Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido

El objetivo general de la técnica de microscopía electrónica de barrido en cara de bloque en serie es analizar la morfología, la estructura, la distribución, el volumen y el número mitocondrial en una región definida del cerebro del ratón. Este método puede ayudar a responder muchas preguntas clave en neurobiología, como si los cambios en la estructura, el número y la distribución de las mitocondrias cerebrales contribuyen sustancialmente a los trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que automatiza el proceso de obtención de imágenes de secciones en serie mediante la incorporación de un ultramicrótomo personalizado integrado en la cámara del microscopio electrónico de barrido de bajo vacío.

Para comenzar el experimento, lavar los tejidos fijados con glutaraldehído previamente preparados tres veces durante cinco minutos cada una en tampón de cacodilato 0,1 molar. Fije posteriormente los tejidos con 1 mililitro de ácido tánico tamponado al 0,1% de cacodilato durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la posfijación, lave los tejidos con tampón de cacodilato.

Disuelve 0,3 gramos de ferrocianuro de potasio y 0,86 gramos de cacodilato de sodio en 10 mililitros de agua destilada. Justo antes de usar, agregue 10 mililitros de tetróxido de osmio al 4% y tiña los tejidos con una solución de ferrocianuro de osmio al 2% durante 90 minutos en hielo. Después de teñir, lavar el pañuelo con agua destilada.

Trate las muestras con una solución de tiocarbohidrazida al 1% o TCH recién preparada durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las muestras. A continuación, tiñe los tejidos con tetróxido de osmio acuoso al 2% durante una hora.

Después de teñir, lavar los pañuelos con agua destilada. Incubar las muestras durante la noche en acetato de uranilo al 1% en agua destilada a 4 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague los pañuelos en agua destilada e incube con la mancha de aspartato de plomo de Welton en un horno.

Obtener las mejores tinciones posibles de los tejidos es fundamental para la obtención de imágenes, ya que una tinción deficiente da como resultado un fenómeno de carga en la muestra que dificulta o imposibilita la obtención de imágenes. Lave el pañuelo en agua destilada. Deshidratar las muestras a través de una serie graduada de alcohol utilizando soluciones frías de etanol durante cinco minutos cada una, seguidas de una deshidratación al 100% de etanol tres veces durante 10 minutos cada una.

Lave las muestras dos veces durante 15 minutos cada una en óxido de propileno. Coloque los tejidos en una mezcla 1:1 de resina de incrustación y óxido de propileno, tape el vial e incube los tejidos durante la noche. Destape el vial después de dos horas para que el óxido de propileno se evapore durante el período de nueve horas.

Transfiera los pañuelos a resina de inclusión 100% fresca en viales limpios durante dos horas. Incruste las muestras en resina de incrustación fresca en moldes planos que contengan etiquetas de papel impresas y cúrelas en un horno. Después de una hora, verifique la colocación y alineación del tejido y ajústelo si es necesario.

Recorta las muestras en el área de interés y móntalas en un pin de aluminio con superpegamento gelificante de cianoacrilato. A continuación, cubra la muestra con pasta de plata coloidal alrededor de los lados del bloque para proporcionar una ruta conductora al pin de aluminio. Examine las muestras de tejido utilizando un sistema de microscopio electrónico de barrido equipado con una etapa de ultramicrótomo en la cámara y un detector de electrones retrodispersados de bajo kilovoltio.

Genere una imagen de las muestras con estos ajustes. Comience el análisis seleccionando Imagen, Tipo y, a continuación, 8 bits para convertir las imágenes al formato TIFF de 8 bits desde el original propietario de 16 bits. Si la conversión automática de contraste y/o brillo durante este paso no es ideal para las imágenes, vuelva a abrir las imágenes de 16 bits y pulse Imagen, Ajustar, Brillo/Contraste.

Seleccione un rango que funcione para todas las imágenes y presione Aplicar. A continuación, realice la conversión. Si hubo un movimiento inaceptable de la imagen entre sectores, alinee las pilas de imágenes seleccionando Complementos, Registro y Alineación de pila lineal con SIFT y establezca la alineación para el modo de solo traducción en lugar de cuerpo rígido.

Amplíe el tamaño del lienzo antes del registro seleccionando Imagen, Ajustar, Tamaño del lienzo. Alternativamente, reduzca la imagen a un área de interés seleccionando la región deseada y luego recortándola. Si es necesario, escale las imágenes a un tamaño más pequeño y manejable con ImageJ y, a continuación, seleccione Imagen y escala.

La microscopía confocal en cultivos neuronales de baja densidad mostró que las mitocondrias que residen en los somas neuronales forman una red reticular, mientras que las que residen en neuritas distales exhiben una morfología alargada discreta. Utilizando la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie, o técnica SBFSEM, se observaron claramente las mitocondrias, las dendritas y las varices axonales en el cerebro del ratón. Las reconstrucciones de tres días de las mitocondrias en las neuritas del tejido cerebral de ratón mostraron una diferencia de tamaño entre las mitocondrias dendríticas y axonales.

Los datos extraídos de una imagen representativa de SBFSEM en 2D revelaron que el volumen o tamaño de las mitocondrias que residían dentro de las presinapsis neuronales era significativamente menor que las que residían en la región extrasináptica. Las imágenes adquiridas por el análisis SBFSEM proporcionan una mayor resolución para visualizar las características ultraestructurales de las mitocondrias individuales. Es posible clasificar el compartimento celular de las mitocondrias determinando su proximidad a estructuras fácilmente identificables como las mitocondrias somáticas no sinápticas y las mitocondrias presinápticas.

Esta técnica se puede realizar en unos siete días, lo que incluye tres días de tinción, dos días para el curado de la resina, un día de obtención de imágenes para producir una pila adecuada para este análisis y de dos a cuatro horas para el posprocesamiento de imágenes en preparación para el análisis. Este procedimiento también se puede utilizar junto con otros métodos para obtener imágenes de las mitocondrias, como las imágenes en vivo con mitocondrias marcadas genéticamente, para responder preguntas sobre el tráfico mitocondrial y la dinámica de su fisión y fusión.