Células Progenitoras de aislamiento Mesangiogenic (PSM) de Humana de Médula Ósea

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células progenitoras mesangiogénicas o MPC de la médula ósea humana mediante condiciones de cultivo selectivas. Estamos probando tanto su potencial mesogénico como su angiogénico. Las células progenitoras mesangiogénicas se están identificando en un porcentaje bajo con un cultivo celular mesen-ki-ma-stro-mo optimizado para aplicación clínica.

Cuando el FBS sea reemplazado por suero humano. Esta técnica es única, de hecho, permite un aislamiento muy consistente de un gran número de NPCs ali-polificadas adecuadas para la angiogénesis germinante y una generación de cultivos MSC sincronizados. Descubrimos esto cuando, después de los viajes en la digestión de cultivos de SQM en un suero de talgrum, pocas células en forma de huevo frito permanecen unidas pero diferenciadas en MC después del tratamiento con FPS.

Para aislar células mononucleares de médula ósea humana, o MNC, comience diluyendo de cinco a 10 mililitros de médula ósea fresca hasta un volumen total de 50 mililitros con DPBS y mezcle la solución celular por inversión. A continuación, distribuya equitativamente 25 mililitros de pilas en dos nuevos tubos cónicos de 50 mililitros y añada 25 mililitros de DPBS fresco a cada tubo para una segunda mezcla por inversión. A continuación, deje reposar las células a temperatura ambiente para permitir que los fragmentos minerales de hueso y la grasa se separen de la solución.

Después de 10 minutos, use una pipeta de pastuer para eliminar cuidadosamente la grasa flotante y filtre las suspensiones celulares a través de filtros individuales de 70 micras sin alterar los gránulos de fragmentos de hueso mineral. Para aislar la MNC, se colocan 20-25 mililitros de médula ósea diluida sobre un medio de gradiente de densidad de 1,007 gramos por mililitro a temperatura ambiente en cada uno de los dos tubos de 50 mililitros y se separan las células por centrifugación. A continuación, utilice una pipeta de pastuer estéril para agrupar los anillos blanquecinos de las células en las caras de entrada en un nuevo tubo de 50 mililitros.

Lave las células mononucleares aisladas con medio de cultivo fresco durante cinco minutos a 400 veces G y temperatura ambiente. Luego vuelva a suspender el pellet en cinco a 10 mililitros de medio de cultivo fresco. Para aislar el MPC, equilibre los matraces hidrófobos T75 con 15 mililitros de medio de cultivo fresco a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono.

Después de 30 minutos, siembre de cuatro a seis veces, de 10 a siete, de las células mononucleares de la médula ósea humana por matraz para una incubación de 48 horas. El segundo día desechar el medio y las células no adherentes de los matraces y alimentar las células con 15 mililitros de medio de cultivo fresco. Regrese los cultivos a la incubadora durante seis a ocho días.

Al final de la incubación, lavar las células adherentes con DMEM fresco. A continuación, incubar las células con dos mililitros de solución desprendente de proteas libres de animales durante cinco a 15 minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan levantado del fondo del matraz, agregue 10 mililitros de medio de cultivo fresco para detener la reacción y recoja las células por centrifugación, volviendo a suspender el pellet en uno o dos mililitros de medio de cultivo fresco.

Después de contar la placa MPC dos veces 10 por el cuatro por centímetro cuadrado de las células en el cultivo de tejidos, los matraces de cultivo T75 tratados y adherir las células durante la noche en 15 mililitros de medio de cultivo fresco en la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, reemplace el medio cultivado con 200 microlitros por centímetro cuadrado de célula de misancolmulstromul o medio de expansión MSC y cultive las células durante otros siete a 10 días. Cuando los cultivos han alcanzado la confluencia del subcultivo a tres o cinco veces diez a las tres células por centímetro cuadrado hasta llegar a una nueva confluencia del pasaje dos en MSC se procede a realizar la digestión de las proteínas para recoger las células como se ha demostrado anteriormente.

Placa dos veces diez a la cuarta células por centímetro cuadrado en cultivo de tejidos tratados seis placas de pocillos y medio de expansión fresco. Después de hacer crecer los cultivos hasta la confluencia nuevamente, marque dos pozos como no diferenciados y refresque el medio de expansión. Marque dos pocillos como blastos osteogénicos y reemplace el medio con 200 microlitros por centímetro cuadrado de medio osteogénico estándar diseñado específicamente para la diferenciación de MSC.

A continuación, marque dos pocillos como sitios adipo y sustituya el medio por 200 microlitros por centímetro cuadrado de medio adipogénico estándar diseñado específicamente para la diferenciación de MSC. Regrese las células a la incubadora de cultivos celulares durante dos o tres semanas hasta que las células se hayan diferenciado. A continuación, se procede a la detección fluorescente de depósitos de calcio extracelular y a la introducción de la acumulación de gotas de lípidos celulares.

Para producir esferoides 3D, siembre una gran cantidad de gotas de 20 microlitros de suspensión de MPC recién aislada en la superficie interna de la tapa de una placa de Petri. Cuando se hayan colocado todas las gotas, coloque con cuidado la tapa sobre una base de placa de Petri que contenga DPBS para evitar la evaporación de las gotas colgantes y coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante la noche. A la mañana siguiente, agregue 300 microlitros de proteínas de matriz extracelular estándar a cada pocillo de una placa de cultivo de cuatro grados Celsius y 24 pocillos, y gelifique las proteínas de la matriz a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Agregue 700 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales rico en factor de crecimiento endotelial vascular estándar sobre las proteínas ECM gelificadas. Cuando el MPC se haya agregado en esferoides 3D, invierta con cuidado la tapa de la placa de Petri y use una pipeta pasteur estéril para recolectar suavemente los esferoides. Finalmente, siembre los esferoides en los pocillos de cultivo y devuelva la placa a la incubadora.

Morfilógicamente, las MPC se caracterizan por su distintiva forma de huevo frito con una región central gruesa rodeada por una periferia plana y delgada que exhibe muchas filipodios. También se observa a menudo la elongación polar del límite exterior de la célula. El cultivo de MPC en medio de expansión de MSC da como resultado la diferenciación rápida pero parcial en células planas y multiramificadas proliferantes con MPC indiferenciadas residuales aún detectables.

Después de un paso adicional, los cultivos dan como resultado una monocapa de células similares a MSC que crecen exponencialmente. En el proceso, las MPC reorganizan su F-actina en fibras de estrés, mientras que la expresión de nestina se limita a unas pocas células raras. La itom-etría de las MPC recién aisladas muestra que más del 95% de las células expresan CD31 y CD45 pero carecen de antígenos asociados a mis-en-com-al CD90 y CD 73.

Estos últimos antígenos se expresan altamente solo después de una diferenciación completa en MSC. Confirmando su naturaleza mal en-com-al, cuando se alimentan con un medio diferenciador durante al menos dos semanas, estas células pueden ser fácilmente inducidas en osteoblastos, como lo indican sus depósitos de calcio, o adipositos, como se aprecia por la acumulación de gotas de lípidos. Confirmando la naturaleza MSC de los cultivos celulares prediferenciados.

La tipificación de MPC se confirma aún más en un ensayo de angiogénesis de brotes con las células que exhiben la capacidad de invadir un gel de proteínas de matriz extracelular mirión de esferoides 3D después de 24 horas de estímulo del factor de crecimiento endotelial vascular. Después de una semana, las células invasoras migran a una distancia aún mayor, una capacidad de invasión que se pierde en las MSC de segundo paso después de la diferenciación mesangénica. Una vez dominados, los cultivos MSC se pueden establecer en una hora si se aborda adecuadamente, proporcionando entre uno o dos millones de MPC en menos de una semana.

Al intentar este procedimiento, es importante evaluar el rendimiento de los lotes de RC humana antes de que los utilicen en cultivo. Por el momento, nuestro protocolo de aislamiento MPC es el único para obtener un cultivo de MC casi puro de alta reproducibilidad para su posterior aplicación. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que las investigaciones en el campo de las terapias basadas en células exploraran la posibilidad de aplicar MPC en la regeneración del tejido esquelético.