Name: Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a cultivar trofoblastos villosos humanos primarios bajo hipoxia/reoxigenación para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra el estrés oxidativo placentario.

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Apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (no. 262011-2009) a CV y beca de Investigación en Ciencias Sociales y del Comportamiento de March of Dimes (#12-FY12-179) a CV y JTS; por becas a LSF del Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) y la Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, a HC de la Red Quebequense en Reproducción-NSERC-CREATE, a AAHT de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y FRQ-Santé, y a JBP de NSERC; mediante una beca al EMAS del Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) y el Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Placentas fueron obtenidos inmediatamente después de los partos vaginales espontáneos de embarazos sin complicaciones en el CHUM St-Luc del Hospital, Montreal, QC, Canadá, con el consentimiento del paciente informado y la aprobación de los comités éticos (CHUM-St-Luc hospital y INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Quebec, Canadá). 1. Aislamiento y purificación de células citotrofoblastos velloso <ol><li> Soluciones y medios <ol><li> Preparar los medios de transporte, completándolo Dulbecco modificada de Eagle mediano de alta glucosa (DMEM-HG) con 1% de antibiótico vol / vol (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) y se almacena a 4 ° C. </li><li> Preparar medios de cultivo primario, completándolo DMEM-HG con 10% vol / vol de suero bovino fetal (FBS), 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES), 1% de antibiótico vol / vol (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) y se almacena a 4 ° C. medios calientes a 37 ° C antesutilizar. </li><li> Preparar 4 l de solución salina (cloruro de sodio en peso / vol 0,9%). </li><li> Prepárese modificado solución salina equilibrada de Hank (HBSS) mediante la adición de HEPES 25 mM a 1x HBSS (pH 7,4). </li><li> Preparar frescas, cuatro botellas de solución de digestión con HBSS modificado (preparado en 1.1.4), sulfato de magnesio (MgSO4), cloruro de calcio (CaCl 2), tripsina, desoxirribonucleasa IV (DNasa IV), y 1% de antibiótico vol / vol ( 10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) como se muestra en la Tabla 1. </li><li> Preparar gradiente de densidad media centrifugación <ol><li> Preparar la solución de los medios de comunicación centrifugación de densidad complementando los medios de densidad de centrifugación con 10% vol / vol HBSS 10x. </li><li> Preparar 14 tubos de ensayo con una solución de medios de comunicación centrifugación de densidad y HBSS modificado, como se describe en la Tabla 2. </li><li> Mezcle cada solución densidad (paso 1.1.6.2) vigorosamente antes de añadir su contenido al gradiente. Suavementeañadir las soluciones de densidad a un tubo de centrífuga de vidrio de 50 ml con una bomba peristáltica (1 ml / min), comenzando con la concentración más alta (70%). Evitar gotitas mediante el drenaje de las soluciones contra la pared del tubo para mantener la separación adecuada de cada capa del gradiente. <ol><li> En ausencia de una bomba peristáltica, aplicar las capas muy suavemente con pipetas Pasteur. </li></ol></li></ol></li><li> Preparar tampón final funcionamiento completando el tampón de ejecución (véase la Tabla de Materiales) con 2% de antibiótico vol / vol / antimicótico (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina). Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> aislamiento citotrofoblasto velloso Nota: El uso quirúrgico estéril equipos, material de vidrio, pipetas, matraces, etc. <ol><li> En el día del aislamiento citotrofoblasto velloso, en un baño de agua C 37 °, calentar las soluciones digestiones (de la etapa 1.1.5) y 70 ml de FBS. Nota: El uso de 50 ml de FBS para interrumpir las digestiones y larestante 20 ml para la etapa de congelación (1.2.22) que se puede colocar en hielo una vez descongelado. </li><li> Después del parto, llevar la placenta al laboratorio en medio de transporte enfriado con hielo (de la etapa 1.1.1) lo más rápidamente posible (menos de 1 hora). </li><li> Descartar el medio de transporte y la sangre de la placenta en el cubo de basura líquida. Pesar la placenta y se sumergen en una solución salina fría. </li><li> Medir y analizar las siguientes características: longitud del cordón umbilical; la localización del cordón umbilical; longitud de la placenta, ancho, forma (ovalada, discoide); color de las membranas; patologías de la estructura de los cotiledones. Nota: Los datos se presentan en la sección de resultados. </li><li> Cortar el cordón umbilical junto a su inserción placentaria (es decir, en su base con un 1 cm círculo de radio adicional alrededor del cordón). Sumergir en 300 ml de solución de fijación de tejido histológico (formalina al 10%) para el análisis histológico posterior. </li><li> Cortar toda la placenta en cubos de 5 x 5 x 5 cm. Lavar a fondo (4 veces x ~ 1 min) en el sol de solución salinaution (0,9%) para eliminar células de la sangre hasta que la solución salina es clara. Desechar el enjuague líquido. </li><li> En un vidrio de reloj, retire membranas de la placenta y tejidos de carne picada para eliminar los vasos sanguíneos y calcificaciones. Mantenga los vasos sanguíneos firmemente con unas pinzas y extraer tejidos, utilizando la parte posterior de tijeras Metzenbaum. <ol><li> Coloque la placenta picada en un embudo Büchner. Enjuague con aproximadamente 100 ml de tampón de solución salina. Continuar picado hasta el 30 - Se obtiene 35 g de tejido picado (el uso de plástico con un peso del barco y la escala). Si es necesario, picar el resto de la placenta para obtener hasta tres adicionales 30 - 35 g preparados. Durante este tiempo, poner los tejidos picada en un recipiente pesado sobre hielo. Nota: Este paso se llevará alrededor de 45 minutos a 1 hora. </li></ol></li><li> Añadir el 30 - 35 g de tejido de la placenta picada a un matraz de tripsinización. Transferencia de 150 ml de la digestión preparado solución 1 (Tabla 1) al matraz trypsinizing y mezclar bien. </li><li> Colocar el matraz en trypsinizingun baño de agua con agitación durante 30 min a una velocidad de no más de 50 ciclos / min y mezclar manualmente el matraz de tripsinización cada 5 min para la digestión homogénea. </li><li> Al final de la primera digestión, quitar el matraz de tripsinización del baño de agua y la incline (45 °) durante 1 min para sedimentar el tejido de la placenta. Con una pipeta estéril de 10 ml, retirar y desechar aproximadamente 80 ml de sobrenadante. Evitar aspirar el tejido. </li><li> Transferir 100 ml de solución de digestión 2 (Tabla 1) al matraz trypsinizing; mezclar bien y repita el paso 1.2.9. </li><li> Al final de la segunda digestión, quitar el matraz de tripsinización del baño de agua y inclinarlo 45 ° durante 1 min. Con una pipeta estéril de 10 ml, 80 ml eliminar el sobrenadante y transferir con cuidado a un tubo de centrífuga con un filtro de células (malla 100 micras). Transferir el sobrenadante se filtró a un vaso de precipitados que contiene 2 ml de FBS cada vez que el tubo de centrífuga está lleno. </li><li> Realizar la tercera digestión como se describe para lasegunda digestión (1.2.11 y 1.2.12), utilizando 75 ml de solución de digestión 3. En paralelo, realice los pasos a 1.2.15 1.2.16.1 para la digestión 2. </li><li> Realizar la cuarta digestión exactamente como la tercera digestión utilizando la solución de digestión 4 (75 ml), pero recoger una cantidad máxima de sobrenadante. Realice los pasos a 1.2.15 1.2.16.1 en paralelo para la digestión 3, y finalmente para la digestión 4. </li><li> Alícuota el sobrenadante (de digestiones 2, 3 y 4) en 13,5 ml partes, cada parte en un tubo de centrífuga de 15 ml. Con un 22.8 cm de largo pipeta Pasteur de vidrio, muy suave y lentamente colocar 1,5 ml de FBS en la parte inferior de cada tubo con el fin de crear una capa separada. No mezcle FBS y el sobrenadante. Centrifugar los tubos sin freno durante 20 minutos a 1.250 xg a temperatura ambiente. Nota: Después de la centrifugación, 4 capas son visibles en el tubo, como se muestra en la Figura 1 La separación de las células tripsina y trofoblásticas evita la digestión celular excesiva.. </li><li> Con una bomba de vacío, ASPIRcomieron y descartar el sobrenadante (solución de digestión) y las capas de FBS, incluyendo la película blanquecina entre las dos capas. Resuspender el sedimento (los trofoblastos y capas de células de sangre rojas) con 1 ml de medio de cultivo celular caliente (paso 1.1.2; sin FBS y no HEPES). <ol><li> Recoger las células resuspendidas de todos los tubos y combinarlos en 1 tubo. Deje que el tubo de reposar a temperatura ambiente hasta que el fin de todas las digestiones. Nota: Después de todas las digestiones, el rendimiento normal es de 3 tubos de células resuspendidas (uno por la digestión). </li></ol></li><li> Completar el volumen a 15 ml con medio de cultivo celular caliente. Centrifugar a 1250 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante con una bomba de vacío. Evitar aspirar el pellet. </li><li> resuspender suavemente el sedimento obtenido a partir de los 3 tubos con 1 ml de medio de cultivo celular caliente. En común su contenido en 1 tubo. Para obtener 8 ml, completar el volumen con medio de cultivo celular caliente. </li><li> Muy capa suavemente la suspensión de células en un graduado de separaciónient con una pipeta Pasteur. Centrifugar sin freno durante 30 min a 507 xg a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación, identificar las diferentes capas de células en el gradiente con iluminación de fondo. Localizar las capas que contienen trofoblasto y contaminación de las células entre 40 - 50% de medio de centrifugación por densidad. Con una bomba de vacío, eliminar las capas superiores (&gt; 50%). </li><li> Recoger las células situadas en las capas de interés con una pipeta Pasteur y transferirlos a un tubo de centrífuga de 50 ml. Completar el volumen hasta 50 ml con medio de cultivo celular. Centrifugar durante 10 minutos a 1250 xg a temperatura ambiente. </li><li> En condiciones estériles, descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado con 20 ml de FBS y contar el número de células utilizando un hemocitómetro. En el hielo, añadir 2,22 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) estéril y mezclar suavemente moviendo de un tirón. Alícuota de 1,5 ml de suspensión de células en viales criogénicos, congelar durante la noche a -80 ° C y transferir a un tanque de nitrógeno líquido. </li></ol></li> &lt;li&gt; purificación Trofoblasto <ol><li> Instalar el enjuague y tampones en ejecución y una nueva columna de filtro en el instrumento de purificación magnética de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realizar el &quot;programa de limpieza&quot; para limpiar los puertos 1 negativos, positivos 1 y 2 positivos, y luego introducir los tubos de 50 ml en cada puerto según las instrucciones del fabricante. </li><li> Descongelar las células que fueron congelados en el paso 1.2.22 rápidamente en un baño de agua a 37 °. La transferencia de células a un tubo de 50 ml y suspender las células suavemente con 20 ml de solución tampón fría. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 450 x g y 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante. Repita el paso de lavado con tampón corriente fría. Recuento de células utilizando un hemocitómetro para determinar la viabilidad. Repetir la centrifugación (durante 5 min, 450 xga 4 ° C). Retirar con cuidado el sobrenadante. Añadir 1 ml de tampón corriente fría que contiene vol de anticuerpos anti-HLA-ABC ratón 1% vol /. Se incuba a 4 ° C durante 30 min, mixing suavemente cada 5 minutos. </li><li> Añadir 6 ml de tampón corriente fría. Centrifugar durante 5 min a 450 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y repetir este paso. Resuspender las células en 1 ml de tampón corriente fría que contiene vol de perlas magnéticas de anticuerpos acoplados secundario anti-ratón de 10% vol /. Se incuba a 4 ° C durante 15 min, mezclando suavemente cada 5 min. </li><li> Añadir 6 ml de tampón corriente fría. Centrifugar durante 5 min a 450 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 5 ml de tampón corriente fría. </li><li> Se separan las células del trofoblasto de utilizar el instrumento de purificación magnética. Recoger las células en el puerto negativo y añadir 20 ml de tampón corriente fría. Nota: Las células trofoblásticas no contienen el complejo HLA-ABC, y por lo tanto se separan de otros tipos de células y dirigidas hacia el puerto 1 negativo. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 450 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 20 ml de medio de cultivo primario caliente. Contar las células usinga hemocitómetro para determinar la viabilidad. </li><li> Placa de las células a las siguientes densidades: 0.15 x 10 6 células / pocillo en placas de 96 pocillos, 1,6 x 10 6 células / pocillo en placas de 24 pocillos y 4,5 x 10 6 células / pocillo en placas de 6 pocillos. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Confirmar la pureza de las células trofoblásticas por citometría de flujo 16,17 y / o por inmunohisto 18. Nota: Se determinó la pureza de las células inmunopurificados utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con FITC contra citoqueratina-7 y vimentina 17-19. Este protocolo es bien detallado en Lanoix et al., 2008 7. </li><li> Después de al menos 4 horas, lavar las células dos veces con medio de cultivo caliente para eliminar las células no unidas y luego transferir las placas a la cámara de normoxia, que se compone de 8% de O 2 (véase la Figura 2 y en la sección 2). </li></ol></li></ol> 2. En Vitro induction de normoxia e hipoxia / reoxigenación <ol><li> Operación de cámara de la incubadora (véase la Figura 2A para la puesta a punto). <ol><li> En una campana de flujo laminar, coloque una placa de Petri que contiene agua estéril en la parte inferior de la cámara de la incubadora para evitar la sequedad; a continuación, colocar las placas o frascos (paso 1.3.10) de cultivo de células previamente preparadas en los estantes superiores de la cámara. </li><li> Fuera de la campana, conecte la cámara (orificio de entrada) a la manguera de gas (Figura 2A: 5a, b y c) para llegar al tubo de gas (8% de O 2 o 0,5% de O 2) (Figura 2A: 7). Abra las dos orificios de entrada y salida de la cámara. En este momento, el regulador de gas (Figura 2: 4) debe permanecer cerrada. </li><li> Abrir con cuidado la válvula reguladora de gas (Figura 2: 4). Flush para 4 min con un flujo de aire de 25 L / min para reemplazar completamente el aire dentro de la cámara. </li><li> Después de inundar la cámara, cerrar el regulador de gas a continuación, la entrada y outlet puertos de la cámara. </li><li> Desconectar la manguera de salida del medidor de flujo (Figura 2A: 5c) del puerto de entrada de la cámara y colocar la cámara en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C. </li><li> Reemplazar el aire actualmente presente en los platos, frascos y disuelto en el medio de cultivo por llenado de la cámara con gas 1 hr después de la etapa 2.1.3. </li><li> Repita los pasos 2.1.1 a 2.1.6 para las otras composiciones de gas (por ejemplo, 2% de O2 para el primer trimestre de cultivo trofoblasto 9). </li></ol></li><li> Para confirmar el porcentaje de oxígeno (Figura 2B-C) <ol><li> Para confirmar la concentración de oxígeno en el medio de cultivo celular (sin células) dentro de la cámara, utilice un electrodo de oxígeno conectada a un adaptador de oxígeno. Conectar la sonda de oxígeno a un voltímetro. </li><li> Crear una curva de calibración en la misma solución (es decir, medio de cultivo celular) mediante la exposición de la solución a los gases con contenido de oxígeno conocido (por ejemplo, 0% y21% de oxígeno). Después se estabilizan las lecturas para cada concentración, introducir el electrodo en el medio en la cámara. Nota: Tome todas las mediciones a la misma profundidad con el fin de evitar cualquier sesgo en la concentración de oxígeno 10. </li></ol></li><li> La inducción de la normoxia e hipoxia / reoxigenación en trofoblastos. <ol><li> Después de la adición de las células trofoblásticas primarias a los matraces de cultivo de células apropiadas, placas o placas de Petri, realizar tratamientos según sea necesario. </li><li> En paralelo, dentro de la cámara, exponer las células a la mezcla de gas deseada para reproducir una condición específica cada 24 horas (Figura 3). </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los mamíferos, el desarrollo fetal depende directamente de la función placentaria adecuada. Los orígenes del desarrollo de trastornos de la salud se basan en la hipótesis de que la causa de las enfermedades que se manifiestan más tarde en la vida se remonta al desarrollo temprano y que la placenta tiene una función mecánica en la programación fetal 30-32. La placenta es el mediador clave de crecimiento y desarrollo del feto: regula la transferencia de nutrientes, protege contra la exposición dañina, y tien...

Durante el embarazo humano, las células citotrofoblastos placentarios, que son células madre mononucleadas, rápidamente proliferan y se diferencian en cualquiera de las células citotrofoblastos vellosos o extravillous. citrofoblastos extravelloso invaden y remodelar las arterias espirales de la pared uterina. Citotrofoblastos vellosos, por el contrario, siguen proliferar, diferenciarse y se fusionan para formar sincitiotrofoblasto multinucleadas (el sincitio) 1. El mantenimiento de la homeostasis del trofoblasto velloso es esencial para el bienestar del feto y el embarazo saludable. De hecho, los trofoblastos vellosidades permiten el intercambio materno-fetal de oxígeno y nutrientes, y producen hormonas esenciales para el embarazo. Por otra parte, el sincitiotrofoblasto es el único tipo de células en contacto directo con la circulación de la sangre materna y proporciona una barrera física e inmunológica esencial. Por lo tanto, el sincitiotrofoblasto debe someterse a la apoptosis y sustitución para el mantenimiento de la homeostasis y para evIdentificación del placentaria patologías 2-5. La técnica desarrollada por Kliman et al., 6 en 1986 para aislar citrofoblastos vellosidades primarias de placentas humanas provocó una revolución en la investigación de la placenta al permitir el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la diferenciación del trofoblasto velloso. Esta técnica clásica, sobre la base de las digestiones enzimáticas secuenciales con tripsina y DNasa, seguido de aislamiento en los medios de densidad de centrifugación (partículas de sílice coloidal recubierto por polivinilpirrolidona, o Percoll) es ahora reconocido como el estándar de oro para el aislamiento de células del citotrofoblasto velloso. La técnica se puede optimizar mediante inmunopurificación magnético, un procedimiento que separa citotrofoblastos vellosos de las células no trofoblásticas en base a la expresión diferencial de antígenos específicos en la superficie de estas células. Elegimos el antígeno leucocitario humano ABC (HLA-ABC) debido a la ausencia de su expresión en la célula trofoblástica membrane 7,8. La placenta es un órgano que sufre variaciones importantes en los niveles de oxígeno durante el embarazo. En el primer trimestre, la relación de la oxigenación es fisiológicamente muy baja (2% de O2), pero aumenta a niveles leves de oxigenación (8% O 2) en el segundo y tercer trimestre. Tuuli et al. 9 describe que la reproducción in vitro del medio ambiente en el interior del trofoblasto vellosidades placentarias es un desafío y las variaciones en los niveles de oxigenación pueden incluso conducir a cambios fenotípicos. Es, por lo tanto, sugiere adoptar 8% de oxígeno como normoxia para imitar la tensión de oxígeno que se encuentra en vellosidades placentarias durante el tercer trimestre de gestación 8,9. Chen et al. 10 ampliamente estudiado diversas variables relacionadas con la tensión de oxígeno en cultivos de células del trofoblasto y demostró la importancia de la determinación de los niveles de oxígeno en un ambiente pericellular. Los niveles de oxígeno en el vellosidades tienden a aumentardebido a la vasculogénesis. El flujo de sangre en las vellosidades placentarias aumenta constantemente y el nivel de peróxido de hidrógeno (una abundancia de especies reactivas del oxígeno) es una señal importante que controla la vasculogénesis 11,12. En las complicaciones del embarazo, la falta de vasculogénesis genera hipoxia, y lo más importante, las variaciones intermitentes de oxigenación (hipoxia llamados / reoxigenación). Estas condiciones llevan a un aumento anormal en el estrés oxidativo, lo que compromete la placenta y del 13,14 viabilidad fetal. Las alteraciones que se someten las células del trofoblasto in vivo durante los episodios de hipoxia / reoxigenación se pueden imitar in vitro de la siguiente manera: citrofoblastos vellosidades se mantienen en condiciones de normoxia (8% O 2) hasta que se diferencian en sincitiotrofoblasto. A continuación, se someten a condiciones de hipoxia (0,5% de O 2) para 4 horas, seguido de un 18 hr adicional de normoxia (reoxigenación). El uso de este enfoque hipoxia / reoxigenación, trofoblastos exHiBit desregulado estado redox y el aumento de los niveles de apoptosis intrínseca 8, como se ha observado en ciertas complicaciones del embarazo. Por lo tanto, este es un útil modelo in vitro para evaluar nuevos enfoques preventivos y terapéuticos para combatir las complicaciones del embarazo asociados con la placenta hipoxia / reoxigenación. Células de la placenta producen melatonina, que tiene varias funciones importantes, tales como la capacidad de evitar el estrés oxidativo y la disfunción placentaria 15. A continuación, presentamos los modelos de aproximación y de células experimentales utilizados para demostrar el efecto protector de la melatonina en las células trofoblásticas de la placenta a nivel molecular, celular y funcional 8.

<table><tbody><tr><td>Tijeras Curvas Metzenbaum</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>equipo quirúrgico (aislamiento celular) (2 unidades)</td></tr><tr><td>Pinzas Splinter Fine 41/2 en</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>equipo quirúrgico (aislamiento celular) (2 unidades)</td></tr><tr><td>Tijeras 4.5 Str Disección</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>equipo quirúrgico (aislamiento celular) (2 unidades)</td></tr><tr><td>Esponja de gasa 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td>361020733</tr><tr><td>Bandeja para hornear de vidrio oblongo</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>Cristalería (2,8 L)</td></tr><tr><td>Embudo Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Cristalería (114 mm de diámetro)</td></tr><tr><td>Vidrio para relojes&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td></td></tr><tr><td>Cristalería Solución de formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>solución fijadora de tejidos histológicos</td></tr><tr><td>Frascos tripsinizantes</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>Cristalería (1 unidad)</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo desechables</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td></td></tr><tr><td>Cristalería Vidrio de borosilicato Pipeta Pasteur (22,8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>Cristalería</td></tr><tr><td>250 ml Vasos de Precipitados</td><td>de Vidrio Fisherbrand KFS14005250</td><td></td><td>Cristalería</td></tr><tr><td>Botellas de Vidrio Media con Tapón</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>Cristalería (8 unidades)</td></tr><tr><td>50 ml Tubo Corex&nbsp;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td><td>(1 unidad)</td></tr><tr><td>15 ml Tubo de centrífuga de poliestireno</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo de centrífuga de poliestireno</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serológica</td><td>Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>filtro de células 100 &mu; m Nylon</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Absorbant Liner Scienceware</td><td></td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp; ml Botellas Top Filter</td><td>Corning</td><td></td><td>Pore: 0.22&nbsp; y micro; m / medio y HBSS preparación</td></tr><tr><td>2 ml Viales criogénicos</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>contenedor de congelación, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3 modelo</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua agitable</td><td>Fisher</td><td>modelo 127</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Solución salina 0.9%</td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina tamponada (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Cantidad: 9.25 (un vial) para 1 L de solución de digestión</td></tr><tr><td>Ácido hidroxipiperazinaetanhólico (Hepes)</td><td><a name="¡RANGO! B29">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>25 ml (1 M) para 1 L de solución de digestión</td></tr><tr><td>Tripsina Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9.888 U</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa Tipo IV</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402.000 U</td></tr><tr><td>Cloruro de Calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnesio</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Sulfato de estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Gradiente de medios de centrifugación por densidad. Volumen: 36 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Separador Magnético Automacs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Modelo 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp; Columnas&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Running Buffer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Solución de enjuague Automacs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Anti-humano Hla Abc clon purificado W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>anti-ratón</td></tr><tr><td>anticuerpo Anti ratón Igg Microperlas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>Placa de pocillos múltiples -&nbsp; 6 pocillos con Tapa</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Superficie de unión de celdas</td></tr><tr><td>Placa de pocillos múltiples -&nbsp; 24 pocillos con tapa</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Superficie de unión de celdas</td></tr><tr><td>Placa de pocillos múltiples -&nbsp; 96 pocillos con tapa</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Superficie de unión de celdas</td></tr><tr><td>Cámara de incubadora modular&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Es necesario un conjunto de dos para generar simultáneamente condiciones de normoxia e hipoxia/reoxigenación Medidor de</td></tr><tr><td>flujo único</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Filtro en línea</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, poro: 1.0 y micro; m</td></tr><tr><td>Regulador de gas</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>Es necesario un conjunto de dos para generar simultáneamente condiciones de normoxia e hipoxia/reoxigenación</td></tr><tr><td>Manguera de gas Clase Vi Clear 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 piezas con ~ 0,5 m</td></tr><tr><td>17 mm Abrazadera de manguera de gas ajustable</td><td>Tirantes</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de gas Normoxia&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Talla K (3rd composición del trimestre: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Cilindro de gas Normoxia&nbsp;</td>Composición del trimestre de <td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Talla K (3rd: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Microelectrodo Mi-730</td><td>Microelectrodos INC</td><td>84477</td> Microelectrodos Adaptador de Oxígeno INC 3572 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de detección de ROS: CM-H2DCFDA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-hCG kit ELISA&nbsp;</td><td>DRG internacional</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin anticuerpo purificado</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>Huésped:</td></tr><tr><td>ratón Anticuerpo anti-citoqueratina 7 (FITC)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>Anfitrión: ratón</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra Anti-mousse IgG H& Anticuerpo L</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Este protocolo describe cómo las células vellositas del citotrofoblasto se aíslan de las placentas a término mediante digestiones enzimáticas sucesivas, seguidas de centrifugación por densidad, aislamiento en gradiente de medios y purificación inmunomagnética. Como se observó in vivo, las células vellosas mononucleadas del citotrofoblasto en cultivo primario se diferencian en células multinucleadas de sincitotrofoblasto después de 72 horas. En comparación con la normoxia (8%O2), las células vellositas del citotrofoblasto que experimentan hipoxia/reoxigenación (0,5% / 8%O2) experimentan un mayor estrés oxidativo y apoptosis intrínseca, similar a la observada in vivo en complicaciones del embarazo como la preeclampsia, el parto prematuro y la restricción del crecimiento intrauterino. En este contexto, los trofoblastos vellosíticos primarios cultivados en condiciones de hipoxia/reoxigenación representan un sistema experimental único para comprender mejor los mecanismos y las vías de señalización que se alteran en la placenta humana y facilitar la búsqueda de fármacos eficaces que protejan contra ciertos trastornos del embarazo. Los trofoblastos vellosidos humanos producen melatonina y expresan sus enzimas y receptores sintetizadores. La melatonina se ha sugerido como un tratamiento para la preeclampsia y la restricción del crecimiento intrauterino debido a sus efectos antioxidantes protectores. En el modelo primario de células vellositosas citotrofoblásticas descrito en este artículo, la melatonina no tiene ningún efecto sobre las células trofoblásticas en estado normóxico, pero restaura el equilibrio redox de las células sincitiotropoblásticas interrumpidas por hipoxia/reoxigenación. Por lo tanto, las células trofoblásticas vellosas humanas en cultivo primario son un excelente enfoque para estudiar los mecanismos detrás de los efectos protectores de la melatonina sobre la función placentaria durante la hipoxia/reoxigenación.

El aislamiento y la inmunopurificación de las células del citotrofoblasto velloso de la placenta normal plazo obtenidos por parto vaginal produjo 1 x 10 8 células viables. La placenta pesa 350 g, fue de 19 cm de diámetro, 4 cm de altura con forma discoidal y las membranas transparentes. No se detectó cotiledón malformación. El cordón umbilical tenía localización paracentral y una longitud de 56 cm. La pureza se evaluó por citometría de flujo utilizando vimentina y citoqueratin...

Este manuscrito presenta un modelo in vitro único de células de citotrofoblasto velloso humano inmunopurificadas cultivadas bajo hipoxia/reoxigenación. Este modelo es adecuado para estudiar los efectos protectores de tratamientos prometedores, como la melatonina, sobre las complicaciones del embarazo asociadas con el aumento del estrés oxidativo y la alteración de la función placentaria.

Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar los efectos protectores de la melatonina utilizando células primarias de citotrofoblasto coriónico humano inmuno-purificadas, cultivadas bajo hipoxia o reoxigenación. Este método puede ayudar a comprender los mecanismos y las vías de señalización asociadas con complicaciones del embarazo en las que la placenta se encuentra bajo condiciones de hipoxia y reoxigenación. La principal ventaja de esta técnica es que resulta adecuada para estudiar tratamientos prometedores, como la melatonina, en trastornos del embarazo asociados con un estrés oxidativo aumentado.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con los pasos de aislamiento de citotrofoblastos vellosos, como la picadura de tejidos y la preparación del gradiente medio de centrifugación por densidad. Aunque este procedimiento puede proporcionar información sobre el trofoblasto del tercer trimestre, también puede aplicarse a otros sistemas, como la placenta del primer trimestre y la placenta de otras especies. La demostración visual de este método es importante, ya que muchos pasos son difíciles de aprender sin verlos, lo que aumenta la reproducibilidad y reduce el tiempo de aprendizaje.Los estudiantes de posgrado Andree-Anne Hudon-Thibeault, Philippe Wong Yen y Eugenia Assuncao de mi laboratorio demostrarán el procedimiento. Para comenzar este procedimiento, corte el cordón umbilical a lo largo de su inserción placentaria y guárdelo en 300 ml de solución fijadora de tejidos para análisis histológico. Luego, corte toda la placenta en cubos.Lave los cubos repetidamente con solución salina para eliminar cualquier célula sanguínea hasta que la solución salina quede clara. A continuación, retire las membranas placentarias y pique los tejidos para eliminar aún más los vasos sanguíneos y permitir las calcificaciones. Luego sujete firmemente los vasos sanguíneos con pinzas y retire los tejidos picados.A continuación, coloque la placenta picada en un embudo de Buchner y enjuague los tejidos con 100 ml de tampón salino. Continúe picando hasta obtener entre 30 y 35 gramos de tejido picado y colóquelo en un recipiente para pesar sobre hielo. Posteriormente, añada los tejidos placentarios picados a un matraz para tripsinización.Luego, transfiera 150 ml de la solución de digestión preparada 1 al frasco de tripsinización y mezcle bien. Coloque el frasco de tripsinización en un baño de agua con agitación durante 30 minutos y mezcle manualmente el frasco de tripsinización cada cinco minutos para homogeneizar la digestión. Al final de la primera digestión, retire el frasco de tripsinización del baño de agua e inclínelo a 45 grados durante un minuto para sedimentar los tejidos placentarios.Con una pipeta estéril de 10 ml, retire y deseche aproximadamente 80 ml del sobrenadante sin aspirar el tejido. Posteriormente, transfiera 100 ml de la solución de digestión 2 al frasco de tripsinización y mezcle bien. Coloque el frasco de tripsinización en un baño de agua con agitación durante 30 minutos y mezcle manualmente el frasco de tripsinización cada cinco minutos para lograr una digestión homogénea.Al finalizar la segunda digestión, retire el frasco con tripsina del baño de agua e inclínelo a 45 grados durante un minuto. Retire 80 ml del sobrenadante y transfiéralos suavemente a un tubo de centrífuga con un filtro celular de malla de 100 micrómetros. Realice la tercera y cuarta digestión y alícuote el sobrenadante de las digestiones dos, tres y cuatro en porciones de 13,5 ml en tubos de centrífuga de 15 ml.Luego, agregue 1,5 ml de suero bovino fetal suave y lentamente en la parte inferior de cada tubo para crear una capa separada. Centrifugue los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, aspire y deseche las capas de sobrenadante y suero bovino fetal, incluyendo la película blanquecina entre las dos capas.Re-suspender el sedimento en 1 ml de medio de cultivo celular tibio. Recoger las células re-suspendidas de todos los tubos y combinarlas en un solo tubo por digestión. A continuación, aforar hasta un volumen de 15 ml con medio de cultivo celular tibio.Centrifugue las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, elimine el sobrenadante con una bomba de vacío y evite aspirar el precipitado. A continuación, resuspenda suavemente el precipitado con 1 ml de medio de cultivo celular tibio.Reúna el contenido de los tubos de todas las digestiones. Añada medio de cultivo celular tibio adicional para obtener un volumen de 8 ml. A continuación, coloque suavemente la suspensión celular en un gradiente de separación y centrifugue durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, identifique las diferentes capas de células en el gradiente mediante retroiluminación. Localice las capas que contienen trofoblastos y las células contaminantes entre el 40 % y el 50 % del medio de centrifugación por densidad y elimine las capas superiores con una bomba de vacío. Posteriormente, recoja las células ubicadas en las capas de interés y transfiéralas a un tubo cónico de 50 ml.Complete el volumen hasta 50 ml con medio de cultivo celular y centrifugue durante 10 minutos a temperatura ambiente. Bajo condiciones estériles, descongele rápidamente las células que fueron congeladas en el paso 1.2.22 en un baño de agua a 37 grados Celsius. Transfiera las células descongeladas a un tubo de 50 ml y resuspenda suavemente con 20 ml de tampón frío de trabajo.A continuación, centrifugue el tubo durante cinco minutos a 4 grados Celsius. Deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado con tampón frío en circulación. Luego, cuente las células utilizando un hemocitómetro para determinar su viabilidad, seguido de repetir nuevamente la centrifugación.Posteriormente, retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 1 ml de tampón de corrida frío que contenga 1% en volumen de volumen de anticuerpo ratón anti-HLA ABC a las células. Incube las células a 4 grados Celsius durante 30 minutos, mezclando suavemente cada cinco minutos. Después de la incubación, agregue 6 ml de tampón de corrida frío y centrifugue durante 5 minutos a 4 grados Celsius.Deseche el sobrenadante y repita este paso. A continuación, reponga las células en 1 ml de tampón de trabajo frío que contenga 10% en volumen de volumen de perlas magnéticas acopladas a anticuerpo secundario anti ratón. Después, incube las células a 4 grados Celsius durante 30 minutos, mezclando suavemente cada 5 minutos nuevamente.Posteriormente, agregue 6 ml de tampón de corrida frío y centrifugue durante 5 minutos a 4 grados Celsius. Descarte el sobrenadante y resuspenda las células en 5 ml de tampón de corrida frío. A continuación, separe las células trofoblásticas utilizando el instrumento de purificación magnética y recoja las células en el puerto negativo.Añada 20 ml de tampón de lavado frío a las células y centrifugue durante 5 minutos a 4 grados Celsius. Deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente las células en 20 ml de medio tibio de cultivo primario de células que contenga 10% de suero bovino fetal antes de contarlas para determinar su viabilidad. A continuación, siembre las células e incúbelas a 37 grados Celsius y 5% de CO2.Después de al menos cuatro horas, enjuague las células dos veces con medio de cultivo tibio para eliminar cualquier célula no adherida. Luego, transfiera las placas a la cámara de normoxia, que se llenará con 8%O₂. Fuera de la cabina, conecte el puerto de entrada de la cámara a la manguera de gas para acceder al tubo de gas.Abra ambos puertos de entrada y salida de la cámara y mantenga el regulador de gas cerrado. A continuación, abra cuidadosamente la válvula del regulador de gas y purgue con un flujo de aire de 25 litros por minuto durante 4 minutos para reemplazar completamente el aire dentro de la cámara. Después de purgar la cámara, cierre el regulador de gas, seguido de los puertos de entrada y salida de la cámara.Desconecte la manguera de salida del medidor de flujo del puerto de entrada de la cámara y coloque la cámara en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius durante una hora. Reemplace el aire presente actualmente en las placas, matraces y disuelto en el medio de cultivo rellenando la cámara con gas a un caudal de 25 litros por minuto durante 4 minutos. Esta figura muestra el efecto de la melatonina sobre la secreción de gonadotropina coriónica humana beta durante la diferenciación del trofoblasto vellositario.La diferenciación bioquímica de citotrofoblastos vellosos en sincitiotrofoblastos se determinó mediante los valores crecientes de gonadotropina coriónica humana beta, que alcanzaron un valor máximo tras 72 horas de cultivo celular, como se muestra aquí. El tratamiento con melatonina no tuvo efecto sobre la diferenciación de citotrofoblastos cultivados en un 8% de oxígeno en comparación con el control vehicular. Aquí se muestra el efecto de 1 milimolar de melatonina sobre los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno en células de sincitiotrofoblasto bajo normoxia o reoxigenación tras hipoxia inducida tras 72 horas de cultivo.El tratamiento con melatonina protege a los sinciciotrofoblastos frente al estrés oxidativo aumentado por la hipoxia-reoxigenación, restaurando los niveles de especies reactivas de oxígeno a los niveles de normoxia. Este esquema ilustra los amplios efectos protectores intracelulares de la melatonina contra el estrés oxidativo inducido por hipoxia-reoxigenación y la apoptosis mitocondrial en sinciciotrofoblastos primarios. Una vez dominada, la técnica de aislamiento puede realizarse en ocho horas, y tres horas son suficientes para obtener células trofoblásticas purificadas si se realiza adecuadamente.Después de su desarrollo, la técnica de aislamiento, purificación y cultivo primario de citotrofoblastos bajo la técnica de hipoxia-reoxigenación allanó el camino para comprender mejor las complicaciones del embarazo y mejorar la salud placentaria y fetal. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evaluar la pureza de las células trofoblásticas vellosas al final de la inmunopurificación. Por ejemplo, mediante citometría de flujo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar un citotrofoblasto viloso primario inmuno-purificado y cultivarlo bajo hipoxia-reoxigenación.

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

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