Las técnicas para la Evolución de la robusta levaduras que fermentan la pentosa para la bioconversión de lignocelulosa en etanol

El objetivo general de este procedimiento de evolución adaptativa es derivar cepas robustas de la levadura fermentadora de xilosa nativa scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que puedan fermentar más rápidamente los azúcares hexosa y pentosa en hidrolizados no desintoxicados a etanol económicamente recuperable. Este método hace avanzar la industria de la lignocelulosa al etanol al proporcionar una hoja de ruta para cepas con modificaciones complejas, permitiendo la fermentación de azúcares en hidrolizados que contienen inhibidores microbianos. En este caso, la principal ventaja de la evolución dirigida es que las cepas robustas se moldean a partir de una levadura nativa capaz de fermentar xilosa, lo que elimina la necesidad de diseñar cepas industriales de Saccharomyces.

Nos dimos cuenta de que era poco probable que una sola cepa de levadura fuera robusta en diferentes tipos de hidrolizados, como el rastrojo de maíz pretratado con AFEX o el pasto varilla pretratado con ácido diluido. La capacidad de Scheffersomyces stipitis para someterse a un ciclo de reproducción sexual es beneficiosa para una mayor explotación en el presente trabajo, ya que las diversas cepas desarrolladas pueden combinarse en una sola cepa más robusta mediante el apareamiento de cepas que tienen estos diversos rasgos. Las coautoras Stephanie Thomson y Maureen Shea-Andersh, que son técnicas de ciencias biológicas en mi laboratorio, demostrarán el procedimiento.

Antes de comenzar este procedimiento de enriquecimiento, prepare un precultivo de la cepa NRRL Y-7124 en un matraz de 125 mililitros y una serie de diluciones del hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con expansión de fibra de amoníaco sacarificado con enzimas, o AFEX CSH. Utilice una pipeta repetida para llenar una microplaca de 96 pocillos con 15 microlitros por pocillo y ocho pocillos por dilución hidrolizada. Inocular con unos pocos microlitros de precultivo por pocillo para permitir una absorbancia inicial a 620 nanómetros, o A620 mayor o igual a 0.1.

Coloque la microplaca en una caja de plástico con una toalla de papel húmeda para la humedad e incube estáticamente durante 24 a 28 horas a 25 grados centígrados. A continuación, utilice un espectrofotómetro de lectura de microplacas para identificar los cultivos que crecieron físicamente hasta un A620 superior a 1,0 en la dilución de hidrolizado más concentrada. Agrupe los pozos identificados en un tubo de microfuga y distribúyalo a una placa de llenado.

Transfiera de uno a cinco microlitros de la placa de llenado a cada pocillo de una nueva serie de dilución de hidrolizado para lograr un A620 inicial mayor o igual a 0,1 e incube la placa como antes. Monitoree el crecimiento de los cultivos en la microplaca con un espectrofotómetro de lectura de microplacas. Prepare regularmente las reservas de glicerol de los cultivos de adaptación.

Agrupar cuatro pocillos de la mayor concentración de hidrolizado colonizado en un criofile, y mezclar uno a uno con un 20% de glicerol estéril. Congele las células a menos 80 grados centígrados. Repita este procedimiento de enriquecimiento hasta que el crecimiento en 12% de glucano AFEX CSH sea consistentemente visible a las 24 horas.

Para comenzar este procedimiento, se seleccionan las existencias de glicerol de los cultivos de adaptación a la levadura, la malta peptona dextrosa o el agar YM. Luego, después del crecimiento, use rayas para inocular 50 microlitros de 3% o 6% de glucano AFEX CSH en cada uno de los tres pocillos de microplacas. Incubar la microplaca durante 24 horas a 25 grados centígrados.

Piscina replica pozos colonizados con la mayor resistencia hidrolizada con un fuerte crecimiento. Y placa de dilución a YM o agar 6% glucano AFEX CSH. Incube las placas en una incubadora a 25 grados centígrados durante 24 a 48 horas.

Elija cinco colonias individuales de la placa de dilución más alta que muestren crecimiento para congelar como cultivos de stock de glicerol. Coloque cada colonia en una placa YM e incube durante 24 horas. Con un bucle estéril, transfiera una raya desarrollada de células a un pequeño volumen de glicerol al 10% mezclado para suspender las células y distribuirlas a dos o tres crioarchivos para congelar a menos 80 grados Celsius.

Para probar aislados en cultivos simples de lotes de 6% glucano AFEX CSH, transfiera células de placas de 48 horas veteadas a partir de existencias de glicerol a tampón de fosfato de potasio pH 7 para preparar suspensiones celulares. Después de medir la densidad óptica de cada suspensión de celda, ajuste el volumen con tampón adicional para alcanzar un A620 de diez. Utilice un microlitro de cada suspensión para inocular cada uno de los cuatro pocillos de 50 microlitros de hidrolizado de glucano al 3% hasta un A620 inicial de 0,2.

Incubar la microplaca durante 24 horas. A continuación, transfiera dos pocillos de microplacas de 24 horas para inocular precultivos de 25 mililitros de 6% de glucano AFEX CSH a pH 5. Cierre los matraces con cierres de esponja de silicona e incube durante 24 horas a 25 grados centígrados y 150 RPM.

Utilice los precultivos AFEX CSH de 6% de glucano para inocular cultivos de crecimiento similares de 25 mililitros por duplicado a un A620 inicial de 0,1. Incubar los cultivos de crecimiento durante 24 horas a 25 grados centígrados y 150 RPM. Para probar la falta de aislados de dióxico en cultivos discontinuos de medio óptimo definido, o ODM, con azúcares mezclados, inocule precultivos de 75 mililitros de ODM con 150 gramos por litro de xilosa en matraces de 125 mililitros con cierres de esponja de silicona.

Incubar durante 24 horas a 25 grados centígrados y 150 RPM. Utilice los precultivos para inocular a un A620 de 0,1 cultivos de prueba duplicados similares de 75 mililitros con ODM que contengan 75 gramos por litro de glucosa y 75 gramos por litro de xilosa a pH 6,5. Agite los matraces a 25 grados centígrados y 150 RPM.

24 horas antes de inocular un cultivo continuo, prepare un precultivo de una colonia representativa tolerante a AFEX CSH en ODM sin etanol en un matraz de 125 mililitros. Utilice de cinco a 10 mililitros del precultivo de aislado tolerante a AFEX CSH para inocular 100 mililitros de ODM en un matraz giratorio de 100 mililitros encamisado para obtener un A620 inicial de 0,5. Mantenga el volumen de retención del cultivo a 25 grados centígrados.

Revuélvalo a 200 RPM y equípelo con un electrodo de pH esterilizable, un controlador de pH y un baño de agua circulante con temperatura controlada. Inicialmente, dado que el crecimiento celular será lento debido a la exposición al etanol, configure una bomba accionada por pH para que cuando la fermentación del cultivo disminuya el pH a 5.4, la bomba alimente a pH 6.3 ODM con 100 gramos por litro de xilosa y 50 gramos por litro de etanol para detener nuevas disminuciones de pH. Mantenga el volumen en 100 mililitros con una bomba de efluente que roze continuamente la superficie de cultivo.

Mida el volumen de efluente recolectado y extraiga muestras de cultivos continuos cada 48 a 72 horas para analizar la concentración de células viables, productos y sustratos como se describe en el manuscrito. Ahorre reservas de glicerol regularmente aislando las colonias de las placas de viabilidad de diluciones de muestras tamponadas formando de 30 a 100 colonias, lo que representa las colonias robustas más prevalentes en ese momento en enriquecimiento. Inundar las placas con cinco mililitros de glicerol al 10% para permitir la preparación de crioarchivos duplicados.

Si los cultivos pueden crecer de manera constante a tasas específicas de más de 0,01 por hora en xilosa en presencia de más de 25 gramos por litro de etanol, inicie la alimentación continua del cultivo a una tasa de dilución baja de aproximadamente 0,01 por hora hasta el volumen de retención de 100 mililitros. Con el tiempo, eleve el etanol en el alimento hacia 50 gramos por litro. La irradiación ultravioleta de los inóculos para reiniciar los cultivos continuos es una opción para acelerar la tasa de mutación.

Captura poblaciones avanzadas en reservas de glicerol. Antes de aislar las colonias unicelulares, se identifican las poblaciones de glicerol con una fermentación mejorada de xilosa en presencia de etanol, como se describe en el protocolo de texto. Utilice estas poblaciones superiores para rayar las placas.

Las placas rayadas se utilizan para preparar suspensiones de celdas densas y tamponadas de un A620 igual a cinco. A continuación, se utilizan suspensiones celulares para inocular precultivos en 96 placas de pocillos profundos. Incubar durante 48 horas a 25 grados centígrados, 400 RPM y una pulgada de órbita.

A continuación, enriquezca las colonias tolerantes utilizando cada precultivo para inocular 16 cultivos replicados de un mililitro a un A620 inicial de 0.5 en licor de hidrolizado de pasto varilla pretratado con ácido, mezclado uno a uno con ODM más 50 gramos por litro de xilosa, y suficiente etanol para proporcionar un desafío de 20, 30 o 40 gramos por litro de etanol. Incubar durante 48 horas a 25 grados centígrados, 400 RPM y una pulgada de órbita. Para cada stock de glicerol diferente, coseche los pozos de cultivo con la concentración de etanol más alta, lo que permite el crecimiento y el uso de xilosa.

Coloque cada línea celular en agar YM para obtener colonias individuales prevalentes para preservar en glicerol. Elija 10 colonias por línea celular y coloque cada una en una placa de agar YM para la preparación de caldo de glicerol. Después de la adaptación en AFEX CSH, una comparación de los rendimientos de fermentación en ODM entre la cepa parental y las poblaciones adaptadas revela que las poblaciones adaptadas usan la xilosa de manera más eficiente para producir etanol más rápidamente y en mayores cantidades.

Se desarrolló una colonia tolerante al hidrolizado para mejorar la tolerancia al etanol mediante la selección continua de cultivos en ODM que contienen xilosa y altos niveles de etanol. Todas las poblaciones adaptadas superaron al progenitor en la capacidad de inducir el metabolismo de la xilosa en presencia de 40 gramos por litro de etanol. Estos gráficos resumen los rendimientos de los aislados tolerantes superiores evaluados en términos de tasas de absorción de xilosa y rendimientos de etanol en relación con la cepa original para cada formulación de PSGHL.

Las mejores cepas seleccionadas del cribado primario en PSGHL rico en xilosa se cribaron posteriormente en tres hidrolizados completos y se calculó el índice de rendimiento relativo, o RPI, para la fermentación de cada aislado dentro de cada hidrolizado. A continuación, se calcularon los índices de rendimiento general combinados para cada aislado. Cinco aislados, tres, 14, 27, 28 y 33, tenían RPI generales por encima de 60, lo que los clasificó como los más robustos a todas las variaciones de las condiciones de hidrolizado y nutrientes combinadas.

Después de ver este video, debe saber cómo desafiar a una levadura fermentadora de xilosa como scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 en un proceso de evolución específico, enriquecer, aislar y evaluar derivados más robustos que fermentan de manera más efectiva azúcares mezclados en hidrolizados no desintoxicados. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar con una inversión de tiempo diario de una media de una hora al día. Los cambios significativos en el proceso de evolución se pueden documentar en tan solo cuatro meses.

Al intentar este procedimiento, es importante salvar a las poblaciones que avanzan regularmente preparando las reservas de glicerol para que se congelen a menos 80 grados centígrados. Esto permite la recuperación de la población, la evaluación periódica, el aislamiento o el reinicio del proceso de evolución. Para manejar varias mutaciones, recuerde examinar regularmente la levadura en condiciones específicas del proceso para una variedad de fenotipos.

El cálculo de los índices generales de rendimiento relativo adimensional, o RPI, basados en parámetros cinéticos, permite evaluar el rango de la deformación y la robustez a las variaciones en las condiciones de fermentación, como el tipo de hidrolizado y la suplementación de nutrientes. Las levaduras superiores que surgen de cada fase del proceso de evolución son candidatas para la secuenciación del genoma, de modo que se reduce la naturaleza de las mejoras, como la tolerancia a los inhibidores, y el retraso dióxico puede entenderse y utilizarse para el diseño de cepas biocatalíticas de próxima generación.