Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas

El objetivo general de este modelo es investigar cómo la rigidez y el grosor de la membrana basal, debido a la glicación avanzada y la exposición al producto, pueden modular el comportamiento celular invasivo correspondiente a las etapas tempranas y avanzadas del cáncer de próstata metastásico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las patologías relacionadas con la edad. Por ejemplo, cómo el aumento de la rigidez y el grosor de la membrana basal contribuye a la progresión del cáncer y también a los trastornos metabólicos como la diabetes.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método sencillo para imitar el nivel de rigidez medido en los tumores de próstata humanos en el entorno clínico. La implicación de esta técnica se extiende a nuestra terapia y diagnóstico del cáncer de próstata al mejorar nuestra comprensión de cómo la rigidez de la membrana basal promueve cambios moleculares y celulares. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, porque el modelo es multidisciplinario.

Combinación de técnicas de los campos de la química, la física y la biología. Primero tuvimos la idea de este método cuando planteamos la hipótesis de que la rigidez de la membrana basal en la glándula prostática puede promover un comportamiento invasivo de novo en células epiteliales transformadas conocidas. La demostración en video de este método es fundamental, porque es necesario describir los pasos interdisciplinarios.

Incluyendo la reticulación de la membrana basal, seguida de cultivo celular en 3D. Comience preparando una superficie uniforme de hielo y utilícela para enfriar un portaobjetos de vidrio de ocho pocillos a cuatro grados centígrados. A continuación, corte el extremo de la punta de una pipeta de 200 microlitros y enfríe la punta a cuatro grados centígrados también.

Una vez enfriada, coloque la punta sobre una ayuda de pipeteo de 200 microlitros de capacidad. Y úselo para transferir 40 microlitros de solución de matriz BM helada a cada pocillo del portaobjetos de vidrio refrigerado de ocho pocillos. Luego coloque el portaobjetos de la cámara a 37 grados centígrados durante 30 minutos para promover la polimerización de la membrana basal.

Cierre la puerta de la incubadora con mucho cuidado para evitar alterar la membrana basal líquida reconstituida. Después de exactamente 30 minutos, agregue 250 microlitros de una solución de glicoaldehído preparada para cubrir la membrana basal polimerizada y reconstituida. A continuación, prepare un control negativo añadiendo 250 mircoliters de PDS estéril a un gel nativo de membrana basal reconstituida.

Además, prepare dos controles adicionales agregando 50 milimolares de cianoborohidruro de sodio o 250 milimolares de aminoguanidina a la solución de glicoalaldehído antes de agregarla al gel de membrana basal. Luego, incube los geles a 37 grados centígrados durante seis horas para producir un gel semirrígido. O durante 14 horas para producir un gel rígido.

Después de la incubación, retire con cuidado las soluciones de los geles y agregue 250 microlitros de un éster etílico de glicina molar a cada gel. E incubarlos a 37 grados centígrados durante una hora. Lave cada gel 10 veces en 500 mircoliters de PBS para eliminar todos los rastros de la solución de glicolaldehído y el éster etílico de glicina.

Luego agregue 400 microlitros de PBS para evitar la deshidratación e incube los geles de membrana basal reconstituidos durante la noche a 37 grados centígrados. Cuando esté listo para continuar, retire el PBS de los geles de membrana basal reconstituidos y agregue 250 microlitros de agua helada y doblemente destilada a cada pozo. Incubar los geles a cuatro grados centígrados durante 16 a 24 horas para asegurarse de que la matriz esté completamente licuada.

A continuación, transfiera la membrana basal licuada a un tubo de 1,5 mililitros y mida la emisión fluorescente de la solución con un espectrofotómetro. A continuación, centrifugar la solución y eliminar el sobrenadante resultante. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de una solución que contenga 20 miligramos por mililitro de bromuro de cianógeno y 70% de ácido fórmico.

Incubar las muestras durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, utilice una jeringa desechable de un mililitro para transferir el gel de membrana basal resuspendido a un casete de diálisis con un límite de peso molecular de 3,5 kilodaltons. Sumerja el casete en un vaso de precipitados de vidrio de 500 mililitros que contenga 500 mililitros de agua bidestilada.

Y revuelva el agua con una barra magnética para agitar. Coloque esta configuración durante la noche a cuatro grados centígrados para eliminar todos los rastros de bromuro de cianógeno y ácido fórmico. Use una jeringa desechable de un mililitro para transferir la solución marcada del casete a un tubo de 1,5 mililitros.

A continuación, analice la solución ejecutándola en un gel de poliacrilamida al 12%. Tiñe el gel con tinte de plata para visualizar el patrón electroforético de los péptidos de la matriz de bromuro de cianógeno. Comenzando con los geles de membrana basal cubiertos con PBS, enjuague los geles dos veces más, con 300 microlitros de PBS que contienen 0,1 milimoles de cloruro de calcio.

Y 0,5 milimoles de cloruro de magnesio. Durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el PBS y añada 300 microlitros de paraformaldehído al 4% para cubrir cada gel de membrana basal reconstituido.

Incubar los geles durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar los componentes de la membrana basal reconstituida. A continuación, retire el fijador y agregue 300 microlitros de una solución de enfriamiento que contenga 75 milimoles de cloruro de amonio y 0,5 milimoles de cloruro de magnesio. Incube la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente, y luego retire la solución y repita el enjuague cuatro veces más.

Después del enjuague final, agregue 300 microlitros de tampón de inmunofluorescencia a los geles de membrana basal reconstituidos para evitar reacciones inespecíficas. Incubar los geles en la solución durante dos horas a temperatura ambiente en una plataforma de agitación. A continuación, retire el tampón bloqueador de inmunofluorescencia.

Y agregue 300 microlitros de anticuerpo primario que se diluye en el tampón de bloqueo. Incubar los geles de membrana basal reconstituidos a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario y lave los geles tres veces con 300 microlitros de tampón de inmunofluorescencia.

Agite los geles a temperatura ambiente en una plataforma de agitación durante 10 minutos después de cada adición de tampón. A continuación, retire el tampón y añada 300 microlitros del anticuerpo secundario marcado fluorescentemente, diluido en el tampón de bloqueo. Coloque las muestras en una plataforma de agitación e incube los geles durante dos horas a temperatura ambiente.

Retire el anticuerpo secundario. Enjuague la muestra en un tampón de inmunofluorescencia, seguido de PBS, y luego fije y enfríe las muestras por segunda vez. Por último, monta los geles y utiliza un microscopio para analizar la formación de haces densos.

Para formar acini de la glándula prostática, diluir 5.000 células RWPE-1 en 300 microlitros de KSFM completo, suplementado con un 2% de la solución de membrana basal. Para los agregados de células tumorales de próstata, diluir 2.500 células PC3 en 300 microlitros de medio de cultivo RPMI-1640, suplementado con 2% de la solución de membrana basal. Después de la incubación nocturna de los geles de membrana basal reconstituidos en PBS, enjuáguelos dos veces con 500 microlitros de medio de cultivo.

Antes de sembrar las células. Siembre suavemente las células en las membranas basales reconstituidas rígidas nativas y avanzadas del producto final de glicación. Y coloque cuidadosamente los cultivos en una incubadora para garantizar una distribución uniforme de los acinos y esferoides en crecimiento.

Para las células formadoras de acinos, cambie el medio cada dos días con un medio de cultivo fresco, que contenga un 2% de la solución de membrana basal. Para asegurar que las células tengan los factores de crecimiento necesarios para la homeostasis normal de los acinos. Después de seis días en cultivo, las células epiteliales de la próstata forman acinos en la membrana basal nativa reconstituida.

Y se organizan en esferoides uniformados de células epiteliales. Estos acinos también tienen las características de PECs altamente organizadas con polaridad apical a basal, y un espacio luminal visible. Cuando se cultivan durante seis días en la membrana endurecida, las células tienen una arquitectura alterada.

Y cambia de forma esferoidal a poligonal. Además, estos acinos son muy desorganizados. Y han perdido su polaridad apical a basal, con un espacio luminal pequeño o inexistente.

Esto también es cierto para las células derivadas de una glándula prostática afectada por la hiperplasia prostática benigna. Cuando se midieron las células tumorales de próstata, se encontró que las células permanecían más tiempo en la membrana basal rígida y reconstituida, y también migraban más rápido y tenían una mayor persistencia celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modelar los efectos de la rigidez de la membrana basal en el comportamiento de las células epiteliales y tumorales.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se induce el nivel deseado de rigidez de la membrana basal y se forman correctamente acini o s-esferoides individuales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la inducción de la invasión de células cancerosas por la rigidez de la membrana basal en la glándula prostática. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar otros métodos, como la inmunotransferencia del lisado celular, para responder a preguntas adicionales relacionadas con la vía de señalización, modulada por la rigidez de la membrana basal.

No olvide que trabajar con cianoborohidruro de sodio, bromuro de cianógeno y ácido fórmico puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio, guantes, protector facial y un respirador mientras se trabaja en la campana extractora mientras se realiza este procedimiento.