 2.15. Haga clic en &quot;Experimento de inicio&quot; en la pestaña de adquisición para iniciar la recopilación de imágenes. </li></ol></li><li> Monitorear el ratón durante la formación de imágenes para asegurarse de que es estable e inconsciente. Si el ratón es inestable y / o consciente durante la exploración, quite el ratón desde el escenario, inyectar 100-150 l adicional de la solución anestésica por vía intraperitoneal, y continuar imágenes. Nota: Los signos de inestabilidad incluyen respiración rápida y el movimiento del ratón, que puede ser visto como el cambio artefactos en las imágenes adquiridas. </li><li> Después de la adquisición de imágenes, tomar el ratón fuera del escenario y devolverlo a la jaula. Utilice una lámpara de calentamiento para mantener el calor, y controlar el ratón hasta que esté consciente. </li></ol> Análisis de Imagen y 3. Cuantificación <ol><li> Utilice el software de análisis de imágenes para analizar los datos en 3D y de series de tiempo. Abra el programa yañadir imágenes arrastrándolas a la pantalla abierta, que se llama punto de vista &quot;Arena&quot;. Haga doble clic en un archivo de imagen para abrirla; la imagen se abrirá bajo la vista &quot;Supera&quot;. </li><li> Crear una imagen de 2D / 3D. <ol><li> En la barra de &quot;Más&quot; que se encuentra en la esquina superior derecha, haga clic en &quot;Editar / exhibición de la demostración de ajuste&quot; para abrir &quot;de ajuste de visualización&quot; de la ventana. Optimizar la visualización de fluorescencia mediante el ajuste de los umbrales para cada canal, y tomar una instantánea para guardar la imagen. </li></ol></li><li> Generar pistas de objetos a partir de imágenes con lapso de tiempo. <ol><li> Abra la imagen que se analiza en la vista &quot;Supera&quot;. Haga clic en el icono con una imagen de puntos de color naranja, que se encuentra debajo del icono &quot;Supera&quot;. Esto abrirá una nueva ventana &quot;Spots&quot;. </li><li> Marque &quot;de los puntos de pista (en el tiempo)&quot; y haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso. Seleccione el canal que contiene los objetos para realizar un seguimiento en &quot;Channel Fuente&quot;, y establecer el objeto Diamet estimadoer en &quot;XY diámetro estimado&quot; escribiendo un número en. Haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso. Nota: Para el seguimiento de los neutrófilos, seleccionar el canal que contiene APC de fluorescencia para los neutrófilos y establecer el diámetro objeto a 12 micras sobre la base del tamaño conocido de neutrófilos. </li><li> En la ventana, buscar y seleccionar el filtro &quot;Calidad&quot; haciendo clic en la flecha hacia abajo. Observe los puntos definidos por el software y ajustar el umbral manualmente para incluir o excluir puntos. Una vez que se define el umbral, haga clic en la flecha azul para ir a la &quot;Pista&quot; paso. </li><li> Conforme al algoritmo, buscar y seleccionar &quot;Autoregresivo Movimiento Algoritmo&quot; haciendo clic en la flecha hacia abajo. Tipo de 10 micras para &quot;Distancia máxima&quot; y 3 para &quot;Tamaño máximo de Gap&quot; que se encuentra en Parámetros. Marque &quot;Rellenar los huecos con todos los objetos detectados&quot; para iniciar el seguimiento, y haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso. Nota: &quot;algoritmo de movimiento Autoregresivo&quot; se utiliza fu objetos que han dirigido el movimiento, ya que genera pistas basados ​​en localización predicha por el movimiento anterior. &quot;Max Distancia&quot; y &quot;Tamaño Max Gap&quot; puede ser ajustada en función de la dimensión esperada y la velocidad del objeto que está siendo rastreado, así como la duración total de la imagen de lapso de tiempo. </li><li> Bajo Tipo de filtro, seleccione el filtro &quot;Duración total&quot;. Haga clic en la flecha verde para finalizar el seguimiento, y comprobar las pistas que se han generado. Volver al paso anterior si es necesario para ordenar manualmente las pistas. </li></ol></li><li> Si las derivas de imágenes con lapso de tiempo generados, corregir la deriva de la traducción. <ol><li> Haga clic en el icono con una imagen de un lápiz. Se trata de una pestaña de edición que se abre &quot;Edición de Pistas&quot; ventana. Examinar la imagen de lapso de tiempo y encontrar un punto de referencia que no debe estar en movimiento para todas las imágenes. </li><li> En la esquina superior izquierda de la pantalla, encontrará ventana &quot;Puntero&quot; y marque &quot;Seleccionar&quot; para activar el cursor para la selección de un punto. Haga clic en el punto de referencia. </li><li> Haga clic en &quot;Drift correcta&quot; en la ventana &quot;Editar pistas&quot;. Marque &quot;traslacional Drift&quot;. El software generará automáticamente la serie corregida de imágenes. </li></ol></li><li> Medir el movimiento celular definido por las pistas de objetos en imágenes con lapso de tiempo. <ol><li> Bajo la ventana &quot;Editar pistas&quot;, marque &quot;Tracks&quot; y seleccione una pista que representa el movimiento de una célula. La pista seleccionada se resalta en amarillo en la imagen de series de tiempo en. </li><li> Haga clic en el icono con una imagen de un gráfico para abrir la ventana (pestaña estadísticas) &quot;estadísticas&quot;. </li><li> En &quot;Selección&quot;, seleccionar &quot;Track velocidad media&quot; haciendo clic en la flecha hacia abajo para generar significa que la velocidad de la pista para la pista seleccionada. Elegir diferentes pistas y repita los pasos para medir significa que la velocidad de la pista para todas las células de interés. </li></ol></li></ol>

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<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVacaru%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

En tiempo real, de imágenes en serie de los procesos celulares dinámicos en la médula ósea proporciona información que de otro modo un reto para obtener usando técnicas convencionales tales como la histología y los recuentos sanguíneos totales. El modelo WC fémur descrito aquí ofrece oportunidades únicas para investigar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea con el tiempo. Aunque un modelo de fémur WC se ha informado anteriormente, nuestro nuevo diseño proporciona un campo de la imagen de visión má...

La médula ósea es un órgano importante que participa en la hematopoyesis y la regulación inmune. Se compone de un componente hematopoyético que contiene las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs), y un componente del estroma que contiene células progenitoras no hematopoyéticas que dan lugar a células mesenquimales 1. Dos tercios de la actividad hematopoyética se dedica a la generación de células mieloides 2. En particular, un gran número de neutrófilos se producen en la médula ósea, con 1-2 x 10 11 células generadas por día en un ser humano adulto normal 2. Los neutrófilos son la primera línea de defensa contra las infecciones microbianas y son en su mayoría reservados en la médula ósea hasta que el estrés desencadena su movilización para complementar los neutrófilos periféricos 1,3. Además de sus efectos anti-microbianos, estudios recientes sugieren un papel importante de los neutrófilos en la biología del cáncer, que tiene tanto pro- y anti-fenotipos tumorigénicos en función de crecimiento transformantefactor beta (TGF-β) de señalización en el 4,5 microambiente tumoral. Por otra parte, los estudios demostraron que los neutrófilos que se acumulan en los tumores primarios ejercen efectos pro-tumorigénicas y metastásicas mediante la supresión de la función citotóxica de las células T 6,7, mientras que los neutrófilos en circulación ejercen un efecto citotóxico anti-metastásico 8. Como tal, la investigación de las células hematopoyéticas en la médula ósea, en particular los neutrófilos, es crucial para la aclaración de su papel en la regulación inmune y tumor. Histopatología y un recuento completo de sangre periférica se utilizan habitualmente para evaluar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea 9. Sin embargo, estos métodos sólo proporcionan información estática de diferentes poblaciones de células o de tejidos microestructuras. Longitudinal de imágenes in vivo se puede utilizar en combinación con los métodos estándar para evaluar la dinámica de múltiples componentes celulares, vasculares y del estroma, así como la célula a-cell interacciones de manera longitudinal. Microscopía intravital (IVM), definido como formación de imágenes de animales que viven en la resolución microscópica 10, es particularmente útil para la evaluación de los procesos celulares dinámicos en el tiempo en la misma muestra, lo que reduce el número de animal experimental requerido. IVM se combina a menudo con una cámara de ventana trasplantado crónicamente (WC) para acceder al órgano de interés para obtener imágenes de más de una duración de semanas a meses. modelos WC craneal y dorsal-pliegue de la piel tienen la más larga historia de uso se remonta a mediados de la década de 1990. Más recientemente, otros modelos de WC de órganos específicos, tales como las de la almohadilla de grasa mamaria y varios órganos abdominales se han desarrollado 11. El enfoque típico para obtener imágenes de la médula ósea in vivo tiene la exposición participa principalmente de la bóveda craneal de ratones, donde el hueso adelgazada permite la visualización directa de las células individuales con una intervención quirúrgica mínima 12-14. Sin embargo, la médula ósea de calota puede be distinta de la de otros huesos, tales como el hueso largo, como se demuestra por un menor número de HSPCs y células hipóxicas en bóveda craneal, lo que indica mantenimiento y desarrollo de HSPCs 15 reduce. Por lo tanto, se han investigado enfoques alternativos para evaluar los componentes celulares en el hueso largo. Estos incluyen la exposición directa de la médula ósea del fémur 16 y el trasplante ectópica de fémur fractura en el pliegue cutáneo dorsal 17 WC. Sin embargo, el primero es un procedimiento del terminal que no permite el rastreo de alteraciones celulares, estructurales y funcionales durante períodos de tiempo más largos, y el segundo probable perturba la función normal de la médula ósea debido a el trasplante de fémur a un sitio ectópico en el interior del WC dorsal del pliegue cutáneo. Otro método que permite formación de imágenes de serie ortotópico de médula ósea femoral en el tiempo es el uso de un WC en el hueso femoral. Un informe anterior demostró imágenes a largo plazo de la microcirculación en la médula ósea del fémur usando unaWC fémur en ratones 18. Adicionalmente, los autores demostraron la visualización de las células tumorales en el fémur, lo que indica su utilidad en la metástasis ósea de monitoreo hueso. Sin embargo, este diseño WC estaba limitado por su gran tamaño (1,2 cm de diámetro) y área de imagen relativamente pequeña (4 mm de diámetro), que fue sólo es adecuado para los ratones grandes (26 a 34 g, de 3-6 meses de edad) con lo que el acercarse poco prácticos para su uso rutinario. Por lo tanto, un nuevo WC con un tamaño general más pequeño y el área de formación de imágenes interno más grande fue diseñada con el propósito de este estudio. El objetivo de este estudio era proporcionar un método para obtener imágenes de diversos tipos de células en la médula ósea femoral. El modelo WC fémur fue desarrollado internamente y se utiliza para visualizar y realizar un seguimiento de los neutrófilos dentro de la red vascular 3D. Usando este modelo, IVM de la médula ósea se puede realizar en serie de más de 40 días. Este enfoque se puede aplicar a una variedad de campos para elucidar los procesos de la hematopoyesis, la regulación inmune unand el desarrollo de tumores.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F ratones desnudos atímicos</td><td>Taconic</td><td>Ncr desnudo de</td><td>8-10 semanas de edad, hembra</td></tr><tr><td>Salina</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de ketamina</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>Paño quirúrgico DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Proxima DYNJP2405</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica eléctrica</td><td>Life Brand 57800827375</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para los ojos (gel lagrimal)</td><td>Novartis&nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% alcohol isopropílico</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td> <td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte curvadas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de bebé Hemostático</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Graefe extra finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemostáticos de mosquitos Halsted Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Microtaladro</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Microtaladro</td><td>Fresas Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de ventana de fémur</td><td>PMCC taller de máquinas</td><td>diseño personalizado</td><td>9,1 mm- 8,5 mm- 7,5 mm (diámetro exterior a interior), 2,16 mm (radio de dos orificios), 13,9 mm (distancia entre dos orificios), 0,7 mm (grosor)</td></tr><tr><td>Barra en forma de U</td><td>Diseño</td><td></td> <td>personalizado del taller de máquinas PMCC13,8 mm (largo), 1,6 mm (ancho), 3,7 mm (alto)</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (8 mm)</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Anillo de retención (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>Tuercas (hexágono de acero inoxidable)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Sutura (5-0 Monosof negro)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Temgesic)</td><td>Reckitt, Benckiser</td>, <td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer, Ingelheim</td>, <td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoxicilina (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Etapa de imagen</td><td>PMCC taller de máquinas</td><td>diseño personalizado</td><td>15,9 cm (largo), 11 cm (ancho), 0,9 cm (alto)</td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Software de análisis de imágenes descrito en la Sección 3 del Protocolo&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Software de adquisición de imágenes descrito en la Sección 2 del Protocolo&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fémur window cámara modelo de<em&gt; en vivo</em&gt; seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

La médula ósea es un órgano complejo que contiene varias células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. Estas células participan en muchos procesos biológicos, como la hematopoyesis, la regulación inmunitaria y la regulación tumoral. Los métodos comúnmente utilizados para comprender las acciones celulares en la médula ósea, como la histología y los recuentos sanguíneos, proporcionan información estática en lugar de capturar la acción dinámica de múltiples componentes celulares in vivo. Para complementar los métodos estándar, se desarrolló un modelo basado en cámara de ventana (CC) para permitir la obtención de imágenes in vivo en serie de células y estructuras en la médula ósea murina. Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para instalar el CC en el fémur, con el fin de facilitar el acceso óptico a largo plazo a la médula ósea femoral. En particular, para demostrar su utilidad experimental, este enfoque de WC se utilizó para obtener imágenes y rastrear neutrófilos dentro de la red vascular del fémur, proporcionando así un método novedoso para visualizar y cuantificar el tráfico y la regulación de las células inmunitarias en la médula ósea. Este método se puede aplicar para estudiar diversos procesos biológicos en la médula ósea murina, como la hematopoyesis, el trasplante de células madre y las respuestas inmunitarias en condiciones patológicas, incluido el cáncer.

Murino médula ósea femoral se accede con éxito utilizando el WC para permitir la visualización de los neutrófilos individuales y redes vasculares. La figura 1 muestra el instrumento WC y se describe el procedimiento quirúrgico, que consiste en la exposición del hueso femoral y el adelgazamiento de hueso cortical para obtener acceso óptico dentro de la hueso. La cirugía es bien tolerado en ratones; que se evaluaron para las reacciones físicas adversas, tales como hinchazó...

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes microscópicas a largo plazo y el seguimiento de neutrófilos en estructuras vasculares dentro de la médula ósea murina mediante una cámara de ventana crónica implantada sobre el hueso femoral. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología y oncología sobre el papel de los monocitos en la regulación de una infección, la tumorigénesis y la metástasis tumoral. Las principales ventajas de esta técnica son que permite el acceso microscópico a largo plazo a la médula ósea del fémur, un sitio central de hematopoyesis, y proporciona información dinámica que de otro modo sería difícil de obtener mediante métodos convencionales.Aunque este método es específico para la obtención de imágenes de neutrófilos dentro de una red vascular, también puede utilizarse para visualizar otras poblaciones de células inmunitarias de interés. El día de la cirugía, confirme el nivel adecuado de sedación mediante la ausencia de respuesta a un pellizco en el dedo del pie de un ratón desnudo atímico. Luego, coloque el ratón sobre una almohadilla eléctrica calefactora, cubierta con un campo quirúrgico, bajo un microscopio estereoscópico.A continuación, aplique ungüento en los ojos del animal y esterilice el área quirúrgica con dos pasadas sucesivas de povidona-yodo al 7,5%, alcohol isopropílico al 70% y povidona-yodo al 10%. Una vez preparado el animal, utilice un escalpelo con una hoja número 15 para realizar una incisión cutánea longitudinal de 10 milímetros, aproximándose al fémur desde el lado lateral. Luego, realice una disección roma con pinzas y hemostáticos para exponer el fémur entre los músculos flexores y extensores.Cuando se pueda observar el fémur, inserte una barra en forma de U debajo del hueso e instale la cámara de ventana. Con dos tuercas, asegure la barra a la ventana. Luego, apriete las tuercas con pinzas.Utilice la pinza para reajustar la musculatura de los flexores y extensores a sus ubicaciones originales. Rellene el espacio entre el hueso y la cámara de ventana con cemento dental para fijar la cámara en su lugar. Luego, utilice un microtaladro para desgastar un área de seis por dos milímetros en el hueso cortical y obtener acceso óptico a la cavidad medular.Cuando se obtenga una capa periostea del hueso casi transparente, coloque un cubreobjetos de ocho milímetros sobre la ventana y utilice un anillo de sujeción para fijar el cubreobjetos en su lugar. A continuación, cierre la dermis con una sutura 5-0 y un portaagujas. Luego, coloque el ratón en una jaula nueva con cama limpia, y realice un monitoreo hasta que se recupere completamente.Para obtener imágenes combinadas de microscopía de multiphotones y confocal a través de la cámara de ventana, primero inyecte las soluciones fluorescentes adecuadas para la marcación de la vasculatura y neutrófilos en la vena caudal del ratón. Sujete los extremos de la cámara de ventana con pinzas de cocodrilo para fijar al ratón en la platina hecha a medida. Luego, coloque la platina de imagen en el microscopio combinado de multiphotones y confocal.Una vez asegurado el ratón, encienda el láser de dos fotones y el sistema confocal, y haga clic en Iniciar sistema para lanzar el software de adquisición de imágenes. Para configurar los canales de imagen, en la pestaña Adquisición, haga clic en Configuración rápida y seleccione los láseres para la adquisición de imágenes. Elija Mejor señal y haga clic en Aplicar.Agregue manualmente el canal de adquisición de imágenes de generación de segundo armónico activando el láser de dos fotones en la ventana Láser y configurando las longitudes de onda de adquisición adecuadas para la generación de segundo armónico. En la pestaña Localizar, haga clic en Oculares en línea y localice la región de interés mediante el microscopio mediante inspección visual. Haga clic en Oculares fuera de línea y abra la pestaña Adquisición.En la ventana Canales, seleccione la pista FITC y haga clic en Directo para previsualizar la imagen de FITC-Dextrano con un objetivo de 5x. Ajuste el enfoque según sea necesario. Luego, haga clic en Detener en la pestaña Adquisición para detener la previsualización.Ahora, seleccione manualmente el objetivo acuático de 20x y visualice nuevamente la imagen de FITC-Dextran, ajustando la Ganancia principal y el Diafragma en la ventana Canales para obtener la mejor señal y contraste. Cuando se haya obtenido una imagen óptima para los tres canales, seleccione todos los canales en la ventana Canales y haga clic en Capturar en la pestaña Adquisición para obtener una instantánea en 2D. A continuación, para adquirir una imagen en 2D con lapso de tiempo, seleccione Serie Temporal para abrir la ventana de Serie Temporal e ingrese cero para los intervalos y 40 para el número total de escaneos, con el fin de obtener 40 imágenes de forma continua sin intervalo de tiempo.Para analizar las imágenes, abra el software adecuado de análisis de imágenes y abra un archivo de imagen. Para generar rastros de objetos utilizando las imágenes de lapso de tiempo, en la vista Surpass, abra la imagen que se analizará y haga clic en el icono con una imagen de puntos naranjas para abrir la nueva ventana Spots. Después de configurar los parámetros de seguimiento, marque la casilla Rellenar huecos con todos los objetos detectados para iniciar el seguimiento.Haga clic en la flecha azul para pasar al siguiente paso. En Tipo de filtro, seleccione el filtro de Duración de la trayectoria y haga clic en la flecha verde para finalizar el seguimiento. Luego, revise las trayectorias generadas, volviendo al paso anterior según sea necesario.Para medir el movimiento celular, definido por las pistas de objetos en las imágenes de intervalos de tiempo, en la ventana Editar pistas, seleccione la casilla Pistas y elija una pista que corresponda al movimiento de la célula de interés. La pista seleccionada se resaltará en amarillo en la imagen de la serie temporal. Finalmente, en la pestaña Estadísticas, haga clic en el icono con la imagen de una gráfica para abrir la ventana de Estadísticas.Luego, en Selección, haga clic en la flecha hacia abajo para generar la Velocidad Media de la Pista. La vasculatura dentro de la médula ósea puede visualizarse mediante colorantes intravasculares, como el Dextrano-FITC. Dado que el contraste depende de la inyección del colorante, la imagen adquirida representa la vasculatura funcional donde existe un flujo sanguíneo suficiente.Estas imágenes del mismo área de la médula ósea en diferentes momentos demuestran la presencia de neutrófilos tanto en los espacios intravasculares como extravasculares durante un período de varios días. La obtención de imágenes de este hueso cortical, compuesto principalmente de fibras de colágeno, se realizó mediante generación de segundo armónico, lo que ilustra además la infiltración del tejido vascular por neutrófilos. Estos neutrófilos fueron rastreados en el nicho vascular de la médula ósea sin intervalos de tiempo adicionales entre cada escaneo, lo que permitió un seguimiento preciso de su movimiento.La velocidad de las trayectorias generadas por el software de análisis de imágenes puede medirse entonces para analizar la velocidad de cada célula. Tras este procedimiento, otros métodos, como el uso de células marcadas *ex vivo* o ratones transgénicos con reporteros, pueden emplearse para evaluar otros procesos biológicos *in situ*, tales como la influencia de las células inmunitarias en la progresión tumoral y la metástasis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo instalar una cámara de ventana en el hueso fémur de un ratón para rastrear neutrófilos a través del nicho vascular de la médula ósea y las estructuras de colágeno.

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras en serie de médula ósea femoral (BM) sin requerir el sacrificio de ratones. Este procedimiento facilita los estudios longitudinales de la composición de la BM de los ratones a lo largo del tiempo y proporciona acceso en serie a las células dentro de la BM para estudios ex vivo y de trasplante.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Se presenta una estrategia para analizar cuantitativamente los datos histológicos en la médula ósea. La microscopía confocal de células marcadas con fluorescencia en secciones de tejido da como resultado imágenes bidimensionales, que se analizan automáticamente. Los análisis de colocalización de diferentes tipos de células se comparan con los datos de imágenes simuladas, lo que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones celulares.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Se presenta un método para crear y vivir-imagen diferentes nichos humanizados de médula ósea en ratones. Basándose en el nicho de soporte creado por las células mesenquimales humanas, la adición de células endoteliales humanas induce la formación de vasos humanos, mientras que la adición de rhBMP-2 induce la formación de tejido óseo maduro quimérico humano-ratón.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.

In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

La microscopía intravital permite el estudio de procesos biológicos dinámicos como la regeneración de tejidos y el desarrollo de tumores. La médula ósea del calvario, un tejido altamente dinámico, ofrece información sobre la hematopoyesis y la función vascular. El uso de un implante de fijación de cabeza biocompatible impreso en 3D permite obtener imágenes longitudinales repetitivas, lo que mejora nuestra comprensión de la dinámica de los tejidos y el microambiente tumoral.

Imagen longitudinal intravital de la dinámica vascular en la médula ósea del calvario

El modelo de lesión de la médula ósea murina es una herramienta útil para estudiar la osteogénesis postnatal a través de la osificación intramembranosa. Este protocolo quirúrgico simplificado describe el procedimiento de ablación de la médula ósea para la evaluación posterior de la formación de hueso nuevo y las respuestas celulares después de una lesión.

Metodología mejorada para el estudio de la osteogénesis postnatal mediante osificación intramembranosa en un modelo de lesión de médula ósea murina

Aprende a realizar imagen intravital de largo plazo de neutrófilos en la médula ósea femoral murina mediante un modelo de cámara ventana. Esta técnica utiliza microscopía de fluorescencia multifotón para estudiar dinámicas inmunes y oncológicas in vivo.

Fémur Window Cámara Modelo de

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