Name: A Novel Behavioral Ensayo para investigar las respuestas gustativas de individual, libre de movimiento abejorros ( Bombus terrestris) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprende a evaluar la sensibilidad gustativa en abejorros Bombus terrestris mediante un ensayo conductual novedoso. Este método mide respuestas de alimentación detalladas y detecta nutrientes y toxinas en solución.

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Este trabajo fue financiado por la subvención Leverhulme Trust (RPG-2012-708) y una subvención BBSRC (BB / M00709X / 1) de la VAG.

1. La captura de abejas de la colonia y el período de hambre Nota: Los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo en la Universidad de Newcastle, Reino Unido con Bombus terrestris audax. Múltiples (2-3) comercialmente adquirida colonias fueron utilizados por tratamiento. Las colonias se han mantenido en un banco en condiciones de laboratorio (25 ± 2 ° C y 28 ± 2% de humedad relativa) en constante oscuridad y se alimentaron con miel de abeja recolectada soluciones de azúcar polen y ad libitum. <ol><li> Recoger trabajador individual abejorros utilizando un vial de plástico (7 cm de largo, 2,8 cm de diámetro interior) con un tapón de plástico perforada, después de haber abierto la puerta a la colonia sólo el tiempo suficiente para una abeja para salir y ser atrapado. </li><li> Antes del experimento, mata de hambre de forma individual todos los abejorros durante 2-4 horas en los viales de plástico y mantenerlo a temperatura ambiente en la oscuridad completa. </li></ol> 2. La transferencia de las abejas en los tubos de mantenimiento y el HFase abituation <ol><li> Después del período de inanición, transferir un abejorro directamente del vial de plástico en un tubo de retención. El tubo de mantenimiento está a 15 ml tubo de centrífuga modificada (longitud: 119 mm; diámetro 17 mm), con un agujero de 4 mm perforado en la punta y una pieza de malla de acero (base: 8 mm; altura 30 mm) fijada en el interior por la fusión el plástico del tubo con una aguja de acero de disección climatizada. </li><li> Fijar el tubo de retención que contiene el abejorro sobre un soporte de poliestireno con cera dental. Fijar dos piezas de cartón en cada lado de la tubo de retención. Esto es para proteger a la abeja de los estímulos visuales que podrían interferir con el experimento. </li><li> Posicionar una cámara microscópica digital de 5 cm por encima de la punta del tubo de retención y conectar la cámara a un ordenador portátil. </li><li> Ajuste el tubo de retención para que al menos los primeros 18 mm de la punta del tubo de retención está dentro del marco de vídeo. Antes del experimento, iniciar el periodo de habituación 3 min. </li></ol> 3.Fase previa a la prueba: Presentación de una gota de sacarosa <ol><li> Conectar una jeringa a un adaptador hembra que contiene una gota de solución de sacarosa (~ 3,5 l, sacarosa 500 mM disuelto en agua desionizada). Presentar la sacarosa dentro de la punta del tubo de retención para motivar a la extensión de la trompa. </li><li> Dar el abejorro hasta 5 minutos para consumir la gota de sacarosa. Si la gota no se consume, retire el abejorro del experimento. </li><li> Empezar a grabar el vídeo después del periodo de habituación. En este estudio, la actividad trompa se registró a 26,7 cuadros / seg-1 con una tasa de aumento 25X. </li></ol> 4. Fase de prueba: Presentación de la solución de prueba <ol><li> Llenar un tubo capilar se 100 l con la solución de prueba. Conectarlo a un pedazo de tubo de silicona (6 cm de longitud, 1 mm de diámetro interior) y fijarlo a un manipulador micro. <ol><li> Conecte el tubo a través de un adaptador macho a otro tubo de silicona (6 cm de longitud, 4 mm de diámetro interno), WHIch actúa como una bombilla de pipeta. </li><li> Coloque el tubo capilar se 5-10 mm de la punta del tubo de retención. Apriete suavemente el tubo para mantener la solución de alimentación en la punta del tubo capilar se. </li></ol></li><li> Tras el abejorro consume la gota de sacarosa, retire inmediatamente la jeringa que contiene la solución de sacarosa 500 mM. </li><li> Comenzará la fase de prueba de 2 minutos cuando probóscide contactos de la abeja del manosear la solución en el interior del tubo capilar se. <ol><li> Para controlar la posible evaporación, llenar dos tubos adicionales microcapillary con sacarosa o agua y manipularla exactamente como durante la fase de prueba. </li></ol></li><li> Antes y después de cada ensayo escanear los niveles de líquido dentro del tubo microcapilar usando un escáner en 600 dpi para medir la cantidad de alimento consumido (Figura 4A). </li></ol> 5. Los análisis de imagen <ol><li> Determinar el volumen de consumo de solución usando ImageJ (versión 1.48), una imagen processing software. <ol><li> Sube el archivo de imagen y el zoom en la imagen (~ 400%). Para ajustar la escala de referencia, seleccionar la herramienta de línea recta y trazar una línea entre los dos extremos del tubo capilar se. Seleccione &quot;Analizar&quot; y luego &quot;Escala de Ajuste &#39;. Entrada de la longitud total del tubo en &quot;distancia conocida &#39;y la unidad correspondiente en virtud de la&quot; unidad de longitud &quot;. </li><li> Seleccione la herramienta de línea recta de nuevo y trazar una línea entre los dos extremos del nivel del líquido. Seleccione &quot;Analizar&quot; y luego &quot;Medir&quot;. En la ventana de resultados de la longitud del líquido se da en la columna &quot;longitud&quot;. </li></ol></li><li> Calcular el volumen de consumo de solución mediante el uso de la fórmula: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq1.jpg" /> dónde <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq2.jpg" /> es la longitud del tubo microcapilar y <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq3.jpg" /> y <img alt= &quot;Ecuación 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54233 / 54233eq4.jpg&quot; /&gt; son las longitudes medidas del líquido dentro del tubo capilar se antes y después de la fase de prueba, respectivamente. </li></ol> 6. Los análisis de vídeo <ol><li> Puntuación de los comportamientos de alimentación durante la fase de prueba de 2 minutos de cada vídeo usando un software de registro de eventos (Ver Tabla de Materiales). <ol><li> En primer lugar, definir los comportamientos de alimentación (es decir, los elementos.) En el menú de clases de comportamiento del software de grabación. Los comportamientos de alimentación son como sigue: (1) probóscide fuera / contacto: la proboscis se extiende y está en contacto con la solución dentro del tubo microcapilar (2) probóscide fuera / no contacto: la proboscis se extiende y no está en contacto con la solución dentro del tubo microcapilar, (3) trompa estibados: la trompa no se extiende sino protegidos por debajo de la cabeza y (4) fuera de la vista: el abejorro está fuera del marco de vídeo. </li><li> Ajuste cada comportamientocomo un &quot;Estado&quot; y &quot;mutuamente excluyentes&quot; en el menú de propiedades y hacer grabaciones continuas para un intervalo de 2 minutos. Reproducir los vídeos en el modo de cámara lenta (2 veces más lento) para mayor precisión. </li></ol></li><li> Medir la velocidad de retracción proboscis de la solución de prueba después del primer contacto entre dos tramas consecutivas (separadas por 37,5 mseg en las grabaciones de vídeo que se muestran aquí) utilizando un software de vídeo de seguimiento de movimiento (Ver Tabla de Materiales). <ol><li> Sube el archivo de vídeo y saltar al cuadro donde la trompa primeros contactos la solución. </li><li> Para ajustar la escala de referencia, seleccionar la herramienta de línea y dibujar una línea en la anchura del tubo capilar se dentro de la imagen. Haga clic derecho en la línea y seleccione &#39;Calibrar medida&#39;. Introducir la anchura del tubo capilar y la unidad correspondiente. </li><li> Seleccione &quot;Imagen&quot; y luego &quot;origen de coordenadas del sistema &#39;. En la nueva ventana, haga clic en la punta de la trompa y seleccione9; Aplicar &#39;. </li><li> Seleccione la herramienta de mano moverse, haga clic derecho en la punta de la trompa en el marco de vídeo y seleccione &#39;Ruta Vía&#39;. Pasar al siguiente fotograma y reajustar el punto de seguimiento hasta la punta de la trompa. </li></ol></li><li> Haga clic derecho en el punto de seguimiento y seleccione &quot;Configuración&quot;. Seleccione &#39;Ruta Completa&#39; y seleccione &#39;Speed&#39; que se está midiendo. Seleccione &#39;Aplicar&#39;. Aparece entonces la velocidad. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Con este ensayo conductual novela, se muestra la quinina para disuadir la alimentación de la abeja del manosear piel de ante-atado. El tiempo de contacto trompa reducida y la frecuencia de alimentación pelea con el agua o la solución de sacarosa mezclada con la quinina se interpreta aquí como un rechazo para iniciar la alimentación aún más en las soluciones no nutritivos o potencialmente tóxicas. Cuando se añade a la solución de quinina 1 M de sacarosa, abejorros no sólo reducen el volumen de solución que consumen, que también se retraen la trompa más rápido, reduciendo así el tiempo de contacto entre las partes de la boca y la solución que contiene una toxina. En conjunto, estos resultados sugieren que la quinina es percibido por las células receptoras gustativas sobre las partes de la boca de la abeja del manosear, como ya se ha identificado previamente en la abeja de la miel 9. La quinina es una toxina para insectos que induce un comportamiento similar al malestar en la abeja de la miel 10 y caída en el mosquito de la malaria (Anopheles gambiae) 23. Este ensayo también podría conducir a la Identificadoión de algunos compuestos de disuasión y potencialmente tóxicos que son percibidos por las células receptoras del gusto de las piezas bucales en los abejorros. Es crucial para el tubo microcapilar para ser llenado con un volumen suficiente de solución de prueba para durar a lo largo de la fase de prueba. Se recomienda que al menos alrededor de tres cuartas partes del tubo microcapilar (por ejemplo, 70 a 80 l) se llena. Sin embargo, se debe tener cuidado para no llenar completamente el tubo microcapilar para reducir el riesgo de vertido durante el proceso de escaneo y de fijar el tubo microcapilar para el aparato experimental. También se debe tener cuidado cuando se presenta la gotita mM sacarosa 500 y el abejorro, de modo que el experimentador Evita fugas de la gota en el tubo de retención. El agujero de 4 mm en la punta del tubo de retención es lo suficientemente grande para un trabajador adulto de abejorros para extender de forma natural su trompa hacia la solución de ensayo. Sin embargo, es posible queabejorros pueden probar la solución con sus antenas antes de extender sus probóscides. Esto podría afectar a la probabilidad de extensión trompa como PER podría ser obtenido en abejorros mediante la estimulación de sus antenas con una solución de azúcar 15. De hecho las antenas de himenópteros como la avispa parasitoide (Trissolcus brochymenae) 24 o la miel de abeja 13 están equipados con sensilla gusto, lo que les permite degustar los azúcares y las toxinas como la quinina. En consecuencia, las antenas contactos iniciales con soluciones que contienen compuestos altamente disuasivos como la quinina también podría reducir la motivación de un abejorro para extender su probóscide y por lo tanto afectar la tasa de éxito experimental. Aunque el contacto antenal con la solución de prueba no puede ser controlado, en el presente estudio no se encontró ningún efecto significativo de contacto antenal en la extensión trompa hacia la solución de ensayo. En este ensayo, inmediatamente la configuración del tubo capilar se después de la fase previa a la prueba wgallina antenas a los abejorros &#39;están todavía dentro del tubo de retención pueden reducir la posibilidad de que los abejorros al gusto la solución problema con sus antenas. La principal limitación de este ensayo se plantea cuando el seguimiento de la retracción trompa lejos de la solución de prueba después del primer contacto trompa usando el software de seguimiento de movimiento de vídeo. Las secuencias de vídeo sólo muestra el movimiento 2D de la trompa, por lo que la salida dada de la medición de la velocidad puede ser menor o mayor estimada. Sin embargo, con algunas modificaciones, este aspecto del ensayo podría mejorarse. Este ensayo se puede utilizar para observar las respuestas naturales de alimentación hacia soluciones que contienen diferentes compuestos que incluyen metabolitos secundarios de plantas naturales que se producen. La observación de las respuestas inmediatas de alimentación con este ensayo proporciona información detallada acerca de cómo los abejorros detectan estos compuestos. Esto es ventajoso sobre existente &quot;pasa-no pasa &#39;métodos como el PER 18,19 </sup&gt; Y más de dos ensayos de elección 7 ya que este método produce una serie de medidas de respuesta del comportamiento, incluyendo el consumo de alimentos durante un combate de alimentación discreta. La medición de varios parámetros simultáneamente permite una mejor evaluación de la palatabilidad de un compuesto. Por ejemplo, en nuestro ensayo, abejorros evitar el consumo de agua o la solución de sacarosa mezclada con la quinina. La retracción de la trompa puede ser causado por un cambio en las respuestas de las células receptoras de azúcar 12,13. Nuestro ensayo muestra que los abejorros se retraen la trompa más rápido después de poner en contacto la solución de sacarosa más quinina que el agua sola; Esto podría sugerir que la quinina afecta a un conjunto distinto de neuronas, además de la inhibición de las neuronas de detección de azúcar 9,12,13,25. Nuestro ensayo permite el análisis del patrón temporal de las respuestas de comportamiento durante la alimentación. Un protocolo similar en el que se mide el tiempo de consumo y el número de episodios tiene allistos sido implementados para evaluar la respuesta de alimentación de Drosophila a los azúcares nutritivos y no nutritivos 26. Nuestra predicción es que las abejas presentan una respuesta más fiable de estimulantes de la alimentación en nuestro ensayo que en otros métodos tales como PER porque las abejas son libres de moverse en el tubo de retención 21. Esta técnica permitirá un análisis exhaustivo de los umbrales del gusto por los nutrientes y toxinas para iluminar los mecanismos de alimentación en abejorros y potencialmente otras especies de abejas.

las interacciones planta-polinizador son complejas. Polinizadores visitan las flores para obtener el néctar y el polen como alimento; a su vez, los polinizadores facilitan la reproducción sexual en las plantas. Si bien esta relación es principalmente mutualista, néctar de flores y polen a veces contienen toxinas o compuestos de otra planta 1-5 que puede dañar a los polinizadores. La racionalidad ecológica para la presencia de estos compuestos en el néctar y el polen no está claro en todos los entornos. Una cuestión pendiente en este campo es como polinizadores como las abejas pueden detectar y evitar las flores con néctar que contiene toxinas. Las especies de abejorros Bombus terrestris, (Linnaeus, 1758), es un polinizador generalista que visita las flores de muchas especies de plantas incluidas las que producen el néctar que contiene toxinas 6. Abejorros se han demostrado para evitar soluciones que consumen contienen altas concentraciones de toxinas en un ensayo de 24 hr de dos elección 7. Este ensayodel consumo de alimentos descrito por Tiedeken et al. 7 revelaron que las abejas pueden detectar compuestos amargos en soluciones. Sin embargo, este ensayo fue incapaz de distinguir el sabor de los procesos de post-ingestivas como malestar general, que también podría afectar el comportamiento de alimentación durante este tiempo de intervalo 8-10. Las abejas poseen sensilla gustativa en sus antenas, piezas bucales y tarsos para detectar compuestos 11-13. El reflejo de extensión probóscide (PER) experimentos implican restringir las abejas individuales en un arnés y luego la estimulación antenal sensilla de la abeja para producir la alimentación reflejo 14-17. Las abejas pueden estar sujetos mediante arneses individuales y luego estimulados para producir el reflejo de la alimentación como un ensayo de su capacidad de probar compuestos 18,19. Otros han modificado el ensayo PER para estudiar la sensibilidad de las antenas o partes de la boca a las toxinas 9,20. Sin embargo, las abejas son sometidos a estrés durante el aprovechamiento. Esto podría afectar la formaresponden a los compuestos 21. Aquí, un nuevo ensayo se describe para evaluar la respuesta al gusto del comportamiento de libertad de movimiento de los abejorros a la sacarosa y la quinina, un alcaloide que ha sido previamente informado para ser disuasivo 9 y tóxico 10 para las abejas melíferas (Apis mellifera) y abejorros (Bombus terrestris) 7, 22. A pesar de que la quinina no se ha encontrado en el néctar de las plantas, este alcaloide se utiliza a menudo como un estímulo aversivo en estudios fisiológicos y de comportamiento en las abejas 7,9,12,13,22. El método consiste en la grabación de partes de la boca a los abejorros el vídeo con gran resolución durante el contacto inicial trompa con las soluciones de ensayo. Específicamente, la estructura fina de la respuesta de alimentación se examina al anotar continuamente comportamiento durante un intervalo de 2 min. El volumen de la solución consumida se mide durante el período de alimentación y por lo que la cantidad de alimentos ingeridos se puede correlacionar con la microestructura deel comportamiento de alimentación. También se mide la velocidad de la retracción proboscis, como un indicador de una evitación activa, y por lo tanto la detección pre-ingestiva.

<table><tbody><tr><td>Colonias de abejorros</td><td>Koppert Biological Systems</td><td></td><td>NATUPOL Colmena</td></tr><tr><td>Cámara microscópica digital&nbsp;</td><td>Dino-lite Europe AM4815ZT</td><td></td><td>Dino-Lite Edge&nbsp;</td></tr><tr><td>100 &mu; l tubo microcapilar &nbsp;</td><td>Blaubrand IntraEND</td><td>709144</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centifuge de polipropileno de 15 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849650</td><td></td></tr><tr><td>1 ml jeringa deslizante de plástico desechable</td><td>Luer BD 300013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dell Latitude 3550</td><td>portátil Dell</td><td></td><td>Compruebe la compatibilidad con el software de vídeo&nbsp;</td></tr><tr><td>Canon CanoScan LiDE 120</td><td>Canon</td><td></td><td>Compruebe la compatibilidad con el ordenador/portátil</td></tr><tr><td>Software Observer versión 5.0.25</td><td>Software Noldus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinovea versión 0.8.15</td><td>Kinovea&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo de silicona</td><td></td><td></td><td>6&nbsp; cm de longitud, 1&nbsp; mm en el interior &Oslash; & 6&nbsp; cm de longitud, 4&nbsp; mm en el interior &Oslash;</td></tr><tr><td>Manguera estándar macho de polipropileno de púas de 1/16"</td><td>adaptador Cole-Parmer</td><td>TW-45518-22</td><td></td></tr><tr><td>Luer hembra x manguera estándar de 1/16" adaptador de polipropileno de púas</td><td>Cole-Palmer</td><td>TW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Malla de acero&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tamaño de malla de 0,5 mm</td></tr><tr><td>Sacarosa (grado II)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de quinina dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q1125</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ versión de software 1.48</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel behavioral ensayo para investigar las respuestas gustativas de individual, libre de movimiento abejorros (<em&gt; bombus terrestris</em&gt;)

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Polinizadores generalistas como el abejorro piel de ante-atado, Bombus terrestris, se encuentran con ambos nutrientes y toxinas en el néctar de flores que recogen de plantas con flores. Sólo unos pocos estudios han descrito las respuestas gustativas de abejas hacia toxinas en los alimentos, y estos experimentos han utilizado principalmente la respuesta de extensión probóscide de las abejas melíferas restringidas. Aquí, un nuevo ensayo de conducta se presenta para medir las respuestas de alimentación de libertad de movimiento, trabajador individual abejorros a los nutrientes y toxinas. Este ensayo mide la cantidad de solución ingerida por cada uno de abejorros e identifica cómo estimulantes del gusto en los alimentos influyen en la microestructura del comportamiento alimentario. Las soluciones se presentan en un tubo microcapilar de abejorros individuales que han sido hambre anteriormente para 2-4 hr. El comportamiento es capturado en el vídeo digital. La estructura fina de la conducta de alimentación se analiza al anotar continuamente la posición de la probo(LIC) partes de la boca de grabaciones de vídeo que utilizan el software de registro de eventos. La posición de la trompa está definido por tres categorías diferentes de comportamiento: se amplía (1) trompa y en contacto con la solución, (2) trompa se extiende pero no en contacto con la solución y (3) trompa se guarda debajo de la cabeza. Además también se estima la velocidad de la trompa de retracción lejos de la solución. En el presente ensayo, el volumen de la solución consumida, el número de episodios de alimentación, la duración de los episodios de alimentación y la velocidad de la retracción proboscis después del primer contacto se utiliza para evaluar la actividad de la disuasión de los compuestos ensayados phagostimulatory o. Este nuevo ensayo de sabor permitirá a los investigadores medir cómo los compuestos que se encuentran en el néctar influyen en el comportamiento de alimentación de las abejas y también serán útiles para los biólogos, toxicólogos y polinización neuroethologists estudian sistema del gusto del abejorro.

El nuevo ensayo se utiliza para probar las respuestas de alimentación a 1 M de sacarosa, solución de sacarosa 1 M más quinina 1 mM y agua desionizada sola. Las respuestas de alimentación inmediatas a cada tratamiento se determinan mediante la cuantificación de la duración de los contactos proboscis con la solución de ensayo, la frecuencia de los episodios de alimentación y la velocidad de la trompa de retracción lejos de la solución de prueba después del primer contacto durante la fase de prueba de 2 min. El volumen de la solución consumida se mide también después de la fase de prueba. En este estudio, hemos elegido un intervalo de criterio de ataque de 5 segundos (Figura 1, ver archivo Suplementario), basado en el trabajo previo de French et al. 25 que utiliza un umbral de 5 segundos para caracterizar el comportamiento trompa de retracción de Drosophila en respuesta a disuasorias 25 compuestos. Por lo tanto, definimos un combate de la alimentación como un contacto entre la trompa extendidas y la solución sint interrumpido por una ausencia de contactos de 5 o más segundos. En comparación con la sacarosa y el agua desionizada sola, la adición de quinina a la solución de sacarosa evidentemente disuade de alimentación por abejorros, ya que rápidamente se alejarán si detectan una sustancia aversiva (Video Figura 1). En este experimento, los tratamientos tienen un efecto significativo en la duración acumulada de los contactos proboscis durante la fase de prueba (ANOVA en los datos transformados logarítmicamente, F 2,31 = 41, p &lt;0,001). La duración acumulada del tiempo de contacto con sacarosa que contiene quinina se reduce significativamente en comparación con sacarosa sola (p &lt;0,001), pero no a agua desionizada sola (p = 0,219) (Figura 2). De manera similar, los tratamientos tienen un efecto significativo en la duración acumulada de los episodios de alimentación (ANOVA en los datos transformados logarítmicamente, F <sub&gt; 2,31 = 27.95, p &lt;0,001, Figura 3A). La duración acumulada de la alimentación de combates con sacarosa que contiene quinina se reduce significativamente en comparación con sacarosa sola (p &lt;0,001), pero no en comparación con agua desionizada sola (p = 0,41). Los tratamientos tienen también un efecto significativo en la frecuencia de los episodios de alimentación (Poisson GLM con una función de enlace de registro, el cambio en la desviación en comparación con la distribución c 2: p &lt;0,050), con lo que el número de combates con sacarosa que contiene quinina es significativamente mayor en comparación con la sacarosa (p &lt;0,01), pero marginalmente significativamente diferente a la de tratamiento de agua desionizada (p = 0,055, debido a un abejorro se presentan siete combates de alimentación sobre el agua, la figura 3B). Del mismo modo, la velocidad de retracción proboscis difiere significativamente entre los tratamientos (ANOVA en los datos transformados logarítmicamente, F 2,31 = 5,12, p &lt;0,050). Los abejorros se retraen el proboscis lejos de la solución de ensayo significativamente más rápido después del primer contacto con sacarosa que contiene quinina que con sacarosa o agua desionizada sola (p &lt;0,050, Figura 3C). Estos resultados sugieren que la quinina desencadena una conducta de evitación activa en los abejorros. Los tratamientos también tienen un efecto significativo en el volumen total de la solución consumida (ANOVA en los datos transformados logarítmicamente, F 2,32 = 62,5, p &lt;0,001), con lo que el consumo de sacarosa que contiene quinina se reduce en comparación con la sacarosa (p &lt;0,001), pero no a agua desionizada (p = 0,457) (Figura 4B). El volumen de solución se evapora desde el capilar durante el período de prueba es insignificante. En condiciones de laboratorio (25 ± 2 ° C y 28 ± 2% de humedad relativa), la evaporación varía entre 0.033 a 0.883 l con un promedio de 0.276 l y 0.171 l de agua desionizada y 1 M de sacarosa, respectivamente. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; En este ensayo, los contactos entre la antena y la solución de prueba no se puede prevenir. No obstante, el porcentaje de abejorros usando sus antenas para probar la solución de alimentación durante la fase de prueba (sacarosa: 46,1%, sacarosa más quinina: 60.0% y agua desionizada: 33,3%) no es significativamente diferente entre los tratamientos (binomial GLM, el cambio en la desviación en comparación con la distribución c 2: p = 0,450). Sin efecto de los tratamientos se encuentra en la latencia entre los primeros contactos antenales y la solución de ensayo y los primeros contactos de la proboscis (mediana: 2,67 seg para la sacarosa; 1,10 seg para sacarosa más quinina; 0,80 seg para agua desionizada, ANOVA en el datos de log-transformado, F 2,13 = 0,620, p = 0,550). Además, el porcentaje de abejorros se extienden la trompa de probar la solución de ensayo se mantiene constante en todos los tratamientos (sacarosa: 66,7%; sacarosa más quinina: 50,0%; agua desionizada: 52,2%; binomial GLM, el cambio en la desviación en comparación con la distribución c 2: p = 0,840). En conjunto, estos resultados sugieren que las antenas juegan un papel menor en la detección de las toxinas en este ensayo. Un experimento separado examina si es necesario para poner a prueba las abejas por un período de tiempo más largo que 2 min. La cantidad de alimento consumido por las abejas se prueba con el de sacarosa 1 M o quinina 1 mM en soluciones 1 M de sacarosa en dos condiciones: un período de prueba de 2 min y un período de prueba de 10 min. Para ambos tratamientos, el consumo total de alimentos no difiere para los períodos de prueba y no hay interacciones significativas se producen entre el período de prueba y el tratamiento (N = 6 a 13, ANOVA de los datos log transformados; efecto de los tratamientos: F = 1,31 54,8, p &lt;0,001; efecto del período de ensayo: F 1,31 = 0, p = 0,979; efecto de la interacción: F = 0,1, p = 0,457). En resumen, una2 min período de prueba es suficiente para evaluar el efecto de la solución de la cantidad total de alimentos consumidos por los abejorros y los efectos disuasivos de sustancias tóxicas o repelentes en este ensayo. Por lo tanto, mediante la medición de consumo de alimentos y el ensayo de comportamiento de alimentación, es posible correlacionar el consumo total de comida a la estructura fina de la alimentación durante el ensayo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig1.jpg" /> Figura 1: períodos de latencia entre la trompa contactos durante los primeros 2 min de la ensayo de alimentación gráficos de densidad de los períodos de latencia de tiempo que separa cada contacto proboscis con la solución de sacarosa 1 M, la solución de quinina 1 M de sacarosa + 1 mM y agua.. Los datos acumulados de 13, 10 y 11 abejas están representados respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig2.jpg" /> Figura 2: probóscide contacto duraciones durante los primeros 2 min del ensayo de alimentación gráficos de densidad de las duraciones de contacto trompa de abejorros se alimentan de 1 M de sacarosa, 1 M de sacarosa + quinina o agua 1 mM.. Tamaño de la muestra como en la Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig3.jpg" /> Figura 3: probóscide Actividad de abejorros alimentándose de 1 M de sacarosa, 1 M de sacarosa + quinina 1 mM o agua (A) La duración acumulada de los episodios de alimentación durante la fase de prueba (B) la frecuencia de la alimentación de los combates y (C) la velocidad. de la trompa de rela tracción después del primer contacto. Letras indica una diferencia significativa: tratamientos con letras diferentes indican p &lt;0,05. Los diagramas de caja representan la mediana (barras negras), el los puntos de datos más altas más bajo y aún dentro de 1,5 del rango intercuartílico (bigotes) y los valores atípicos (círculos). Tamaño de la muestra como en la Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig4.jpg" /> Figura 4:. Suprime quinina alimentación por abejorros (A) Las imágenes digitalizadas de los tubos microcapillary que muestran el nivel de la sacarosa 1 M o la solución de quinina 1 M de sacarosa más 1 mM (indicado por una línea de negro) antes y después de la fase de prueba respectivamente. (B) El consumo de 1 M de sacarosa, 1 M sacarosa más quinina 1 mM o agua desionizada<html> solo por abejorros después de la fase de prueba. Letras indica una diferencia significativa: tratamientos con letras diferentes indican p &lt;0,001. Los diagramas de caja representan la mediana (barras negras), el los puntos de datos más altas más bajo y aún dentro de 1,5 del rango intercuartílico (bigotes) y los valores atípicos (círculos). Tamaño de la muestra como en la Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Vídeo Figura 1: de grabaciones de vídeo de la Actividad de probóscide hacia (A) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1A_1M_Sucrose.m4v" target="_blank">1 M de sacarosa</a> , (B) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1B_Quinine.m4v" target="_blank">1 M sacarosa más quinina 1 mM</a> y (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Agua desionizada durante la fase de prueba.

Se describe un novedoso ensayo conductual para investigar las respuestas gustativas a corto plazo de las piezas bucales de abejorros (Bombus terrestris) que se mueven libremente hacia los nutrientes y toxinas en solución.

A Novel Behavioral Ensayo para investigar las respuestas gustativas de individual, libre de movimiento abejorros (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la sensibilidad gustativa de abejas obreras adultas de abejorro frente a nutrientes y toxinas. Con este método, podemos medir con gran detalle las respuestas naturales de alimentación de las abejas. Esto nos permitirá identificar la capacidad de las abejas para detectar tanto nutrientes como toxinas en solución.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona varias medidas de respuesta, como la cantidad de alimento que las abejas consumen en un corto período y la duración del episodio de alimentación. Esto presenta varias ventajas en comparación con los métodos existentes de tipo go-no-go, como un protocolo de reflejo de extensión del probóscide. Los ensayos de comportamiento proporcionan información valiosa sobre los mecanismos neuronales.Este ensayo proporcionará una manera controlada de estudiar las respuestas de abejas en movimiento libre a compuestos tóxicos en los alimentos. Una demostración visual de este método es realmente fundamental, ya que la preparación y presentación de las soluciones puede ser difícil de aprender. Requieren una administración realmente precisa de las soluciones en el momento adecuado.Esta demostración utiliza Bombus terrestris audax procedentes de colonias criadas comercialmente. Dos horas antes del inicio del experimento, recolecte abejas obreras individuales utilizando un vial de plástico con un tapón de plástico perforado. Para comenzar, transfiera los viales con abejas recolectadas individualmente a un ambiente oscuro y sométalas a ayuno durante dos a cuatro horas.Las abejas se prueban en un tubo de sujeción. El tubo de sujeción es un tubo de centrífuga de 15 mililitros modificado, con un orificio de cuatro milímetros perforado en la punta y un trozo de malla de acero fijado en el interior. A continuación, fije dos piezas de cartón a los lados del soporte de tubo de sujeción de poliestireno para proteger a la abeja de los estímulos visuales durante el experimento.Después del período de ayuno, transfiera una abeja desde el vial a un tubo de contención. Luego, fije el tubo de contención al soporte de poliestireno utilizando cera dental. A continuación, coloque una cámara microscópica digital.Conecte la cámara a un equipo informático adecuado para la grabación. Luego, coloque la cámara a cinco centímetros por encima del extremo del tubo de sujeción. Finalmente, ajuste el tubo de sujeción para que al menos 18 mililitros de su extremo queden dentro del encuadre del video.La prueba se divide en dos fases: la preprueba, en la que se presenta una gota de sacarosa, y la fase de prueba, en la que se presenta la solución de interés. Antes de comenzar el experimento, conecte un tubo de silicona de seis centímetros de largo con un diámetro interno de un milímetro mediante un adaptador macho a otro tramo de tubo de silicona de seis centímetros de longitud pero con un diámetro interno de cuatro milímetros. Esto funcionará como una perilla de pipeta.Ahora, prepare las soluciones de prueba. Primero, prepare un tubo microcapilar de 100 microlitros con la solución de prueba, luego escanee el tubo con un escáner plano a 600 ppp. A continuación, conecte el tubo microcapilar al tubo de silicona.Ahora, inserte la capilar en un portador de micromanipulador, como una jeringa modificada de un mililitro. Luego use el manipulador para colocar la capilar en posición lista. Comience la grabación de video después del período de habituación.En este estudio, la actividad del probóscide se registra a 26,7 cuadros por segundo con una ampliación de 25X. En segundo lugar, prepare una jeringa con sacarosa 500 milimolar disuelta en agua destilada. A continuación, conecte la jeringa a un adaptador hembra.Ahora, inicie la prueba. Primero, presente la jeringa con una gota de sacarosa de aproximadamente 3.5 microlitros en la punta del tubo de sujeción para motivar a la abeja a extender su probóscide. Dé a la abeja hasta cinco minutos para que consuma la sacarosa.Si la gota no se consume por completo, retire la abeja del experimento. Una vez que la abeja termine la gota, retire inmediatamente la jeringa. Luego, coloque la microcapilar a cinco o diez milímetros de la punta del tubo de sujeción y presione suavemente el tubo según sea necesario para mantener la solución en la punta del tubo microcapilar.Realice la prueba durante dos minutos, comenzando en el primer contacto del probóscide con la solución. Después de dos minutos, retire la micropipeta y escanéela nuevamente para medir el volumen de solución de prueba consumido por la abeja. Se compararon las respuestas alimenticias a sacarosa un molar, sacarosa un molar con quinina un milimolar y agua desionizada pura.Se registró la actividad del probóscide durante los primeros dos minutos de las pruebas. Un episodio de alimentación se define como el contacto entre el probóscide extendido y la solución sin interrupciones durante intervalos de cinco segundos o más. La duración acumulada de los episodios de alimentación con sacarosa que contenía quinina se redujo significativamente en comparación con la sacarosa sola, pero no en comparación con agua desionizada sola.De manera similar, los tratamientos tienen un efecto significativo sobre la frecuencia de episodios de alimentación durante la fase de prueba. Asimismo, la velocidad de retracción del probóscide difirió significativamente entre los tratamientos. Las abejas abejorros retracted su probóscide de la solución de prueba significativamente más rápido tras el primer contacto con sacarosa que contenía quinina, en comparación con sacarosa o agua desionizada sola.Se midió el consumo total de la solución de prueba tras la fase de ensayo. Las abejas consumieron significativamente menos la solución de sacarosa que contenía quinina que la solución de sacarosa pura. La respuesta a la quinina no fue significativamente diferente al agua desionizada.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres horas con aproximadamente ocho abejas, si se lleva a cabo correctamente y todas las abejas responden a la solución de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del valor de este método para obtener datos sobre los tipos de sustancias que las abejas pueden detectar en los alimentos. Al intentar este método, es muy importante no derramar ninguna solución dentro del tubo de contención y no dejar que se escape ninguna de la solución de interés fuera del tubo microcapilar.Esperamos que esta técnica permita a los investigadores en el campo de la gustación investigar más a fondo cómo el sistema del gusto de las abejas obtiene información sobre nutrientes y toxinas.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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Farmacología del Comportamiento en el condicionamiento clásico de la respuesta de Extensión probóscide en abejas de la miel ( Apis mellifera)

En este protocolo se muestra cómo acondicionar aprovechado las abejas a los estímulos táctiles e introducir una técnica de captura de movimiento 2D para analizar la cinemática de escala fina patrón de muestreo antenal.

Aire táctil y Análisis de Movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

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Vertical T-laberinto Choice Ensayo para la respuesta a los olores artrópodos

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RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

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