Name: Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Aprende a modelar la rigidez de la membrana basal para estudiar la invasión celular en cáncer de próstata metastásico. Este protocolo integra química, física y biología para replicar condiciones tumorales reales.

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Agradecemos a Simon Hayward (Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt) por las células BPH-1; y a Thomas Cox y Janine Erler (Centro de Investigación e Innovación en Biotecnología, Universidad de Copenhague) por su ayuda con las mediciones reológicas. MR-T fue financiado por Worldwide Cancer Research, anteriormente la Asociación Internacional de Investigación del Cáncer (Subvención 08-0803 a JS), la Embajada Británica en Montevideo y la Agencia Nacional de Investigación e Innovación (UK_RH_2015_1_2 a MR-T). MC contó con el apoyo de Prostate Cancer UK (Subvención S14-017 a JS y GS). KW fue financiado por el Consejo de Becas de China. El MAM fue financiado por la Oficina Cultural de Arabia Saudita.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Un protocolo para la generación de 3D ​​acinos glandulares de MECs en geles de RBM puros 6 fue modificada en un estudio previo de la adición de 4 mg tipo / ml de colágeno I a la matriz de la GBR. La adición de colágeno resultó en el módulo de elasticidad del gel RBM pasando de 175 ± 37 a 1589 ± 380 Pascales. Este aumento de 9,1 veces en la rigidez modula el crecimiento, la supervivencia, migración y diferenciación de MEC 21. El protocolo fue modificado de nuevo mediante la inclusión de una etapa de tratamiento con D - (-) - ribosa para promover la reticulación no enzimática del colágeno tipo I que se había añadido al gel de la GBR. Se encontró que el aumento de 15 veces resultante en la rigidez a cooperar con la transformación oncogénica de MECs para promover su comportamiento invasivo 22. El enfoque experimental de tipo adición de colágeno I a geles RBM facilita la interacción directa de MECs con fibras de colágeno, que sólo se produce en el tejido humano después de la barrera física entre el estromay el epitelio proporcionada por el BM se somete a la degradación proteolítica. Mediante la generación de los acinos glandulares 3D a partir de los PEC en geles de RBM puros pre-tratados con GLA, el protocolo actual abre el camino para estudiar cómo BM rigidez per se puede desencadenar su comportamiento invasivo (Figura 3). Los niveles de rigidez BM inducidas en este protocolo tienen relevancia fisiológica. La incubación con GLA 50 mM durante 6 hr y 14 hr aumentó, respectivamente, los módulos de elasticidad del gel RBM puro a 175 ± 90 y 322 ± 160 en comparación con 122 ± 55 Pascales en geles de RBM tratados con PBS (Tabla 1). Este aumento de 1,7 a 3,2 en la GBR rigidez recapitula el aumento de 2,5 a 3,4 veces en la rigidez observada en comparación con maligna de la próstata normal o tejido de BPH 23-26. Como se describe en una publicación reciente 13 los cambios morfológicos inducidos por la acumulación de AGE y la rigidez de gestión por resultados en el PEC acinos se puede cuantificar por un cambio estadísticamente significativo del arundada de forma poligonal, disminución de células que migran desde la que sobresalen en el acina-AGE rica RBM (Figura 3) luminal / área total de los acinos e. Inmunotransferencia también se puede utilizar para evaluar los marcadores de EMT (por ejemplo, pérdida de E-cadherina 13) y el comportamiento contráctil (por ejemplo ligera de la miosina fosforilada cadena-2, pMLC2 13) en los PEC cultivadas en normal frente rígida RBM (Figura 3). La evaluación adicional utilizando la tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal se puede aplicar a visualizar el BM (por ejemplo, laminina, colágeno IV y la acumulación de AGE 13), celular polaridad apical a-basal (por ejemplo, la localización apical de EEA1: antígeno endosomal temprano 1; y GM130: 130 kDa marcador de Golgi cis-13) y los patrones celulares de moléculas de adhesión (por ejemplo, e-cadherina localización de uniones célula-célula 13) (Figura 3). <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. Visión general de los diferentes protocolos que aquí se presenta el diagrama describe cómo preparar y endurecer la membrana basal reconstituida (RBM) con glicolaldehıdo (reacción de Maillard), la forma de sembrar las células a la rigidez de gestión por resultados, la forma de analizar la rigidez RBM ( extensión de la reacción de Maillard) y los procedimientos que se pueden utilizar para analizar los cambios celulares y moleculares inducidos por la GBR-AGE rico. AGE, productos finales de glicación avanzada; BM, la membrana basal; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol; EEA1, antígeno temprano endosomal 1; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; GLA, glicolaldehıdo; GEE, éster etílico de glicina; GM130, 130 kDa marcadores cis-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miosina de cadena ligera 2 fosforilada en sitios de treonina y serina 18 19; RBM, membrana basal reconstituida; SDS-PAGE, dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida de sodio. Para la barra RWPE1 acinos de escala = 10 micras; para las células tumorales PC3Barra de escala = 100 micras esferoides. Esta cifra ha sido modificado de referencia 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> pasos para solucionar problemas serán necesarias si D - (-) - ribosa es elegido como el agente de reticulación de la GBR. Durante el desarrollo del protocolo se encontró que el tratamiento con 1 M D - (-) - ribosa durante 72 horas, como se describe anteriormente para los geles de la GBR / colágeno 22, dio lugar a la deshidratación y la contracción de los geles de la GBR. La evaluación de las concentraciones más bajas de D - (-) - ribosa y los tiempos de tratamiento más cortos puede ayudar a superar esta limitación. Una limitación potencial en futuras aplicaciones del protocolo se podría encontrar en aplicaciones que requieren niveles más altos de la GBR rigidez. Si se utilizan tiempos de incubación más largos y concentraciones más altas de GLA para inducir niveles más altos de la GBR rigidez gel será necesario<html> evaluar si estas condiciones de tratamiento tienen un impacto sobre la supervivencia y la proliferación celular, como se ha descrito previamente 13. También hay que señalar que la incubación de células RWPE-1 con suero induce una transición EMT-como fenotípica y la exposición a suero o materiales que contienen suero debe ser evitado. Por ejemplo, si los experimentos implican la transfección de interferir corta de ARN oligonucleótidos (siRNA), el procedimiento debe ser optimizado utilizando células RWPE-1 cultivadas en KSFM, sin cambiar las células a los medios bajo transfección suero. Este inconveniente podría comprometer el nivel de silenciamiento génico logra al utilizar siRNA transitoria se acerca en el modelo. Para algunas dianas proteicas se le recomienda emplear shRNA vectores inducibles para el silenciamiento de genes sintonizable y la disminución en los niveles de proteína deseada. Las adaptaciones que incorporan reticulación enzimática por células estromales o células tumorales lisil oxidasa asociada (LOX) 17 también se podrían incorporar en los modelos futuros. jove_content &quot;&gt; Este protocolo facilitará el estudio futuro de los mecanismos pro-invasivas provocadas por la edad que dependen rigidez BM en los PEC (RWPE-1, HPB-1) y la evaluación de los objetivos anti-metastásicos en los PTC invasivos (PC3). Teniendo en cuenta que la HPB se considera que es un trastorno metabólico 27, este protocolo también allana el camino hacia nuestra mejor comprensión de la relación entre los trastornos metabólicos y aumento del riesgo de cáncer de próstata. Teniendo en cuenta que la rigidez BM inducida por su exposición a los AGE puede ser un desencadenante de invasividad en otro tipo de cáncer tipos, que serán de interés para utilizar el protocolo para establecer modelos similares que incorporan células epiteliales normales y células tumorales de otros órganos (por ejemplo, mama, colon, ovarios, páncreas). Los pasos críticos en el protocolo, junto con sus tiempos, se resumen en la Figura 4. Durante la etapa inicial, es esencial para mantener la solución madre de la GBR a 4 ° C, mientras que se descongele para evitar su polymerization. Puntas de pipeta no se deben colocar en la solución de stock rM hasta que se hayan enfriado a 4 ° C. Para el siguiente paso también es importante para asegurar que los portaobjetos de cámara se hayan equilibrado a 4 ° C antes de que se recubren con la solución de la GBR. Tan pronto como la temperatura de la solución se incrementa por encima de la GBR 4 ° C que sufrirá polimerización irreversible para formar un gel. Es esencial que la gestión por resultados no se altera durante la etapa de polimerización para asegurar que forma una superficie plana adecuada para el cultivo de células y análisis microscópico. La duración de la incubación con GLA con o sin inhibidores de la reacción Maillard (cianoborohidruro de sodio y amingoguanidine) determinará la rigidez del gel se convierte en la GBR. Se recomienda el uso de una incubación de 6 h con GLA si se requieren condiciones semi-rígidos, y la incubación 14 h si se requieren condiciones severas (Tabla 1). tiempos de incubación alternativos o concentraciones de GLA se pueden utilizar si diferentes nivelesde la rigidez de los deseados. En este caso el análisis reológico de los geles de RBM ser necesario incorporar como un paso esencial. Después de la etapa de enfriamiento rápido de la reacción de Maillard por incubación con GEE y las etapas de lavado subsiguientes con PBS, los geles RBM se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de 48 horas antes de su uso para el cultivo celular. Una vez los cultivos celulares se establecen es importante para cambiar el medio de cultivo (incluyendo cualquier tratamientos) cada dos días. Se recomienda mantener los cultivos de células 3D por 3-12 días de acuerdo con los parámetros objeto de investigación. Para 3D PEC acinos se recomienda analizar los cultivos después de 6 días, y para 3D de PTC esferoides análisis se recomienda después de 3 días de cultivo en la primera instancia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figura 4:. Descripción simple del Protocolo con etapas críticas y sincronizaciones indicado la flow diagrama representa cómo preparar y endurecer la membrana basal reconstituida (RBM) con glicolaldehıdo (reacción de Maillard) con pasos críticos y los tiempos indicados. Puntos en los que el protocolo se puede detener, y geles RBM almacena, también se indican. RBM, membrana basal reconstituida; GLA, glicolaldehıdo; GEE, éster etílico de glicina; ON, durante la noche; PBS, solución salina tamponada con fosfato; RT, la temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La membrana basal (BM) es una lámina de matriz extracelular (MEC) especializada que mantiene estables los bordes del tejido separando las capas de células epiteliales del estroma1. La reticulación covalente entre hélices triples adyacentes de colágeno IV en el BM estabiliza su asociación lateral mediante el establecimiento de una red irregular de hélices superretorcidas2. Estas redes de colágeno IV actúan como un andamio para su interacción con la laminina y otros componentes de BM1. La disposición estructural del BM le proporciona la resistencia mecánica y la rigidez necesarias para el desarrollo normal del epitelio glandular3. 
Durante el envejecimiento y la enfermedad, el BM se engrosa y endurece progresivamente3,4. Por ejemplo, entre los 50 y los 80 años se produce un aumento de 3 veces en el módulo elástico (E) de la MO ocular en la población normal, y este endurecimiento se exacerba aún más en trastornos metabólicos como la diabetes5. Los cambios estructurales y biomecánicos en el BM que dan lugar a su mayor rigidez se producen cuando sus componentes de la ECM, el colágeno IV y la laminina, se entrecruzan de forma no enzimática tras su exposición a productos finales de glicación avanzada (AGE).
El propósito del método descrito aquí fue establecer un modelo para la investigación de cómo la rigidez de la MO, debido a la exposición a AGE, promueve la invasividad de las células epiteliales de próstata (PEC) y de las células tumorales de próstata (PTC) en el contexto del cambio al cáncer de próstata metastásico (CaP). Para ello, se adaptó un método previo utilizado para generar acinos glandulares 3D a partir de células epiteliales mamarias (MEC) en geles rBM reconstituidos6 para incluir un paso adicional en el que los geles rBM se pretratan con glicolaldehído (GLA). Se describen varias técnicas para evaluar la reticulación y el endurecimiento inducidos por GLA de geles rBM pretratados, incluido el análisis fotométrico, la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS PAGE), la microscopía confocal y el análisis reométrico. Los tipos de células prostáticas seleccionadas para el cultivo en el rBM preendurecido incluyen: RWPE-1, PEC derivadas de una glándula prostática normal7; HPB-1, PECs derivadas de una glándula prostática afectada por HPB8; y PC3, PTCs metastásicos derivados de un tumor secundario localizado en el hueso vertebral de un paciente con cáncer de próstata (CaP)9. 
Además de avanzar en el estudio de la patología de la glándula prostática, el protocolo para el endurecimiento de los geles de rBM mediante su tratamiento con GLA se puede adaptar para investigar cómo la rigidez de la BM contribuye a otras patologías relacionadas con la edad y trastornos metabólicos. Por ejemplo, el modelo se puede aplicar directamente para investigar cómo el cáncer metastásico es inducido por la rigidez de la BM en órganos como la mama, el colon, el ovario y el páncreas mediante la incorporación de tipos de células apropiados. Además, el protocolo se puede adaptar para investigar cómo la BM rígida promueve los mecanismos biomecánicos de la progresión de la enfermedad en la enfermedad microvascular relacionada con la diabetes, la retinopatía, la nefropatía y la neuropatía.

<table><tbody><tr><td>I - Material para cultivo monocapa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1 Base de datos de</td><td>líneas celulares CaP</td><td>PCaCL-132</td><td>Contacto: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Medios completos sin suero de queratinocitos&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>No calentar a 37 &ordm; C antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Tienda en -20 &ordm; C en alícuotas</td></tr><tr><td>PC3&nbsp;</td><td>Colección de cultivos tipo americano</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina (Dulbecco A) comprimidos Oxoid</td><td></td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>cálido en 37 &ordm; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar RWPE-1&nbsp;</td><td>Colección de cultivos tipo americano</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>II - Material para la cultura 3D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de aminoguanidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel</td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara, 8 pocillos&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de cultivo membrana basal reconstituida (rBM) extracto de factor de crecimiento reducido&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>Tienda Membrana basal (BM) en -80 &ordm; C en alícuotas Bromuro de</td></tr><tr><td>cianógeno&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Tóxico por contacto, piel e inhalación</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de éster etílico de glicina (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Irritante para los ojos</td></tr><tr><td>Dímero de glicoalaldehído (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Altamente inflamable; Tóxico por contacto, piel e inhalación</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0,22 micras</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>III - Material para cuantificar la reacción de Maillard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>sensible a la luz y almacenar a -20 &ordm; C en alícuotas</td></tr><tr><td>Cilindros de clonación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>sensible a la luz</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>suero de cabra sensible a la luz</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Almacenar en -20 &ordm; C en alícuotas medios de</td></tr><tr><td>montaje Vectashield&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>clon de ratón anti-pentosidina PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Tienda en -20 &ordm; C en alícuotas</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-colágeno humano IV de conejo&nbsp; &nbsp;</td><td>Tienda de anticuerpos Acris</td><td>R1041</td><td>en -20 &ordm; C en alícuotas</td></tr><tr><td>Conejo anti-laminina A/C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>Tienda en -20 &ordm; C en alícuotas Éter</td></tr><tr><td>de terc-octilfenilo de polietilenglicol (Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Monolaurato de sorbitán de polietilenglicol (Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Casete de diálisis Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>IV - Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 reómetro rotacional de deformación controlada</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert S100 (aumento de 20X)</td> Cámara de incubación humidificada controlada por CO2 <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr> para <tr><td>microscopio Zeiss Axio S100</td><td>Microscopio Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Axiovert 200M (40X, 63X aumento) Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A equipado con una cámara digital con contraste de fase&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro lector de placas PHERAstar Plus</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>V - Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>Instituto Nacional de Salud, Vicios</td> moleculares MetaXpress de EE. UU<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>.<td></td><td></td></tr></tbody></table>

como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para estudiar el microambiente biofísica relacionada con un aumento del grosor y la rigidez de la membrana basal (BM) durante patologías relacionadas con la edad y trastornos metabólicos (por ejemplo, cáncer, diabetes, enfermedad microvascular, retinopatía, nefropatía y neuropatía) . La premisa de este modelo es la reticulación no enzimática de la matriz BM reconstituido (GBR) por tratamiento con glicolaldehıdo (GLA) para promover el producto final de glicación avanzada generación (AGE) a través de la reacción de Maillard. Ejemplos de técnicas de laboratorio que se pueden utilizar para confirmar la generación de AGE, la reticulación no enzimática y mayor rigidez en GLA tratados RBM se describen. Estos incluyen la preparación de la GBR nativa (tratado con solución salina tamponada con fosfato, PBS) y rígido RBM (tratados con GLA) para la determinación de: su contenido de AGE por análisis fotométrico y microscopía de inmunofluorescencia, su no-enzimática por reticulación de sodio poliacrilamida dodecilsulfatoelectroforesis en gel (SDS PAGE), así como la microscopía confocal, y su aumento de la rigidez usando reometría. El procedimiento descrito aquí se puede utilizar para aumentar la rigidez (módulos de elasticidad, E) de la GBR hasta 3,2 veces, de acuerdo con las mediciones realizadas en sanos frente a tejido de la próstata humano enfermo. Para recrear el microambiente biofísica asociada con el envejecimiento y la glándula próstata enferma tres tipos de células de la próstata se introdujeron en la GBR nativa y rígido RBM: RWPE-1, las células epiteliales de la próstata (PEC) derivada de una glándula de la próstata normal; BPH-1, los PEC derivados de una glándula de la próstata afectados por hiperplasia prostática benigna (BPH); y PC3, células metastásicas derivan de un tumor óseo secundario procedente de cáncer de próstata. Múltiples parámetros pueden ser medidos, incluyendo el tamaño, forma y características invasoras de los acinos glandulares 3D formado por RWPE-1 y la HBP-1 sobre los nativos frente rígida RBM, y la longitud de celda promedio, la velocidad migratoria y la persistencia del movimiento de las células de spher 3Doids formados por células PC3 en las mismas condiciones. vías y la localización subcelular de las proteínas de señalización celular también se puede evaluar.

3D de próstata cultivadas en Acini rígido RBM Después de 6 días de cultivo, los PEC derivadas de tejido normal de la próstata (RWPE-1) (Figura 1A) y tejido de BPH (HPB-1) (Figura 1B) forma acinos en nativo (tratados con PBS) RBM que se organiza en esferoides uniformes de epitelio Células. Estos acinos también tienen las características de los PEC altamente organizados con el espacio-apical-basal de polaridad y una luminal visibles 13,20. El acinos formado por los PEC derivados de tejido de la próstata normal (RWPE-1) (Figura 1A) y el tejido BPH (BPH-1) (Figura 1B) en rigidizadas RBM (-AGE rico) (tratado con GLA) tener una arquitectura interrumpido (desplazando desde esferoidal de forma poligonal y las células que sobresale / migración de los acinos a la era rica en RBM) (Figura 1A). Estas<html> acinos se caracterizan también por los PEC altamente desorganizado que han perdido su polaridad apical-to basal con una pequeña o inexistente espacio luminal 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figura 1:. Próstata células epiteliales cultivadas como 3D glandular Acini en la membrana reconstituido sótano nativo y rígido (GBR) (A) Imágenes de campo claro de células RWPE-1 se cultivaron durante 12 horas hasta 6 días en geles de RBM tratados con PBS (nativo) o glicolaldehıdo 50 mM durante 14 horas (AGE-rica; rígida); Barra de escala = 50 micras. (B) células de HPB-1, que se cultiva como se describe en el panel A; Barras de escala = 50 m; los datos son representativos de 3 experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> Tabla 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tabla 1:. Características de próstata epitelial RWPE-1 acinos Cultivado en las Nativo, semi-rígido y rígido membrana reconstituido sótano (RBM) RWPE-1 acinos se cultivaron en RBM pre-tratados con PBS durante 14 horas (nativo), glicolaldehıdo (GLA ) durante 6 horas (semi-rígido) o GLA durante 14 horas (rígida). Por forma acinar, el porcentaje (%) ± desviación estándar (SD) de vuelta, acinos semi-poligonal y poligonal se calcularon a partir de 5 experimentos independientes (50 acinos cuantificaron por condición). acinar tamaño relativo se calculó (RBM nativa = 100%) de 3 experimentos independientes. Para invasividad,% ± SD acinos con una o más células que sobresalen se calcula a partir de 3 experimentos independientes. factor de cambio se calcula dividiendo el valor medio obtenido en condiciones semi-rígidas o rígidas por el valor correspondiente para condiciones nativas. Los valores de p calculados utilizando la prueba t de Student (α = 0,05). ontenido &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; dependen de la edad mayor rigidez RBM promueve la migración de células tumorales de próstata PC3 Células PC3 cultivadas en RBM nativa migran al mantener contacto célula-célula continua, mientras que las células PC3 cultivadas en AGE-rica (rígida) RBM se mueven independientemente uno del otro (Figura 2A). Después de 72 horas en cultivo de células PC3 formar focos (esferoides) el nativo (tratados con PBS) GBR, mientras que las células PC3 sobre rígida RBM (EDAD-rica) No de esferoides y migrar de forma independiente (Figura 2B). Células PC3 sobre la RBM (EDAD-rica) rígidas son más alargada que las células PC3 cultivadas en RBM nativa (Figura 2C). En células PC3 rígida RBM migran más rápidamente que las células PC3 cultivadas en RBM nativa (Figura 2D). En células PC3 rígida RBM muestran una disminución de la persistencia en comparación con las células PC3 cultivadas en RBM nativa (Figura 2E). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2:. La migración de próstata de células tumorales en la membrana reconstituido sótano nativo y rígido (GBR) (A) Imágenes de campo claro de células PC3 cultivadas en geles de RBM tratados con PBS (nativo) o glicolaldehıdo 50 mM durante 14 horas (AGE-rica, rígido) . Las células fueron imágenes utilizando un microscopio de campo claro (objetivo 10X) y una tasa de adquisición de imagen 1 por hora durante 12 horas seguido de la célula de seguimiento para generar trayectorias. Imágenes mostrados corresponden a los puntos de tiempo después de 0, 3, 6, 9 y 12 hr. Trayectorias de células individuales se muestran para el punto de tiempo 12 horas. Barra de escala = 100 micras. Células (B) PC3 cultivadas en RBM nativa o rígido durante 72 horas, y la imagen como se describe en el panel (A). Barra de escala = 100 micras. Detalle muestra el área asignada a la ampliación de 2x. (C) Media ± SD longitud de la célula (m); diferencia significativa entre la GBR nativa y rígido RBM (p = 1,2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) Media ± SD de velocidad (m / h) calculada a partir de las trayectorias de células; diferencia significativa entre la GBR nativa y rígido RBM (p = 0,004). (E) Media ± SD persistencia del movimiento de las células (relación D / T, donde D = distancia desde el principio hasta el final de la trayectoria celular, T = longitud total de la trayectoria celular); diferencia significativa entre la GBR nativa y rígido RBM (p = 0,0007). Para los paneles se analizaron CE&gt; 10 células, los datos son representativos de 3 experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se explica un protocolo para modelar el microambiente biofísico donde la reticulación y el aumento de la rigidez de la membrana basal (BM) inducida por productos finales de glicación avanzada (AGEs) tiene relevancia patológica.

Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

El objetivo general de este modelo es investigar cómo la rigidez y el grosor de la membrana basal, provocados por la glicosilación avanzada y la exposición a productos, pueden modular el comportamiento invasivo de las células correspondientes a las etapas temprana y avanzada del cáncer de próstata metastásico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las patologías relacionadas con la edad, como la manera en que el aumento de la rigidez y el grosor de la membrana basal contribuye a la progresión del cáncer y también a trastornos metabólicos como la diabetes.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método sencillo para imitar el nivel de rigidez medido en tumores prostáticos humanos en el entorno clínico. La implicación de esta técnica se extiende a nuestro tratamiento y diagnóstico del cáncer de próstata, al mejorar nuestra comprensión de cómo la rigidez de la membrana basal promueve cambios moleculares y celulares. Las personas nuevas en este método podrían tener dificultades, ya que el modelo es multidisciplinario.Combinación de técnicas provenientes de los campos de la química, la física y la biología. Tuvimos la idea de este método cuando planteamos la hipótesis de que la rigidez de la membrana basal en la glándula prostática puede promover un comportamiento invasivo de novo en células epiteliales transformadas conocidas. La demostración en video de este método es fundamental, porque es necesario describir los pasos interdisciplinarios.Incluya la reticulación de la membrana basal, seguida de cultivo celular en 3D. Comience preparando una superficie uniforme de hielo y utilícela para enfriar una placa de vidrio con ocho pocillos a cuatro grados Celsius. Luego, corte el extremo de una punta de pipeta de 200 microlitros y enfríe también la punta a cuatro grados Celsius.Una vez enfriado, coloque la punta en un dispositivo de pipeteo de capacidad de 200 microlitros. Y utilícelo para transferir 40 microlitros de solución de matriz BM fría con hielo a cada pocillo de la placa de vidrio con cámara de ocho pocillos enfriada. A continuación, coloque la placa con cámara a 37 grados Celsius durante 30 minutos para favorecer la polimerización de la membrana basal.Cierre la puerta del incubador con mucho cuidado para evitar perturbar la membrana basal reconstituida líquida. Después de exactamente 30 minutos, agregue 250 microlitros de una solución preparada de glicolaldehído para cubrir la membrana basal reconstituida polimerizada. A continuación, prepare un control negativo agregando 250 microlitros de PDS estéril a un gel nativo de membrana basal reconstituida.Además, prepare dos controles adicionales agregando ya sea cianoborohidruro de sodio 50 milimolar o aminoguanidina 250 milimolar a la solución de glicolaldehído antes de añadirla al gel de membrana basal. Luego, incube los geles a 37 grados Celsius durante seis horas para producir un gel semirrígido. O durante 14 horas para producir un gel rígido.Tras la incubación, retire cuidadosamente las soluciones de los geles y añada 250 microlitros de glicina etil éster uno molar a cada gel. Incube a 37 grados celsius durante una hora. Lave cada gel 10 veces con 500 microlitros de PBS para eliminar todos los rastros de la solución de glicolaldehído y del glicina etil éster.Luego, agregue 400 microlitros de PBS para prevenir la deshidratación e incube los geles de membrana basal reconstituidos durante la noche a 37 grados Celsius. Cuando esté listo para continuar, retire el PBS de los geles de membrana basal reconstituidos y agregue 250 microlitros de agua fría con hielo, doblemente destilada, a cada pocillo. Incube los geles a cuatro grados Celsius durante 16 a 24 horas para asegurar que la matriz se haya licuado completamente.Luego, transfiera la membrana basal licuada a un tubo de 1,5 mililitros y mida la emisión fluorescente de la solución utilizando un espectrofotómetro. A continuación, centrifugue la solución y elimine el sobrenadante resultante. Re-suspenda el precipitado en 500 microlitros de una solución que contiene 20 miligramos por mililitro de bromuro de cianógeno y ácido fórmico al 70%.Incube las muestras durante toda la noche a temperatura ambiente. A continuación, utilice una jeringa desechable de un mililitro para transferir el gel de membrana basal re-suspendido a una cinta de diálisis con un límite de peso molecular de 3,5 kilodaltons. Sumerja la cinta en un vaso de precipitados de vidrio de 500 mililitros que contenga 500 mililitros de agua doblemente destilada.Y agite el agua con una barra magnética de agitación. Deje este montaje durante la noche a cuatro grados Celsius para eliminar todos los rastros de bromuro de cianógeno y ácido fórmico. Utilice una jeringa desechable de un mililitro para transferir la solución dializada desde el casete a un tubo de 1,5 mililitros.Luego analice la solución realizando una electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12%. Tiña el gel con tinción de plata para visualizar el patrón electroforético de los péptidos matriciales de bromuro de cianógeno. A partir de los geles de membrana basal cubiertos con PBS, enjuague los geles dos veces más con 300 microlitros de PBS que contengan 0,1 milimoles de cloruro de calcio.Y 0,5 milimoles de cloruro de magnesio durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, retire el PBS y agregue 300 microlitros de paraformaldehído al 4% para cubrir cada gel de membrana basal reconstituida.Incube los geles durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar los componentes de la membrana basal reconstituida. A continuación, elimine el fijador y agregue 300 microlitros de una solución de bloqueo que contiene 75 milimoles de cloruro de amonio y 0,5 milimoles de cloruro de magnesio. Incube la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego elimine la solución y repita el lavado otras cuatro veces.Después del último lavado, agregue 300 microlitros de tampón de inmunofluorescencia a los geles de membrana basal reconstituidos para prevenir reacciones inespecíficas. Incube los geles en la solución durante dos horas a temperatura ambiente en una plataforma agitadora. Luego, elimine el tampón bloqueador de inmunofluorescencia.Añada 300 microlitros de anticuerpo primario diluido en el tampón de bloqueo. Incube los geles de membrana basal reconstituidos a cuatro grados Celsius durante 16 horas. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario y lave los geles tres veces con 300 microlitros de tampón de inmunofluorescencia.Agite los geles a temperatura ambiente en una plataforma agitadora durante 10 minutos después de cada adición de tampón. Luego, elimine el tampón y agregue 300 microlitros del anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, diluido en el tampón de bloqueo. Coloque las muestras en una plataforma agitadora e incube los geles durante dos horas a temperatura ambiente.Elimine el anticuerpo secundario. Lave la muestra con un tampón de inmunofluorescencia, seguido de PBS, y luego fije y bloquee las muestras por segunda vez. Finalmente, monte los geles y utilice un microscopio para analizar la formación de haces densos.Para formar acinos de la glándula prostática, diluya 5.000 células RWPE-1 en 300 microlitros de KSFM completo, suplementado con 2% de la solución de membrana basal. Para los agregados de células tumorales de próstata, diluya 2.500 células PC3 en 300 microlitros de medio de cultivo RPMI-1640, suplementado con 2% de la solución de membrana basal. Tras la incubación nocturna de los geles de membrana basal reconstituidos en PBS, enjuáguelos dos veces con 500 microlitros de medio de cultivo.Antes de sembrar las células. Siembre suavemente las células sobre las membranas basales reconstituidas nativas y endurecidas por productos finales de glicación avanzada. Y coloque cuidadosamente los cultivos en una incubadora para asegurar una distribución uniforme de acinos y esferoides en crecimiento.Para las células que forman acinos, cambie el medio cada dos días por medio de cultivo fresco, que contenga 2% de la solución de membrana basal. Para asegurar que las células dispongan de los factores de crecimiento necesarios para la homeostasis normal de los acinos. Después de seis días en cultivo, las células epiteliales prostáticas forman acinos sobre la membrana basal reconstituida nativa.Y están organizados en esferoides uniformes de células epiteliales. Estos acinos también presentan las características de células epiteliales polarizadas altamente organizadas, con polaridad apical a basal y un espacio luminal visible. Cuando se cultivan durante seis días en la membrana endurecida, las células presentan una arquitectura alterada.y cambian de forma esferoidal a poligonal. Además, estos acinos están altamente desorganizados y han perdido su polaridad apical a basal, con un espacio luminal pequeño o inexistente.Esto también es cierto para las células derivadas de una glándula prostática afectada por hiperplasia prostática benigna. Cuando se midieron las células tumorales de la próstata, se observó que eran más alargadas sobre la membrana basal reconstituida rígida, y que además migraban más rápidamente y presentaban una mayor persistencia celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modelar los efectos de la rigidez de la membrana basal sobre el comportamiento de las células epiteliales y tumorales.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se debe inducir el nivel deseado de rigidez de la membrana basal y que los acinos individuales o esferoides s deben formarse adecuadamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la inducción de la invasión de células cancerosas por la rigidez de la membrana basal en la glándula prostática. Tras seguir este protocolo, se pueden realizar otros métodos, como el inmunoblot de lisado celular, para responder preguntas adicionales relacionadas con la vía de señalización modulada por la rigidez de la membrana basal.No olvide que trabajar con cianoborohidruro de sodio, bromuro de cianógeno y ácido fórmico puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar una bata de laboratorio, guantes, protector facial y un respirador mientras se trabaja en la campana extractora durante este procedimiento.

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El efecto de la rigidez del sustrato en la función celular puede ser...

El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

Aquí se describe un método sencillo y rápido para medir la rigidez de la célula. El principio general de este enfoque consiste en medir la deformación de la membrana en respuesta a la bien definida la presión negativa aplicada a través de una micropipeta a la superficie celular. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biomecánicas de los adjuntos sustrato células.

Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

Presentamos protocolos detallados para el aislamiento de aortas de ratones y la medición de su módulo elástico utilizando microscopía de fuerza atómica.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Aquí se presenta el protocolo de la técnica Conpokal, que combina la microscopía de fuerza confocal y atómica en una sola plataforma de instrumento. Conpokal proporciona la misma célula, misma región, cerca de imágenes confocales simultáneas y caracterización mecánica de muestras biológicas vivas.

Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

Recientemente identificamos el endurecimiento capilar de la retina como un nuevo paradigma para la disfunción retiniana asociada con la diabetes. Este protocolo detalla los pasos para el aislamiento de los capilares de la retina del ratón y la matriz subendotelial de los cultivos endoteliales de la retina, seguido de una descripción de la técnica de medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica.

Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica

Este protocolo visualiza cómo preparar criosecciones de tejido pulmonar murino, realizar experimentos de mapas de fuerza de microscopía de fuerza atómica y analizar los datos para determinar el módulo de Young de la membrana basal pulmonar murina nativa.

Extracción del módulo de Young de las membranas basales pulmonares murinos nativas de los mapas de fuerza derivados de la microscopía de fuerza atómica

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Aprende a modelar la rigidez de la membrana basal para estudiar la invasión celular en cáncer de próstata metastásico. Este protocolo integra química, física y biología para replicar condiciones tumorales reales.

Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas (Video) | JoVE Journal

Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas

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