Name: Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende a analizar la morfología mitocondrial en cerebro de ratón mediante microscopía electrónica de barrido de bloque-seriado. Esta técnica automatizada permite reconstrucciones 3D detalladas para investigar trastornos neurodegenerativos.

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Agradecemos a Sidney Walker por proporcionar ayuda técnica. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención del Instituto Nacional de Salud (1R01EY024712-01A1).

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en Virginia Tech. Precaución: las precauciones extremas deben ser tomadas al manipular y desechar varios componentes utilizados en este protocolo. Antes de su uso, la directrices institucionales y las prácticas de salud y seguridad local debe establecer y seguir, en particular para el tetróxido de osmio, que es volátil y extremadamente venenosa, acetato de uranilo, que es a la vez un metal pesado y la fuente de radiactividad, y nitrato de plomo, que es un veneno de metales pesados. Tiocarbohidrazida (TCH) puede descomponerse para producir gases explosivos y tóxicos, por un manejo inadecuado. Muchas instituciones tendrán la facilidad de la base de EM en los que estos reactivos se utilizan de forma rutinaria y pueden proporcionar asistencia. 1. Preparación del tejido cerebral y SBFSEM Imaging <ol><li> Anestesiar a un joven (~ 2 - 4 meses de edad) C57 de ratón negro (C57BL / 6J) usando 4 - 5% isoflurane siguiendo las directrices institucionales. Confirmar la anestesia mediante el control de la pérdida de tono muscular, falta de movimientos voluntarios y las respuestas a los estímulos aversivos como un pellizco de la cola. </li><li> Pin el ratón sobre una bandeja de disección y hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media ventral. Hacer más incisiones en la piel para exponer la caja torácica del ratón. Incisión en el diafragma, y ​​cuidadosamente diseccionar la cavidad torácica a lo largo de la periferia para exponer el corazón latiendo, y luego hacer una incisión en la aurícula derecha. </li><li> El uso de una cánula de mariposa, canular el ventrículo izquierdo. Perfundir el ratón transcardially usando 10 - 20 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) pH 7,2, hasta que la hemorragia es confirmado por un cambio en el color del hígado. Nota: Un cambio en el color de hígado se utiliza como una guía para determinar el grado de desangrado. Confirman que los cambios de color de hígado de color marrón rojizo a rosa pálido. </li><li> Perfundir el ratón transcardially usando 10 - 20 ml de 2% glutaraldehído y 4% de paraformaldehído hizo en tampón 0,10 M de cacodilato (pH 7,2), para fijar el tejido cerebral rápidamente desde dentro. La fijación se controla mediante la observación de la rigidez de la cola. Nota: Preparar 0,10 M tampón de cacodilato (pH 7,2) disolviendo 2,14 g de cacodilato de sodio en 80 ml de agua, añadir ácido clorhídrico para ajustar el pH, y completar el volumen a 100 ml con agua. </li><li> Tras la perfusión, decapitar el ratón, diseccionar el cerebro, seguido por fijación en tampón 0,10 M de cacodilato de sodio (pH 7,2) que contiene 2% de glutaraldehído y paraformaldehído al 4% durante 48 horas a 4 ° C </li><li> Después de 48 hr hacer 400 micras secciones coronales utilizando un vibratome y luego diseccionar cuidadosamente la región de interés en el cerebro (por ejemplo, el hipocampo) bajo el microscopio de disección 42. Recortar con precisión el tejido y tomar una foto para la conservación de la orientación. Nota: Enviar métodos de procesamiento de tinción de tejidos en SBFSEM combina una variedad de métodos de tinción de metales pesados ​​encon el fin de mejorar la resolución y se basan en el método desarrollado previamente por Deerinck et al 40. </li><li> Lavar los tejidos fijados con glutaraldehído 3 veces, 5 minutos cada uno en tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,2). </li><li> Preparar la solución de ácido tánico 0,1% por disolución de ácido tánico en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,2). Agitar hasta que se disuelva y filtrar a través de 0,45 micras filtro, si es necesario. </li><li> Postfix los tejidos con cacodilato tamponada 0,1% de ácido tánico por incubación en 1 ml de reactivo durante 30 - 60 min a TA. Nota: El tiempo de incubación depende del tamaño del tejido, pero 30 min funciona mejor para la mayoría de los tejidos. </li><li> Lavar tejidos 3 veces, 5 min cada uno en tampón de cacodilato (pH 7,2). </li><li> Disolver 0,3 g de ferrocianuro de potasio y 0,86 g cacodilato de sodio en 10 ml de H2O destilada (dH2O). Mantener la solución de ferrocianuro de potasio en hielo. Justo antes de su uso, añadir 10 ml de 4% tetróxido de osmio (OsO4). </li><li> Teñir los tejidos con 2% de SGsolución de ferrocianuro-prima durante 90 minutos, en hielo. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O </li><li> Preparar 1% tiocarbohidrazida solución (TCH) disolviendo 0,1 g de TCH en 10 ml de dH2O Disolver en 60 ° C por agitación cada 10 min hasta que esté completamente disuelto. Observar las precauciones de seguridad durante la manipulación de TCH, sobre todo tener cuidado de evitar el uso de los metales, el calentamiento a alta temperatura, o permitiendo que la solución se seque. </li><li> Se tratan las muestras con 1% recién preparada TCH durante 20 min a RT. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O </li><li> Diluir 4% OsO4 al 2% con dH 2 O, tejidos de manchas con 2% de tetróxido de osmio acuoso por incubación durante 1 hr. Lavar tejidos 3 veces, 5 minutos cada uno con dH2O </li><li> Se incuban las muestras S / N en acetato de uranilo al 1% en H2O destilada a 4 ° C. </li><li> Preparar la solución de aspartato ventaja de Walton (como se describe por Deerinck et al 40). <ol><li> Disolver 0,998 g L-aspartato en 250 ml de H2O destiladay luego añadir 10 N de hidróxido de potasio (KOH) de una manera gota a gota hasta que el pH alcanza 5,5. Después de ajuste del pH, añadir 0,066 g de nitrato de plomo en 10 ml aspártico Stock ácido y calor a 60 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Enjuague tejidos en dH2O y se incuba con tinción aspartato ventaja de Walton durante 30 minutos en un horno a 60 ° C. Lavar 3 veces, 5 minutos cada uno en dH2O </li><li> Deshidratar muestras a través de una serie graduada de alcohol utilizando soluciones refrigerados de 20%, 50%, 75%, 85% y 95% de etanol durante 5 min cada uno, seguido de 100% de etanol 3 veces, 10 min cada uno. Nota: Utilizar el 100% de etanol de la botella recién abierta, como el etanol abierto absorbe el agua del aire y causar la incrustación a fallar. incubaciones más largas serán necesarias con muestras de tejido más grandes. </li><li> muestras de lavado 2 veces, 15 minutos cada uno en óxido de propileno. </li><li> Hacer resina plástica incrustación utilizando 25 ml de resina, 10,5 ml DDSA (dodecenilo anhídrido succínico), 15,5 ml NMA (anhídrido metil nádico) y 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). Mezclar la resina por agitación. Giro y permitir que la resina reposar hasta que las burbujas de determinación. Nota: Esta es la receta estándar de dureza media. Otros tipos de microscopía de resina plástica electrónica (EM) se pueden utilizar, pero deben ser probados con una muestra de control no esenciales de antemano ya que no todas las resinas trabajan para SBFSEM. </li><li> Incubar los tejidos O / N en un 50: Mezcla de 50 de óxido de propileno resina y la incorporación, en un vial que tiene un tope inicialmente, a continuación, sin tapar después de 2 hr de modo que el óxido de propileno se evapora durante el período de aproximadamente 8-10 horas. </li><li> La transferencia de los tejidos a la resina de incrustación fresco 100% en viales limpios para 2 hr. </li><li> Insertar en muestras de resina fresca, incrustación en moldes planos que contienen las etiquetas de papel impresos, y los cura en un horno a 60 ° C durante 48 horas. Después de aproximadamente 1 hora, revisar la colocación del tejido y la alineación de nuevo, y ajustar si es necesario. </li><li> Recorte muestras para el área de interés y montar en un pin de aluminio utilizando Gelling pegamento de cianoacrilato o una resina epoxi conductora, a continuación, la capa con plata coloidal pasta alrededor de los lados del bloque para proporcionar un camino conductor a la clavija de aluminio. </li><li> Examinar muestras de tejido utilizando un sistema de microscopio electrónico de barrido equipado con una etapa ultramicrotomo en la cámara y un detector de electrones retrodispersados ​​baja kV 32. Nota: Obtener la formación in situ instrumento- y en la microscopía electrónica de barrido (SEM) utilizar y convertirse en un usuario autorizado. Como alternativa, la colaboración con un centro investigador o núcleo de pequeños proyectos puede ser posible. la formación de radiación también puede ser necesaria como SEM generan rayos x. </li><li> A la imagen de las muestras, utilice los siguientes valores: 2,25 kV, en el de 5 - 10 nm / píxeles de resolución, con tamaños de campo entre 80 - 250 micras en x, y (los tamaños posibles de otro campo), y un grosor de corte de 50 - 100 nm, con un total de 250 - 600 rebanadas en un 16 - período de tiempo de 20 horas. Nota: Los ajustes varían sustancialmente entre los diferentes microscopios, indimuestras indivi- y resolución deseada. Estos ajustes deben producir imágenes que son fácilmente interpretables para muchas muestras. </li></ol> 2. Analizar el conjunto de datos de imágenes Nota: El software Image J / Fiji se utiliza para analizar el conjunto de datos y se basa en el plugin TrakEM2. pasos de preprocesamiento se pueden realizar usando una variedad de software, y pueden estar amplia o menor dependiendo del nivel de experiencia y las pilas obtenidas. Las principales transformaciones usando el software de código abierto (ver ImageJ 1.50b, FIJI Descargar 1 Oct, 2015) se describen aquí. <ol><li> Convertir imágenes en formato TIFF de 8 bits de las imágenes de 16 bits de propiedad originales mediante la apertura en el software y seleccionar elementos del menú Imagen → Tipo → 8 bits. <ol><li> Si la conversión automática de contraste / brillo durante este paso no es ideal para las imágenes, vuelva a abrir las imágenes de 16 bits, y la prensa de imagen → → Ajuste de brillo / contraste. Seleccionar un rango que funciona para todas las imágenes y pulse Aplicar. A continuación, realice cCONVERSIÓN. Nota: En algunos SEM, este paso puede requerir software del fabricante del microscopio. </li><li> Si es necesario, debido al movimiento de la imagen inaceptable entre rebanadas (por ejemplo. La deriva debido a la carga), regístrese / alinear las pilas de imágenes (elementos de menú Plugins → → El registro lineal StackAlignmentWithSIFT). En la mayoría de software de registro, creado para el modo de &quot;sólo la traducción&quot; en lugar de &quot;cuerpo rígido&quot;. Nota: Muchos enfoques y software pueden trabajar: el plug-in de registro de obras SIFT para muchas aplicaciones y existe una versión de pila virtual. <ol><li> Si es necesario, ampliar el tamaño del lienzo antes de la inscripción (Imagen → Ajustar → tamañolienzo) o reducirla a un área de interés (Imagen → Recortar). Nota: Puede producirse cierta deriva o ensanchamiento, y tratando otros plugins o software puede producir mejores resultados. Opciones manuales también están disponibles (por ejemplo. ImageJ / FIJI, Plugins → Registro → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Si desired, imágenes en escala a un tamaño más pequeño, más manejable (por ejemplo. el 25%) utilizando ImageJ (Imagen → Escala). </li></ol></li><li> Iniciar el software, seleccione Archivo → Importar → secuencia de imágenes y luego seleccionar los archivos TIFF. </li><li> Poner en marcha el plugin seleccionando Archivo → Nuevo → TrakEM2 (espacio en blanco). Dos ventanas se abrirán; uno maneja el proyecto y area_lists y el otro maneja el rastreo, y se conoce como el &#39;lienzo&#39;. </li><li> Cargar la pila de imagen en el plugin haciendo un clic derecho sobre la importación de lona. Seleccione importación y haga clic en la pila de importación. En las opciones de pop-up, marca la casilla de pilas virtuales. Nota: Aunque las pilas de imágenes ya están abiertas en el software, sino que también se deben abrir en el complemento. El equipo puede funcionar sin problemas si la caja de pilas virtuales está marcada. </li><li> Después de los mipmaps se crean y se carga la pila, haga clic derecho de nombrar el proyecto bajo la ventana del plugin. Haga clic derecho sobre &quot;nuevo proyecto» en la col plantillaUMN, y seleccione &quot;añadir nuevo niño &#39;para ese proyecto. Haga clic derecho de nuevo para seleccionar &#39;area_list&#39;. </li><li> Establecer la escala del eje Z del proyecto de acuerdo con la configuración original micrografía electrónica haciendo clic derecho sobre el lienzo, a continuación, haga clic en la pantalla y seleccione la calibración. Además, ponga la Z escala mediante la selección de todas las capas en la ventana de plug-in, haga clic derecho para seleccionar la escala Z y grosor. </li><li> Haga clic y arrastre el &quot;proyecto&quot; y los &quot;niños&quot; en el proyecto de sección para crear las «listas de la zona &#39;en la pestaña&#39; espacio Z &#39;en la ventana de tela Objetos. </li><li> Seleccione la &#39;lista de áreas&#39; y haga clic derecho de seleccionar y establecer un color. Ahora, utilice la herramienta de pincel para trazar objetos tales como las mitocondrias, en las imágenes de micrografía electrónica. Uso &#39;Shift + clic&#39; que rellenar un círculo cerrado, &#39;Ctrl + scroll&#39; para acercar y alejar y, &#39;Alt + clic para hacer volver la pintura cursor del pincel en una goma de borrar. </li><li> Seleccionar dos áreas de ~ 10 - 15 micrasUnos 10 - 15 micras en la esquina superior izquierda y la esquina inferior derecha de la imagen e identificar todas las mitocondrias dentro de estas áreas para permitir el muestreo no sesgado de las mitocondrias en cada conjunto de datos. </li><li> En el &#39;lienzo&#39;, observar y rastrear las mitocondrias a través de las secciones. Nota: Las mitocondrias son orgánulos muy oscuros / densos que aparecen, de tamaño similar de diámetro y sin apretar cilíndricos. El crestas único formado por la membrana interna se distinguen fácilmente dentro de este orgánulo. </li><li> Cuando haya terminado con el rastreo, haga clic derecho en el area_list bajo la etiqueta de espacio Z, seleccione &#39;Show en 3D&#39;. Esto abrirá el plug-in visor 3D para ver una reconstrucción en 3D de la imagen trazada. <ol><li> Para realizar las mediciones de volumen mitocondrial, elija objeto en el visor 3D, haga clic en la pestaña &#39;Editar&#39; y seleccione &#39;Propiedades de objeto&#39;. La estimación del volumen mitocondrial aparece junto con varias otras mediciones. </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. Emily K Benson es una empleada remunerada de Renovo Neural Inc., y Grahame J Kidd se desempeña como Director Científico de 3DEM en Renovo Neural Inc., que es un proveedor comercial de servicios y análisis SEM de cara de bloque en serie.

La complejidad del sistema nervioso plantea un reto importante en la reconstrucción de volúmenes de tejido grandes y el análisis de la morfología y distribución de los orgánulos tales como mitocondrias con una resolución adecuada. Varias células, incluyendo neuronas, oligodendrocitos y astrocitos con numerosos procesos extendidos en tres dimensiones interactúan dentro del tejido cerebral 43. Dado que las mitocondrias reside tanto en el soma de las células y los procesos distantes, la morfología mitocondrial e...

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos que cambian su forma y ubicación en función de las señales y las necesidades celulares, en la interacción estrecha con el citoesqueleto celular, y en respuesta a eventos celulares tales como las corrientes de calcio en las neuronas 1. Las mitocondrias también interactúan con otros orgánulos celulares, por ejemplo, retículo endoplásmico, que a su vez regula el metabolismo de su dinámica y 2. Morfología mitocondrial muestra heterogeneidad en diferentes tipos de células, es decir. la forma de la orgánulo varía de tubular a la que consiste en hojas, sacos y óvalos 3. Se ha demostrado que la fusión y de fisión proteínas del ciclo mitocondriales pueden regular la ubicación, tamaño, forma y distribución de las mitocondrias 4. Además, cambios en la forma mitocondrial se asocian con la neurodegeneración, la plasticidad neuronal, la atrofia muscular, la señalización de calcio, la generación de especies reactivas del oxígeno, así como la vida útil y la muerte celular que implican a thala morfología mitocondrial de células T específica es crítico para el mantenimiento de la función celular normal 5-11. Una importante función bioenergética de la mitocondria es la generación de trifosfato de adenosina (ATP) mediante la ejecución de una serie de reacciones metabólicas que implican ruptura completa de nutrientes (es decir, glucosa, grasos de ácidos o aminoácidos) a través del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa vías 12. El cerebro humano constituye sólo el 2% del peso corporal sin embargo, consume ~ 20% de la energía total producida por lo que es extremadamente demandante de energía de órganos 13. Por lo tanto, no es sorprendente que la disfunción mitocondrial en los seres humanos conduce a un gran número de manifestaciones neurológicas 14-17. Las mutaciones genéticas en los componentes de la fosforilación oxidativa que impiden la generación de ATP conduce a trastornos mitocondriales 17,18, que son clínicamente grupo heterogéneo de enfermedades con una prevalencia de 1: ~ 5.000 personas, y una de las causas más comunes de mtrastornos etabolic en niños y adultos. Déficit de ATP mitocondrias derivadas afecta a múltiples sistemas de órganos con órganos que demandan alta energía, como el cerebro, el corazón y los músculos esqueléticos están predominantemente afectados en estos pacientes 14,17,18. En los últimos años, varios estudios han proporcionado evidencia de disfunción mitocondrial en ambos trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos 15-17,19,20. Dado que las mitocondrias son esenciales y fundamentales para el desarrollo y función del cerebro, es imperativo desarrollar protocolos que pueden analizar los cambios en el cerebro mitocondrial morfología, estructura, tamaño, número y distribución previstos en ambos estados sanos y enfermos. Los modelos de ratones con la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente (GFP) se han producido para visualizar los movimientos mitocondriales y localización en el cerebro 21,22. Si bien esta es una herramienta extremadamente útil para examinar la motilidad mitocondrial y la distribución general, hay algunos inconvenientes que Includresolución limitada e y la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia. Estos atributos hacen que sea difícil realizar un seguimiento de las mitocondrias relativamente pequeñas de tamaño. Del mismo modo, la microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para ver mitocondrias sináptica 23, pero este método es mucho tiempo. Morfología mitocondrial es conocido por ser altamente dinámico ya que se someten a ciclos continuos de fusión y de fisión, y en la mayoría de las células de la mitocondria mantener una red altamente conectado 24-26. Las neuronas son células con múltiples dendritas y axones extendidas, y las mitocondrias que forman una red reticular conectado en el cuerpo de la célula altamente polarizada puede tener que separar ya que hacen su camino a través de estos axones (Figura 1). Esto hace que las mitocondrias cerebrales extremadamente variadas en tamaño y forma. Por ejemplo, utilizando el bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie técnica (SBFSEM), se observó previamente que la diferencia en el volumen o tamaño de mitochondr extrasynapticia a las mitocondrias presentes en los terminales de los nervios puede ser tanto como dieciséis pliegan 27. Existen varios enfoques para la realización de los análisis del volumen 28, que incluye la sección de serie TEM 29, la cinta automatizadas para la recolección ultramicrotomo SEM 30, se centró haz de iones SEM 31 y 32 SBFSEM. El análisis SBFSEM tiene ventajas en que tiene la resolución para proporcionar datos cuantitativos sobre la forma morfológica, el tamaño, la distribución y el número de orgánulos tales como mitocondrias en áreas de hasta 1 mm del cerebro. La operación técnica es también la menos exigente, con la adquisición de datos y análisis dentro de las capacidades de muchos laboratorios biológicos que carecen de experiencia previa EM. El advenimiento de los instrumentos comerciales para la generación de la sección similar a imágenes en serie ha hecho 3D análisis ultraestructural de los tejidos de una técnica de rutina, que permite, además, un análisis volumétrico imparcial de una manera rápida y repetible 28 </sup&gt;. El SBFSEM fue descrita por primera vez y se utiliza en el campo de la neurobiología en 2004 32, basado en una idea introducida por Leighton en 1981 33. Múltiples estudios han establecido desde entonces esta técnica como una herramienta importante en el análisis de la reconstrucción de los circuitos neuronales 34. Además, para muchos proyectos de menor escala, se proporciona un análisis para identificar la reconstrucción orgánulos celulares 27,35-39. Puesto que, las imágenes adquiridas se derivan de baja tensión electrones retrodispersión, nuevos protocolos de tinción que se combinan diferentes técnicas conocidas de tinción de metales pesados ​​fueron desarrollados para aumentar la resolución 40. En este trabajo, ofrecemos un protocolo para la utilización de imágenes de microscopía electrónica 3D y el análisis volumétrico de las mitocondrias del cerebro sobre la base de métodos que han sido previamente utilizados por nosotros y otros 38,39,41. Los métodos de post-procesamiento de los tejidos utilizados fueron como se ha descrito anteriormente por Deerinck y col40.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57BL/6J laboratorio de</td><td>Jackson&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VETone, nombre comercial Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de disección</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de disección</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Cánula de mariposa</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filtro (0,45 micras)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de seccionamiento Vibratome</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tánico</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro de potasio</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio al 4% Solución EMS</td><td></td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato</td><td>de plomo EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 KIT DE INCRUSTACIÓN</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Contiene resina Embed 812&nbsp;, DDSA, NMA y DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldehído 25% EM Grado</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Molde de incrustación</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Espécimen de aluminio</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Plata coloidal Liquid</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Maquinilla de afeitar</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Las ferreterías/tiendas de manualidades venden este artículo</td></tr><tr><td>: Epoxi conductor</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo en cámara para SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Se puede diseñar para otros SEMs</td></tr><tr><td>Microscopio de recorte para la preparación de pines</td><td>Gatan Inc.</td><td>suministrado como parte del sistema</td><td></td>3View</tr><tr><td>Detector de electrones retrodispersados de bajo kV</td><td>Gatan Inc.</td><td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ / Paquete de procesamiento de Fiji&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, descarga FIJI Oct 1, 2015</td><td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

análisis del cerebro las mitocondrias usando serie bloque-cara microscopía electrónica de barrido



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

El cerebro humano es un órgano de alto consumo de energía que se basa principalmente en la glucosa como fuente de combustible. La glucosa se ​​cataboliza por las mitocondrias cerebrales a través de la glucólisis, las vías de ciclo y la fosforilación oxidativa de ácido tri-carboxílico (TCA) (fosforilación oxidativa) para producir la energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP). Deterioro del valor de la producción de ATP mitocondrial causa los trastornos mitocondriales, que presentan clínicamente con síntomas neurológicos y myopathic prominentes. Defectos mitocondriales también están presentes en los trastornos del neurodesarrollo (por ejemplo, trastorno del espectro autista) y trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson). Por lo tanto, hay un aumento de interés en el campo para la realización de análisis en 3D de mitocondrial morfología, estructura y distribución bajo ambos estados sanos y enfermedades. La morfología mitocondrial cerebro es extremadamente diverso, con algunas mitocondrias especialmente los dela región sináptica en el intervalo de &lt;200 nm de diámetro, que está por debajo del límite de resolución de la microscopía de luz tradicional. Expresar una proteína orientado mitocondrialmente-verde fluorescente (GFP) en el cerebro mejora significativamente la detección organellar por microscopía confocal. Sin embargo, no supera las limitaciones de la sensibilidad de detección de relativamente pequeñas mitocondrias de tamaño sin oversaturating las imágenes de gran tamaño mitocondrias. Mientras microscopía electrónica de transmisión de serie ha sido utilizado con éxito para caracterizar las mitocondrias en la sinapsis neuronal, esta técnica es extremadamente lento especialmente cuando se comparan múltiples muestras. La técnica de bloqueo cara microscopía electrónica de barrido de serie (SBFSEM) implica un proceso automatizado de seccionamiento, bloques de imagen de adquisición de datos y el tejido. A continuación, ofrecemos un protocolo para realizar SBFSEM de una región definida del cerebro de roedores para reconstruir y visualizar la morfología mitocondrial rápidamente. esta tecnologíanique también podría ser utilizado para proporcionar información precisa sobre el número mitocondrial, volumen, tamaño y distribución en una región del cerebro definido. Dado que la resolución de la imagen obtenida es alta (típicamente bajo 10 nm) también se pueden detectar los defectos morfológicos mitocondriales brutos.

Se demuestra que la morfología mitocondrial del cerebro y el tamaño es heterogénea en las diferentes sub-compartimentos neuronales. La microscopía confocal en cultivos neuronales de baja densidad transducidas con lentivirus que expresan la proteína verde fluorescente dirigido mitocondrialmente mostró que las mitocondrias que residen en el soma neuronal forman una red reticular, mientras que los que residen en las neuritas distales exhiben una morfología alargada discreta (Figura ...

La visualización y el análisis mitocondrial del tejido cerebral de mamíferos es una tarea desafiante. Aquí, describimos cómo el análisis de reconstrucción tridimensional (3D) de la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM) se puede utilizar para obtener información sobre el análisis morfológico y volumétrico de este orgánulo generador de energía crítico.

Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

El objetivo general de la técnica de microscopía electrónica de barrido de corte en bloque en serie es analizar la morfología, estructura, distribución, volumen y número de mitocondrias en una región definida del cerebro de ratón. Este método puede ayudar a responder muchas preguntas clave en neurobiología, como si los cambios en la estructura, el número y la distribución de las mitocondrias cerebrales contribuyen significativamente a los trastornos neurodegenerativos y neurodesarrolladores. La principal ventaja de esta técnica es que automatiza el proceso de obtención de imágenes de cortes en serie mediante la incorporación de un ultramicrótomo personalizado integrado en la cámara del microscopio electrónico de barrido de bajo vacío.Para comenzar el experimento, lave los tejidos previamente preparados y fijados con glutaraldehído tres veces durante cinco minutos cada uno en tampón cacodilato 0,1 molar. Postfije los tejidos con 1 mililitro de ácido tánico al 0,1 % en tampón cacodilato durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la postfijación, lave los tejidos en tampón cacodilato.Disuelva 0.3 gramos de ferrocianuro de potasio y 0.86 gramos de cacodilato de sodio en 10 mililitros de agua destilada. Justo antes de usar, agregue 10 mililitros de tetraóxido de osmio al 4 % y tiña los tejidos con la solución de ferrocianuro de osmio al 2 % durante 90 minutos sobre hielo. Después de la tinción, lave el tejido con agua destilada.Trate las muestras con una solución fresca de tiocarboidrazida (TCH) al 1% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego lave las muestras. A continuación, tiña los tejidos con ósmio tetróxido acuoso al 2% durante una hora.Después de la tinción, lave los tejidos con agua destilada. Incube las muestras durante la noche en 1% de acetato de uranilo en agua destilada a 4 grados Celsius. Al día siguiente, enjuague los tejidos con agua destilada e incúbelos con la tinción de aspartato de plomo de Welton en una estufa.Obtener tinciones de tejidos lo más óptimas posible es fundamental para la obtención de imágenes, ya que una mala tinción provoca un fenómeno de carga en la muestra que dificulta o impide la observación. Lave el tejido con agua destilada. Deshidrate las muestras mediante una serie graduada de alcohol utilizando soluciones frías de etanol durante cinco minutos cada una, seguido de una deshidratación con etanol al 100 % realizada tres veces durante 10 minutos cada una.Lave las muestras dos veces durante 15 minutos cada vez en óxido de propileno. Coloque los tejidos en una mezcla 1:1 de resina de inclusión y óxido de propileno, tape el vial e incube los tejidos durante la noche. Destape el vial después de dos horas para que el óxido de propileno se evapore durante un período de nueve horas.Transfiera los tejidos a resina de inclusión fresca al 100 % en viales limpios durante dos horas. Incluya las muestras en resina de inclusión fresca en moldes planos que contengan etiquetas impresas en papel y cúzalas en una estufa. Después de una hora, verifique la colocación y alineación del tejido y ajústelas si es necesario.Recorte las muestras hasta la zona de interés y móntelas sobre un pasador de aluminio utilizando pegamento cianoacrilato gelificado. Luego, recubra la muestra con pasta de plata coloidal alrededor de los lados del bloque para proporcionar un camino conductor hacia el pasador de aluminio. Examine los especímenes de tejido mediante un sistema de microscopio electrónico de barrido equipado con una etapa de ultramicrótomo dentro de la cámara y un detector de electrones retrodispersados de bajo kilovoltaje.Imagene las muestras con estas configuraciones. Comience el análisis seleccionando Imagen, Tipo y luego 8 bits para convertir las imágenes al formato TIFF de 8 bits desde el formato propietario original de 16 bits. Si la conversión automática de contraste y/o brillo durante este paso no es ideal para las imágenes, vuelva a abrir las imágenes de 16 bits y presione Imagen, Ajustar, Brillo/Contraste.Seleccione un rango que funcione para todas las imágenes y presione Aplicar. Luego, realice la conversión. Si hubo un movimiento inaceptable de la imagen entre cortes, alinee las pilas de imágenes seleccionando Complementos, Registro y Alineación lineal de pilas con SIFT, y configure el alineamiento en modo de traslación únicamente, en lugar de cuerpo rígido.Aumente el tamaño del lienzo antes del registro seleccionando Imagen, Ajustar, Tamaño del lienzo. Alternativamente, reduzca la imagen a un área de interés seleccionando la región deseada y luego recortándola. Si es necesario, escale las imágenes a un tamaño más pequeño y manejable utilizando ImageJ, luego seleccione Imagen y Escala.La microscopía confocal en cultivos neuronales de baja densidad mostró que las mitocondrias ubicadas en el soma neuronal forman una red reticular, mientras que las ubicadas en los neuritos distales presentan una morfología alargada y discreta. Mediante la técnica de microscopía electrónica de barrido de sección en bloque seriada, o SBFSEM, se observaron claramente las mitocondrias, las dendritas y las varicosidades axonales en el cerebro de ratón. Las reconstrucciones tridimensionales de mitocondrias en los neuritos del tejido cerebral de ratón mostraron una diferencia de tamaño entre las mitocondrias dendríticas y axonales.Los datos extraídos de una imagen representativa de SBFSEM en 2-D revelaron que el volumen o tamaño de las mitocondrias ubicadas dentro de las presinapsis neuronales era significativamente menor que el de aquellas localizadas en la región extrasináptica. Las imágenes obtenidas mediante análisis de SBFSEM ofrecen una resolución aumentada para visualizar las características ultraestructurales de mitocondrias individuales. Es posible clasificar el compartimento celular de las mitocondrias determinando su proximidad a estructuras fácilmente identificables, como las mitocondrias somáticas no sinápticas y las mitocondrias presinápticas.Esta técnica puede realizarse en aproximadamente siete días, lo que incluye tres días de tinción, dos días para la curación de la resina, un día de adquisición de imágenes para producir un conjunto adecuado para este análisis, y de dos a cuatro horas para el posprocesamiento de imágenes en preparación para el análisis. Este procedimiento también puede utilizarse en conjunto con otros métodos de imagen mitocondrial, como la imagenología en vivo con mitocondrias etiquetadas genéticamente, para responder preguntas sobre el tráfico mitocondrial y la dinámica de su fisión y fusión.

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Fuente: Mukherjee, K., et. al. Análisis de mitocondrias cerebrales mediante microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie. J. Vis. Exp. (2016)Este video muestra la preparación,  imágenes y análisis del tejido cerebral de ratón utilizando un microscopio electrónico de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM) para visualizar la ultraestructura mitocondrial, lo que permite un mapeo preciso de su morfología y distribución espacial en compartimentos neuronales axonales y...

 Obtención de imágenes de mitocondrias neuronales mediante un microscopio electrónico de barrido de cara de bloque en serie

La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas.

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o En Vivo

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

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El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad...

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

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Examen histológico de la morfología mitocondrial en un modelo de enfermedad de Parkinson

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Aprende a analizar la morfología mitocondrial en cerebro de ratón mediante microscopía electrónica de barrido de bloque-seriado. Esta técnica automatizada permite reconstrucciones 3D detalladas para investigar trastornos neurodegenerativos.

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