La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación Coxiella burnetii Durante siRNA silenciamiento

El objetivo general de este procedimiento experimental es examinar el impacto de procesos específicos del huésped en la capacidad de los patógenos bacterianos para translocar proteínas efectoras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología celular. Específicamente, cómo el huésped está involucrado en el bloqueo o la promoción de la entrega de efectores de virulencia bacteriana en la célula huésped.

La principal ventaja de esta técnica es que combina dos técnicas establecidas. A saber, el silenciamiento del gen siRNA y el ensayo reportero para medir la translocación de proteínas bacterianas. Investigar la interacción entre los patógenos y la célula eucariota.

Este método proporciona información sobre la patogénesis de la coxiella y también se puede aplicar para investigar las interacciones entre el huésped y el patógeno de otras bacterias que dependen de la translocación eficiente de proteínas. Por ejemplo, clamidia, salmonela y E. coli que se interconecta. Después de cultivar C. burnetii que expresa CBU0077, fusionar la betalactamasa de acuerdo con el protocolo de texto en un matraz de cultivo de 25 centímetros cuadrados con una tapa ventilada.

Inocular 10 mililitros de ACCM2 precalentado que contiene tres microgramos por mililitro de cloranfénico con 20 microlitros de la bacteria. Cultive el cultivo a 37 grados centígrados con cinco por ciento de dióxido de carbono y 2,5 por ciento de oxígeno durante siete días. Para revertir la transfectación de células hela con siRNA y después de preparar el siRNA de acuerdo con el protocolo de texto, coloque DMEM más 10% de FCS, 05% de tripsina EDTA y PBS en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos para calentar antes de usar.

Para cada transfección experimental de siRNA, combine 0,4 microlitros de reactivo de transfección y 63,6 microlitros de medios séricos reducidos en un tubo de microfuga individual. Agite todos los tubos de microfuga y deje que los componentes se acomplejan durante cinco minutos a temperatura ambiente. Añadir 16 microlitros de cada siRNA experimental a los tubos de microfuga correspondientes que contienen el complejo de transfección.

A continuación, vórtice e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante los 20 minutos de incubación, agregue 20 microlitros del reactivo de transfección, el medio sérico reducido y la mezcla de siRNA en los pocillos apropiados de una bandeja estéril de 96 pocillos, negra, plana y de fondo transparente. También durante la incubación de 20 minutos, use 10 mililitros de PBS precalentado para lavar una monocapa de células hela confluentes o subconfluentes en un matraz de 75 centímetros cuadrados.

Agregue un mililitro de solución de 05 por ciento de tripsina EDTA al matraz e incube a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante tres a cinco minutos para separar las celdas. Recoja las células en nueve mililitros de DMEM precalentado con 10% de FCS. Usar un hemocitómetro para contar las células.

Luego, con DMEM 10%FCS, lleve las celdas a una densidad final de 4.9 por 10 a las cuatro celdas por mililitro. Inmediatamente después de la incubación de 20 minutos, pipetee 80 microlitros de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene la mezcla de transfección de siRNA, lo que llevará la densidad celular a 3,92 veces 10 a la tercera célula por pocillo. Este es el paso más crítico del procedimiento.

Es muy importante que las células hela se añadan a la mezcla de transfección de siRNA inmediatamente después de la incubación de 20 minutos. De lo contrario, la eficiencia de la transfección puede verse comprometida. Asegúrese de que los pozos en blanco contengan solo 80 microlitros de DMEM más 10% de FCS.

Incubar la placa durante 24 horas. Luego, con un adaptador multicanal conectado a una fuente de vacío y una pipeta, reemplace el medio con 100 microlitros de DMEM fresco más 10% de FCS. Incuba las células durante 48 horas más.

Después de siete días de crecimiento en ACCM2, centrifugar los 10 mililitros de cultivo de C.burnetii P BlaM CBU0077 a 15.000 veces g y temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de retirar el sobrenadante, utilice 10 mililitros de DMEM FCS precalentado para volver a suspender el pellet. A continuación, utilice agua para preparar diluciones de una en diez y una en cien en un volumen final de 100 microlitros del cultivo y configure la QPCR de acuerdo con el protocolo de texto.

Después de calcular los genomas totales por mililitro en el cultivo de CBU0077 C.burnetii P BlaM, utilice DMEM FCS precalentado para ajustar el volumen del cultivo a dos mililitros para una concentración de 1,88 veces 10 a las ocho bacterias por mililitro. A continuación, retire el medio de las celdas en blanco y transfecte inversamente. Luego agregue 50 microlitros de las bacterias diluidas a los pocillos apropiados y agregue 50 microlitros de DMEM FCS a los pocillos en blanco y no infectados.

Después de preparar las soluciones para el sustrato BlaM de acuerdo con el protocolo de texto, prepare una mezcla maestra combinando 1,8 microlitros de solución A y 16,2 microlitros de solución B. Mezcle bien el tubo por vórtice. A continuación, añadir 237 microlitros de solución C y 45 microlitros de probenecid 0,1 molar. Vuelve a vórtice el tubo.

Agregue 10 microlitros de la solución de carga Six X directamente en todos los pocillos en blanco y transfectados inversos sin eliminar el medio existente. Incube la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos horas. Para determinar el nivel de translocación, en un lector de microplacas, cree un protocolo de intensidad de fluorescencia utilizando Endpoint como modo de lectura.

Seleccione la microplaca de 96 pocillos, luego, en la configuración óptica, seleccione dos multicromáticos y, para el primer número preestablecido, ingrese 410-10 nanómetros de excitación y 520-10 emisión. Para el segundo número preestablecido, ingrese 410-10 nanómetros de excitación y 450-10 de emisión. A continuación, asegúrese de que la opción Multicromática de pozo esté seleccionada.

A continuación, seleccione Promedio orbital con un diámetro de tres milímetros. En Óptica, seleccione Óptica inferior. A continuación, en Velocidad y precisión, seleccione Preciso.

Esto corresponde a ocho regiones por pozo. Ajuste el diseño de la placa seleccionando los pocillos apropiados como blancos y pocillos de muestra. A continuación, seleccione Iniciar medición.

Retire la tapa y coloque la bandeja en el lector de placas. Asegúrese de que el valor de ganancia esté ajustado para evitar alcanzar los valores máximos de fluorescencia realizando un ajuste de ganancia en uno de los pocillos infectados que se haya transfectado inversamente con ARNip de OTP. Seleccione Iniciar medición para medir todos los pocillos apropiados utilizando fluorescencia de fondo a una excitación de 410 nanómetros y emisión de 450 nanómetros y 520 nanómetros para fluorescencia azul y verde respectivamente.

Analice los resultados de acuerdo con el protocolo de texto. Esta figura muestra un ejemplo del valor umbral del ciclo esperado tanto de los estándares como de las muestras después de la QPCR para determinar el número total de genomas por mililitro en el cultivo de C. burnetii de siete días. Sobre la base de estos datos, hubo 2,31 veces 10 a los ocho genomas por mililitro en el cultivo bacteriano resuspendido de 10 mililitros.

Aquí se muestra el resultado del silenciamiento de Rab5A o Rab7A en la translocación del efector de tres experimentos independientes después de la incubación de las células transfectadas inversas con sustrato BlaM. Se produjo una disminución significativa en el nivel de translocación de BlaM CBU0077 durante el silenciamiento de Rab5A y Rab7A en comparación con el control de OTP. Como se demuestra en este gráfico, aunque el tratamiento con Rab5A o Rab7A da como resultado una reducción en la viabilidad celular en comparación con el control de OTP, esta reducción no es tan severa como el tratamiento con PLK1, un gen conocido por causar la muerte celular cuando se silencia.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo silenciar objetivos específicos del huésped usando siRNA y, posteriormente, investigar el impacto que esto tiene en la translocación de proteínas efectoras bacterianas utilizando un ensayo reportero basado en FRET. Este protocolo ha sido optimizado tanto para el silenciamiento de las GTPasas Rab como para la infección por coxieller de células hela. Para utilizar este método para dirigirse a otras proteínas del huésped, las condiciones de transfección requieren optimización para garantizar un silenciamiento génico eficiente.

De manera similar al uso de este método con otros patógenos bacterianos, la condición de infección requiere optimización.