La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

El objetivo general de este procedimiento es monitorear la fidelidad de la segregación cromosómica durante la mitosis en un embrión de pez cebra vivo mediante el uso de cromatina marcada con fluorescencia y proteínas de la membrana celular que se capturarán utilizando microscopía confocal de alta resolución. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mitosis, como ¿cómo los defectos mitóticos resultan en un defecto del desarrollo o en la formación de tumores en un organismo vertebrado vivo? La principal ventaja de esta técnica es que estamos observando la mitosis en un organismo vertebrado vivo, lo que permite recopilar datos fisiológicamente relevantes.

Después de reproducir peces cebra adultos e inyectar los huevos con ARN de H2A.F/Z-EGFP y/o pCS2 mCherry-CAAX, aproximadamente dos horas antes de la adquisición de imágenes, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para identificar embriones positivos para GFP. Transfiera los embriones brillantes y verdes que expresan GFP a una nueva placa de Petri de 100 por 15 milímetros con medio E3 azul.

Hervir una solución stock de agarosa al 1 % de fusión baja en E3 azul. Aliquotar tres mililitros de la agarosa fundida en un tubo de cultivo de 17 por 100 milímetros. Mantener la agarosa tibia colocando el tubo de cultivo en un baño de agua a 42 grados Celsius hasta que esté listo para su uso.

Reúna tricaina 15 milimolar, embriones seleccionados, agarosa de baja fusión, E3 azul y un plato de cultivo con fondo de cubreobjetos de vidrio de 35 milímetros, así como un microscopio estereoscópico. A continuación, con pinzas número cinco, retire cuidadosamente las corionas de tres embriones y coloque los embriones en un recipiente aparte para anestesiarlos. Luego, utilizando una pipeta de transferencia, agregue tres gotas de tricaina 15 milimolar al plato que contiene los embriones y cinco mililitros de medio.

Agregue tres o cuatro gotas de solución de tricaina 15 milimolar al tubo con agarosa al 1% fundida. Cuando los embriones estén suficientemente anestesiados, utilice un Pipetman P200, con un centímetro del extremo de la punta cortado, para transferir los embriones anestesiados al recipiente con fondo de cubreobjetos. Retire cualquier exceso de solución azul de tricaina E3.

Añada lentamente de cinco a 10 microlitros de solución de tricaina con agarosa de baja fusión sobre los embriones, manteniendo cada gota separada, para asegurar que los embriones no se desplacen cerca uno del otro. Luego, utilizando una aguja de calibre 21 y una longitud y media, oriente suavemente los embriones en la agarosa hacia la posición deseada, colocando la región de interés lo más cerca posible del cubreobjetos si se utiliza un microscopio invertido. Debido a los desplazamientos que puedan ocurrir, puede ser necesario regresar a cada embrión para asegurarse de que permanezcan en la posición requerida.

Es posible que esto tenga que hacerse varias veces hasta lograr la posición ideal mientras el agar se solidifica. Después de unos minutos, para comprobar si ya está firme, use una aguja para separar un pequeño trozo de agarosa. Cuando se pueda separar de la gota, use agarosa de bajo punto de fusión adicional para formar una cúpula sobre los embriones incluidos, cubriendo completamente la laminilla.

Mientras el agarosa solidifica, prepare tres mililitros de medio E3 azul con cinco gotas de tricaina 15 milimolar, que se colocarán sobre los embriones embebidos durante la adquisición de imágenes. Para realizar la adquisición de imágenes confocal 5D de embriones de pez cebra vivos, abra el software de adquisición y configure el microscopio con un objetivo de 60X y apertura numérica 1,4. Aplique aceite de inmersión al objetivo y coloque la placa de cultivo en el portaobjetos del escenario del microscopio.

Utilizando el controlador de ejes, centre el embrión de interés sobre el objetivo de la lente y eleve la lente para que haga contacto con la placa de cultivo. Vierta la solución azul E3 y tricaina sobre los embriones embebidos en agar. A continuación, haga clic en el icono del puerto ocular para observar los embriones a través del ocular.

Desactive la selección del puerto ocular y elija Ver, Controles de adquisición, Área de escaneo A1, para abrir la herramienta Área de escaneo A1. Seleccione el canal GFP, reinicie el escaneo y enfoque una región de interés cercana al cubreobjetos. Detenga el escaneo, seleccione los canales GFP y mCherry, y configure la opción de promedio de líneas en normal.

Ahora, seleccione Ver, Controles de Adquisición, Adquisición ND, para abrir la herramienta de Adquisición ND A1. Comience la exploración. Luego, utilizando el control de ejes, posicione los embriones de manera que el área de escaneo se llene lo más posible con el pez cebra.

Establezca el límite superior del Z-stack en el punto en que las células pierden el enfoque, dejando un espacio adicional de tres micrómetros por encima de la muestra, para permitir el crecimiento y el movimiento celular. Luego, establezca el límite inferior en el punto en que las células ya no son visibles, y fije el tamaño del paso del intervalo Z en dos micrómetros. Para los experimentos mostrados aquí, ajuste respectivamente la potencia del láser de imagen, el voltaje alto (HV) o la ganancia, y los niveles de compensación, según se indica a continuación.

Una vez establecidos los parámetros, apague el escaneo para evitar la exposición innecesaria al láser, que podría causar fototoxicidad y fotoblanqueo de la muestra. Ahora, seleccione el icono de promediado de línea 2X, que proporciona la mejor calidad de imagen y el tiempo de escaneo más rápido. Seleccione el intervalo de tiempo y la duración necesarios para el experimento.

Para divisiones celulares de tipo salvaje, intervalos de dos minutos durante un período de dos horas son adecuados para determinar la duración de la mitosis. Las divisiones que activan el punto de control de ensamblaje del huso por más de treinta minutos son más adecuadas para intervalos de cuatro a cinco minutos durante cuatro horas, con el fin de preservar la fluorescencia, como se demuestra aquí. Para guardar automáticamente el archivo mientras se adquiere, marque la casilla Guardar en archivo y asigne un nombre al archivo.

Finalmente, verifique que todos los parámetros estén configurados correctamente y haga clic en Ejecutar ahora. Una vez finalizada la adquisición, para ver el archivo en un formato tridimensional, haga clic en el icono Umbral de volumen. Esta figura demuestra la capacidad de observar muchas divisiones celulares utilizando un campo de visión amplio de la cola de un pez cebra de tipo salvaje AB.

Las divisiones celulares se indican con asteriscos. Se muestra aquí la película correspondiente. En promedio, se observaron 50 células en división en AB y 30 células en división en el mutante aurora B.

Para tener en cuenta el número reducido de células mitóticas capturadas en el embrión mutante de aurora B, se calculó la proporción de células mitóticas respecto al número de células capturadas, lo que sugiere que no hay un número menor de células que atraviesan la mitosis en los embriones mutantes de aurora B, sino, más bien, un número menor de células totales capturadas. Para cuantificar la duración mitótica, se multiplica el número de intervalos de tiempo que abarca una división celular por el intervalo de tiempo entre cada serie de cortes Z. Como se muestra en este gráfico, el tiempo promedio de división del tipo salvaje AB es de 25 minutos, y de 58 minutos para el mutante aurora B.

Como se observa en embriones de tipo salvaje, se puede distinguir cada fase mitótica. Sin embargo, se observan defectos mitóticos en el embrión mutante de aurora B, que incluyen la detención mitótica y la citocinesis fallida, lo que da lugar a una célula binucleada, y la posterior formación de micronúcleos, lo cual respalda el aumento del tiempo de división medido en este mutante. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora, desde el cribado de embriones hasta el ajuste de los parámetros del microscopio confocal.

Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta el contexto del experimento en cuestión, en lo que respecta a la región de interés, la duración temporal, el intervalo de tiempo y la profundidad en Z. Esto ayudará a maximizar la eficiencia, así como a prevenir el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como extensiones cromosómicas, para responder preguntas adicionales sobre la causa de los defectos mitóticos observados, o utilizar un tratamiento farmacológico para determinar sus efectos sobre la progresión mitótica, la duración o el destino celular.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología exploraran la mitosis en el contexto de la biología del desarrollo y la biología del cáncer utilizando pez cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo incrustar embriones de pez cebra, capturar imágenes en vivo de la mitosis y analizar la frecuencia mitótica, la duración y el destino celular. No olvide que trabajar con láseres de alta potencia y luz fluorescente puede ser perjudicial para los ojos, y siempre se deben tomar precauciones, como evitar el contacto directo de los ojos con los láseres, durante la realización de este procedimiento.