Name: Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a establecer cultivos de órganos placentarios y deciduales humanos para estudiar infecciones en la interfase materno-fetal. Esta técnica mantiene la arquitectura tisular tridimensional y permite investigar patógenos como Listeria monocytogenes.

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Estamos agradecidos a Cristina Faralla y David Lowe por sus útiles discusiones. Agradecemos a Mark Weinstein y al Departamento de Patología del Hospital General de San Francisco por su asesoramiento experto. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Instituto Nacional de Salud R01AI084928 y Burroughs Wellcome Fund 41259 a A.I.B; G.A.R. contó con el apoyo de F32AI108195, la subvención de investigación para jóvenes investigadores de la Sociedad de Patología Pediátrica y la beca postdoctoral del presidente de la Asociación de Asociaciones para la Diversidad del Profesorado de la Universidad de California.

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los principios expresados ​​en la Declaración de Helsinki. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California en San Francisco (CHR # 11-05.530). Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y su posterior análisis. El tejido se recogió en forma de ejemplares identificados de-. NOTA: El investigador debe obtener la aprobación de su junta de revisión institucional sujetos humanos. La exclusión de las muestras de acuerdo a la historia de la placenta o anomalías de gestación varía de acuerdo con las necesidades de cualquier estudio específico. NOTA: Las condiciones apropiadas de seguridad (nivel de bioseguridad 2) deben ser utilizados para todos los pasos de este protocolo 12. 1. Preparación, antes del día de Colección <ol><li> coladores autoclave / fórceps para la recolección y tijeras / fórceps para microdisección. </li><li> Preparar un volumen adecuado (500 ml por muestra) de tampón de lavado (refer a la Tabla 1 para la receta). </li><li> Prepare un volumen adecuado (100 ml por muestra) de 0,22 M Colección medios esterilizada por filtración (consulte la Tabla 1 para la receta). </li><li> Alícuota de la matriz extracelular (ECM, consulte la Tabla de Reactivos para más detalles) para el almacenamiento a largo plazo. </li><li> ECM tienda en forma sólida a -20 ° C. Para un mejor rendimiento, evitar la congelación y descongelación repetida. Descongelar la botella a una solución viscosa a 4 ° C, y preparar 300 ml de alícuotas en el cuarto frío con puntas de pipeta refrigerados. almacenar alícuotas a -20 ° C. </li></ol> 2. Recolección de tejido fresco PRECAUCIÓN: Cuando se trabaja con el tejido humano fresco, los investigadores deben seguir las precauciones universales (OSHA) para prevenir la transmisión de patógenos en la sangre, y deben haber recibido una formación institucional adecuado. equipo de protección personal, incluyendo guantes, protección ocular, y batas de laboratorio son necesarios. <ol><li> Transportecoladores tratadas en autoclave (una por muestra), fórceps esterilizados en autoclave, tampón de lavado (bombona), los medios de comunicación de la colección (25 ml por muestra en un tubo cónico de 50 ml), botella de spray, lejía al 10%, el 70% de etanol, bandeja de recogida de tejidos, Sharpie y cubo de hielo / refrigerador al hospital / clínica. NOTA: Las muestras se reciben en un espacio de investigación-señalado situado en una habitación cerca de la sala de operaciones. No se requiere una campana de cultivo de tejido estéril, pero la recolección debe producirse con rapidez y el investigador debe desinfectar adecuadamente las superficies, como se describe a continuación. </li><li> Lugar bombona de tampón de lavado al lado del fregadero, y el spray grifo con lejía al 10% y el 70% de etanol. Lugar de vidrio bandeja de recogida de tejido en la fuente de luz (tecla de luz o caja de luz), y desinfectar con lejía al 10% y el 70% de etanol. Deje secar al aire. </li><li> Tener las muestras conductoras clínico de la sala de operaciones a la sala de preparación de la muestra. En el lavabo, vierta la muestra encima del filtro de mano estéril, enjuague el tejido varias veces en Wastampón h, y la transferencia del espécimen entero en tampón de bandeja de vidrio desinfectados lo alto de la fuente de luz. NOTA: Evaluación de tejido por el clínico es de prioridad más alta, por lo que los siguientes pasos sólo se realizan después de que el médico ha indicado verbalmente que él / ella ha terminado la evaluación. </li><li> El uso de fórceps estériles para seleccionar las vellosidades de la placenta y la decidua (Figuras 2A y 3A) para la recogida y traslado al separar 50 ml tubos cónicos. Etiquetar los tubos con la edad gestacional. NOTA: Preferencia de edades gestacionales son menos de 9 semanas y menos de 16 semanas de la placenta y la decidua, respectivamente. En la institución, sólo una fracción de cada muestra se procuró para fines de investigación, como el tejido adecuada debe mantenerse para el diagnóstico patológico clínico. </li><li> Almacenar y transporte de muestras en hielo al laboratorio de investigación. </li><li> Para recoger más de un espécimen, desinfectar la bandeja de vidrio como se ha descrito anteriormente con lejía al 10% y etanol al 70% entre el Collección de cada muestra. </li></ol> 3. Preparación de placas de cultivo de órganos NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse utilizando una técnica estéril en una campana de cultivo de tejidos. Es ideal para el microscopio de disección que se encuentra en un campo estéril. Sin embargo, esto no es absolutamente necesario, siempre que micro-disección se realiza con rapidez, y los instrumentos se sumergen con frecuencia en 70% de etanol. <ol><li> deshielo vial ECM (s) en hielo. Diluir el ECM 1: 1 con los medios de comunicación Collection fríos como el hielo, mezclar con la pipeta. Pipeta lentamente para evitar la introducción de burbujas. Cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos requiere 100 l de esta suspensión y se adaptará a 3-4 cultivos de órganos. </li><li> insertos transwell Place (tamaño de poro 0,4 M) en cada pocillo de placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. </li><li> Escudo cada Transwell inserto con una capa delgada (100 l) de la suspensión ECM / media. </li><li> Colocar la placa en el hielo e inmediatamente proceder a establishment de cultivos de órganos. Por otra parte, preparar la placa antes de la recogida de tejidos, en cuyo caso se envuelve en el párrafo de película y se almacena a 4 ° C para su uso posterior. Almacenados por más de 6 horas no se recomienda como el ECM se secará. </li></ol> 4. Establecimiento de cultivos de órganos NOTA: Este paso se describe cómo colocar cultivos de órganos deciduales y cultivos de órganos de las vellosidades en los cultivos polarizados separadas. Los tejidos no están en contacto. Los investigadores interesados ​​en una técnica de co-cultura en la decidua y vellosidades están en contacto directo entre sí, pueden hacer referencia a la literatura anterior 9,10. <ol><li> Enjuague las muestras dos veces en medio de recolección, y se centrifuga a 1.000 xg entre cada enjuague. Transferencia de tejido a una placa de Petri estéril y lugar en el escenario de un microscopio de disección. Mantenga placa de 6 pocillos en hielo adyacente al microscopio. </li><li> tejido de micro-disección con tijeras estériles saltador de disección y pinzas, para establecer de 2-3 mm de cultivo de órganos de las vellosidadess (Figura 2A). NOTA: cultivos de órganos vellosos son pequeñas &quot;árboles&quot;, bien vascularizados con 2 o 3 ramas, y con prominentes columnas de células del trofoblasto extravelloso (EVT) 11. Es importante que se utilice sólo el tejido de las vellosidades de la semana &lt;9 ejemplares del primer trimestre, como la invasión de trofoblastos extravillous en ECM es más pronunciado en estos jóvenes mayores de 13 años. </li><li> Seleccionar vellosidades bien vascularizado con prominentes columnas de células EVT. Columnas de células EVT se visualizan como bulbosa, &quot;fuzzy&quot;, extremos &quot;suaves&quot; (se refieren a puntas de flecha en la figura 2A). </li><li> El uso de fórceps estériles para transferir 3 o 4 árboles de las vellosidades en cada transwell. Ajuste ramas para árbol se coloca plana encima de ECM y las ramas agrupadas separadas. </li><li> Micro-diseccionar el tejido decidual con las tijeras y pinzas estériles saltador de disección, para establecer 3 mm 3 cultivos de órganos deciduales (Figura 3A). NOTA: Las muestras contienen dos distinct tipos de tejidos deciduales, decidua parietal y decidua capsular (izquierda y derecha fragmentos de tejido, respectivamente, Figura 3A). </li><li> Recorte con tijeras para crear 3 mm 3 piezas de decidua parietal. decidua capsular no se utiliza para estos cultivos. El uso de fórceps para molestar a la basura cualquier coagulada sangre materna. </li><li> El uso de fórceps estériles para transferir 3-4 piezas de decidua en cada transwell. </li><li> Añadir 1 ml de medio Colección de fondo del pozo. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2 </li><li> Para los experimentos en los que es importante para imitar primer trimestre de tensión normal de oxígeno de la placenta, mantener cultivos de órganos de las vellosidades en la hipoxia relativa (3% O 2). NOTA: Las opciones de laboratorio incluyen pequeñas cámaras de hipoxia incubadora que caben dentro de las incubadoras existentes, o una incubadora de gas-tri que introduce externa de gas N2 para disminuir la concentración de oxígeno. </li><li> Añadir 1 ml de medio de las vellosidades o decidual (TabLe 1) al principio de la transwell después de 12-16 horas de cultivo. NOTA: La ausencia de medios de comunicación durante la primera durante la noche en un cultivo permite que las columnas de células trofoblasto extravillous para invadir (cultivo velloso), y para el tejido (tanto de las vellosidades y decidual) para convertirse en forma segura incrustado en ECM. En nuestra experiencia, cultivos de órganos deciduales permanecen viables durante 72 hr y órganos de las vellosidades culturas durante 96 horas. Recomendamos criterios de valoración experimentales que caen dentro de este plazo. Véase la Tabla 1 para la composición del medio de las vellosidades y decidua. Medio velloso tiene un alto porcentaje de FBS, mientras que el medio Decidual se complementa con las hormonas del embarazo (progesterona, 17b-estradiol) que mantienen el estado decidualized (Tabla 1). </li></ol> 5. Preparación de L. monocytogenes culturas NOTA: Para el protocolo detallado en el almacenamiento a largo plazo de L. monocytogenes, y la cultura y el crecimiento de this organismo en infusión de cerebro y corazón caldo y agar (BHI), por favor refiérase a Wang et al. 14 <ol><li> Elija una sola L. monocytogenes colonia de la placa de agar BHI con rayas e inocular 3 ml de caldo BHI. </li><li> Incubar la L. monocytogenes cultivo durante la noche (16 hr), en una posición inclinada, a 30 ° C. NOTA:. Estas condiciones de cultivo permiten el crecimiento bacteriano para alcanzar la fase estacionaria L. monocytogenes es flagelado a 30 ° C, lo que aumenta la invasión de células de acogida 15. </li></ol> 6. La infección de los cultivos de órganos con L. monocytogenes <ol><li> PBS caliente y velloso o medio decidual (Tabla 1) a 37 ° C. </li><li> Use pinzas estériles para eliminar cualquier pieza de cultivo de órganos que no invaden en el ECM, y por lo tanto están flotando en el pozo. </li><li> Con cuidado aspirar los medios de comunicación desde la parte inferior de la transwell. Enjuague los cultivos polarizados superior e inferior dos veces con la pipeta suavemente 1 ml de guerraM de PBS en los pocillos, y cuidadosamente aspirando en el medio. pipeta suavemente 1 ml de las vellosidades o Decidual medio libre de antibiótico para transwell superior e inferior. Tenga cuidado de no perturbar el cultivo de órganos. </li><li> Deje que el tejido se incuba en un medio libre de antibióticos durante al menos una hora para asegurar que los antibióticos se han eliminado. NOTA: En fase estacionaria la densidad de la L. cultura monocytogenes es de aproximadamente 1 x 10 9 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. El número de bacterias que se utilizan para infectar cultivos de órganos debe ser determinado empíricamente para satisfacer las necesidades experimentales. </li><li> Para el tipo salvaje de L. monocytogenes infección experimentos de rutina muestran invasión robusto con una dilución 1:50 de la noche a la mañana los (4 x 10 7 L. monocytogenes en 1 ml de medio por pocillo). Resuspender el número apropiado de las bacterias en medio de las vellosidades o Decidual libre de antibióticos. </li><li> Aspirar los medios de comunicación desde la parte superior de los cultivos polarizados. agregar suavemente 1 ml de inóculo. Incubar las placas a 37° C en 5% de CO 2 para permitir la invasión bacteriana. </li><li> Eliminar las bacterias extracelulares mediante la aspiración de los medios de cultivos polarizados superior e inferior. Enjuague los pocillos dos veces con PBS caliente. Añadir 1 ml de velloso o medios deciduales suplementado con 50 mg ml -1 gentamicina. Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2. NOTA: L. monocytogenes es una bacteria intracelular facultativa que puede crecer en el medio extracelular, crecer dentro de las células, y propagarse de célula a célula sin acceder al espacio extracelular. Gentamicina tiene un efecto bactericida sobre extracelular L. monocytogenes y por lo tanto permite la medición de intracelular L. monocytogenes y se extendió a través del cultivo de órganos 16. NOTA: Se puede reproducir L. monocytogenes infección de cultivos de órganos de las vellosidades y decidua se produce con tiempos de incubación de 5 horas. El tiempo de incubación antes de la adición de gentamicina puede ser modifica en función de las necesidades experimentales y el ability del organismo para invadir el tejido. Para comprender mejor los sitios anatómicos más vulnerables a la infección, los tiempos de incubación más cortos se pueden usar 2. </li><li> Mantener las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la duración del experimento. Cambio de medio entero en cada pocillo diaria. NOTA: En nuestra experiencia, L. monocytogenes cultivos de órganos deciduales infectados permanecen viables durante 48 hr culturas y órganos de las vellosidades durante 72 horas. </li></ol> 7. Cosecha de Órganos Los cultivos para Histopatología <ol><li> Se prepara una solución fresca de 4% de paraformaldehído por dilución de 10 ml de una 16% de la ampolla en 30 ml de PBS. Tienda paraformaldehído al 4% a 4 ° C, protegido de la luz, y el uso dentro de una semana. Llevar a temperatura ambiente antes de su uso. </li><li> Aspirar los medios de transwell superior e inferior. Enjuague suavemente los pocillos dos veces con PBS a temperatura ambiente. añadir 1 ml suavemente 4% de paraformaldehído al principio de la transwell para cubrir completamente el cultivo de órganos. </li><li> Incubaren 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 min. Evitar los tiempos de incubación más largos ya que esto podría conducir a un exceso de la fijación del tejido. </li><li> paraformaldehído Aspirar y pozos de enjuague dos veces con PBS a temperatura ambiente. Integrar los cultivos de órganos fijos en medio OCT, congelar, y la sección en un criostato ( &quot;fixed congelado&quot;). En general, el tejido congelado fija es más fácil de la sección de tejido congelado sin fijación previa. NOTA: Para el protocolo completo el oct inclusión y corte congelado, por favor, accede a las secciones pertinentes de los protocolos publicados 17,18. Dependiendo de las necesidades experimentales y equipo de laboratorio disponibles y almacenamiento, en lugar de tejido puede ser incluido en parafina y se seccionaron en un micrótomo 19. </li><li> Además de preparar diapositivas de tejidos para la rutina Hematoxilina y Eosina, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica 18,20,21. </li></ol>

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<li>Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+traffics+from+maternal+organs+to+the+placenta+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back.</a> PLoS pathogens. 2, e66(2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Endogámicos, transgénicos y ratones knockout cepas pueden servir en sistemas experimentales para probar robustamente mecanismos. Sin embargo, a pesar de la conservación general de material genético núcleo, los genomas funcionales de ratones y seres humanos demuestran diferencias significativas en los elementos de regulación 23. No es sorprendente, por lo tanto, que los estudios preclínicos prometedores en modelos animales son a veces no se recapitulan en pacientes humanos. La placenta muestra muy alta diversidad entre especies, lo que hace por lo tanto modelos animales menos ideal para el estudio de enfermedades humanas 24. Reconociendo tanto las diferencias notables en inmunología humana y el ratón 25, y la evolución divergente pronunciada en la anatomía de la placenta, es prudente considerar el uso de cultivos de órganos ex vivo de tejidos gestacionales humanos para la investigación experimental. Las descripciones, imágenes fotográficas y de vídeo de instrucción en este protocolo instruyen a los investigadores enla forma de establecer las vellosidades y cultivos de órganos deciduales en insertos de cultivo de tejido Transwell ECM-revestido. Las ventajas de esta técnica son la relativa simplicidad de la micro-disección y sistema de apoyo transwell mecánica, especialmente en comparación con métodos alternativos tales como matrices incrustados-3D o cultivos de cortes de órganos. La suspensión del cultivo de órganos de soporte de membrana permite el intercambio de nutrientes en todas las superficies de los tejidos y la viabilidad se mantiene para cultivo a corto plazo (96 horas para los cultivos de las vellosidades, 72 hr para las culturas deciduales) .Esta técnica permite el estudio de la biología de la placenta humana en el tejido nivel, sin lugar a dudas más biológicamente relevante que los modelos de cultivo celular monocapa. El paso más crítico en este protocolo es la micro-disección de las piezas de las vellosidades y decidua apropiadas para el cultivo de órganos. Piezas óptimos de tejido se demuestran fotográficamente (Figura 2A y la figura 3A) para ayudar a los investigadores para quienesvisualización de especímenes gestacional es nueva. Es particularmente importante seleccionar árboles vellosos cuyas ramas terminan en columnas EVT, ya que estas células migrarán en el ECM y ayudar a anclar las vellosidades a la membrana. Para ambos tipos de cultivos de órganos es útil para reducir al mínimo las perturbaciones en el tejido durante los cambios de los medios de comunicación por pipeteo de una manera cuidadosa y sin prisas. Esta técnica presenta dificultades mínimos. En ocasiones, las muestras muestran la contaminación. La contaminación bacteriana es generalmente (en ocasiones poli-microbiana), y sólo se hace evidente después de 1-2 días de cultivo. Una vez que se observa contaminación, la lejía se debe aplicar, la cultura descarta y la incubadora de cultivo de tejidos esterilizados para evitar un problema a largo plazo. Hay varias maneras posibles podría surgir la contaminación: la infección en el útero, durante la cirugía, durante la cosecha de especímenes / procesamiento, o durante el mantenimiento de cultivo de órganos. Las etapas de cosecha y procesamiento son el momento más probabley el lugar de la contaminación que se introducirá. Por lo tanto, es importante reducir la cantidad de tiempo se manipula el espécimen durante la recogida y micro-disección. Esto reducirá exposición de las muestras a la ambiente, el medio ambiente no estéril. Dependiendo de la configuración de laboratorio, el microscopio de disección se puede situar dentro de la campana de cultivo de tejido estéril. El análisis histopatológico de cultivos de órganos después de la infección con el patógeno médicamente relevante L. monocytogenes, se muestra aquí como una posible aplicación del protocolo. Inmunofluorescencia localización de ambas bacterias y células inmunes del huésped después de la infección produce nuevos conocimientos sobre la respuesta del huésped humano a los patógenos. Cultivos de órganos deciduales pueden servir como una técnica complementaria ex vivo experimento para examinar los datos generados a partir de las infecciones de ratones in vivo, incluidos los informes intrigantes que muestran defectos en las funciones de defensa de los macrófagos murinos deciduales 26,27. Además, org humanaun culturas se pueden utilizar en las estrategias de infección mixta, tal como un inóculo competitiva compuesta de varias cepas isogénicas de L. monocytogenes. infección competitiva de los cultivos de órganos es una manera sensible para probar la relevancia de los factores de virulencia en el huésped humano. Una limitación de este método es la viabilidad del tejido, que se limita a cultivo a corto plazo (96 horas para los cultivos de las vellosidades, 72 hr para las culturas deciduales). Esto es ideal para la infección con microbios de rápido crecimiento como L. monocytogenes, pero las culturas más largos pueden ser necesarios para los patógenos que toman más tiempo para establecer y difundir a través del tejido. Para reducir la carga global de las complicaciones del embarazo, la investigación debe centrarse en la comprensión de la fisiopatología de la interfase materno-fetal humano. Infecciones bacterianas, fúngicas y virales patógenos que cruzan la madre al feto causa devastadoras complicaciones del embarazo y la infección fetal. Controlado infección in vivo de laboratorio animals normalmente se considera el estándar de oro para abordar cómo los patógenos colonizan y tránsito entre los órganos 28. Debido a la anatomía de la placenta varía considerablemente de una especie de mamífero, que es de suma importancia para incorporar los tejidos humanos en las estrategias de investigación. cultivos de órganos de las vellosidades y decidua humanos son sistemas modelo de gran relevancia para investigar la interacción huésped-patógeno. Para el estudio de este órgano vital aún poco conocidos, los investigadores pueden aprovechar la abundancia de la placenta humana descartados y los especímenes deciduales, el uso de estrategias de cultivo de órgano, como se describe aquí.

La infección y la inflamación en la interfase materno-fetal representa una fuente importante de morbilidad y mortalidad en las mujeres y los niños. La comprensión de cómo los patógenos infectan a estos tejidos es fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias para prevenir y tratar enfermedades como el trabajo de parto prematuro y muerte fetal. Sin embargo, los altos variabilidad entre especies de la interfase materno-fetal complica la investigación experimental. Además, la mayoría de patógenos microbianos muestran especificidad de huésped, por tanto, muchos modelos animales no puede recapitular completamente las enfermedades infecciosas humanas. Ciertos organismos (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, y numerosos otros) son estrictamente patógeno en los seres humanos, mientras que otros, tales como Listeria monocytogenes, muestran un nivel más intermedio de especificidad de huésped 1. Especificidad de huésped se ha documentado en muchos aspectos de la patogénesis, incluyendo la colonización 2, 3 difusión, la evasión inmune 4 </sarriba&gt;, y la adquisición de nutrientes 5. Por lo tanto, es de suma importancia para seleccionar sistemas modelo de acogida óptimos. Compuesto de células fetales en sangre materna y, la placenta es un órgano que se desarrolla rápidamente durante el curso de la gestación 6. En términos más simples, la placenta humana está construida con estructuras en forma de árbol fetales &quot;vellosas&quot; bañadas en la sangre materna. Gas y el intercambio de nutrientes se produce a través de capas de células fetales especializadas llamadas trofoblastos que recubren la superficie de los árboles vellosos. El revestimiento de la mucosa uterina materna, llamado endometrio en la mujer no embarazada, transforma estructuralmente y funcionalmente en la decidua para dar cabida a la unidad fetoplacentaria. árboles vellosidades están anclados en el útero por trofoblastos extravillous (EVT) que migran desde el anclaje de columnas de células en la decidua. La interfase materno-fetal, por lo tanto, consiste en decidua y la placenta. La técnica de cultivo de órganos describe aquíha sido utilizado para examinar dónde y cómo los patógenos humanos clínicamente relevantes, incluyendo L. monocytogenes s y Toxoplasma gondii, atraviesan la barrera placentaria 2,7. Estos cultivos de órganos ex vivo se replican en la arquitectura del tejido vivo, y son sin duda los sistemas modelo fisiológicamente altamente relevantes para la placentación humano. Las técnicas de cultivo adicionales incluyen explantes de órganos enteros, rebanadas de órganos y tejidos o de células madre organoides celulares embebidos en matriz en 3D. Para más detalles sobre estas opciones, por favor referirse a una reciente revisión exhaustiva 8. Tenga en cuenta que este protocolo es para la cultura separada de la decidua y vellosidades placentarias. Para el estudio de la interacción entre células de la placenta y células deciduales, una técnica de co-cultivo puede ser preferido. Remitimos al lector interesado a la técnica de co-cultivo de las vellosidades-decidual anteriormente descrito, utilizado por los investigadores que estudian la remodelación vascular mediada decidual trofoblasto 9-11.

<table><tbody><tr><td>Bolsas de esterilización</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td>Para la esterilización en autoclave de herramientas de disección individuales</td></tr><tr><td>Colador de malla fina</td><td>Cuisinart (Amazon.com)</td><td>NA</td><td>Envuelva completamente en papel de aluminio y autoclave antes de la recolección de tejidos.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Garrafón con espiga</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-647</td><td>Para la preparación de grandes volúmenes de tampón de lavado.</td></tr><tr><td>Bolsas de hielo</td><td>Nortech labs</td><td>GB8818</td><td>No es necesario comprarlas, sino que se pueden reciclar/reutilizar de cualquier envío rutinario del laboratorio que las incluya en el embalaje.</td></tr><tr><td>Etanol al 70 %</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td>solución al 70 % elaborada mediante la adición de dH20 a 190 o 200 grados de alcohol de grado de investigación. &nbsp;</td></tr><tr><td>10% Bleach</td><td>Waxie Sanitary Supply</td><td>CLO 30966</td><td>Solución al 10% elaborada mediante la adición de dH20.</td></tr><tr><td>Caja de luz</td><td>Litebox Lumina (dickblick.com)</td><td>55305-2009&nbsp;</td><td>Nota: Las bombillas de repuesto también se compran en Blick (55305.0100)</td></tr><tr><td>Pinzas de microdisección&nbsp;</td><td>Stoelting&nbsp;</td><td>52102-43</td><td>4 pulgadas, 1 x 2 x 0,5 mm3, Curva Ligera</td></tr><tr><td>Pinzas de disección Micro</td><td>Stoelting</td><td>52102-06</td><td>4 pulgadas, Recta Fina, Afilada</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte de micro disección</td><td>Stoelting&nbsp;</td><td>52130-01P</td><td>McPherson-Vannas Tijeras de resorte, 8,5 cm, punta de 0,33</td></tr>, <tr><td>curva ligera Microscopio de disección</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16 o M60</td><td>Hemos tenido éxito con los modelos enumerados. Las fuentes de luz flexibles externas de cuello de cisne son útiles, pero no necesarias.</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS4558</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10010023</td><td>Compramos en las instalaciones del Centro de Cultivo de Tejidos de nuestra universidad, hay opciones alternativas como esta disponibles. &nbsp;</td></tr><tr><td>10x Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Teknova</td><td>P0195</td><td>Para la preparación del tampón de lavado utilizamos 10x PBS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 mezcla de nutrientes (Ham's) con GlutaMAX</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10565-018</td><td>Compramos esta formulación de medios específica, que contiene 2,438 g/L de bicarbonato de sodio, 55 mg/L de piruvato de sodio y 4,5 g/L de glucosa</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermofisher Scientific 15710072</td><td></td><td>1.000x culata. Se recomienda preparar y almacenar alícuotas a -20 &deg; C para evitar la congelación/descongelación.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100x stock.&nbsp; Se recomienda preparar y almacenar alícuotas a -20 &deg; C para evitar la congelación/descongelación.</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15290-018</td><td>500x stock.&nbsp; Se recomienda preparar y almacenar alícuotas a -20 &deg; C para evitar la congelación/descongelación.</td></tr><tr><td>progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Una solución madre de 1 mM se elabora reconstituyendo 15,7 mg de polvo de progesterona en 15,7 ml de etanol y añadiendo 34,3 ml de PBS. La solución se filtra estérilmente, se alícuota y se almacena a -20 °C.</td></tr><tr><td>17&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td>A 10 &mu; La solución madre M se elabora reconstituyendo 13,5 mg de estradiol en polvo en 10 ml de etanol y añadiendo 40 ml de PBS. La solución se filtra estérilmente, se alícuota y se almacena a -20 °C.</td></tr><tr><td>Filtro de vacío con tapa de botella (0,22 &mu; m)</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430769</td><td>Para la filtración estéril de medios de recolección después de la preparación</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353224</td><td>Poliestireno,</td></tr><tr><td>Transpocillos de 6 pocillos tratados con cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>Inserto Millipore</td><td>PICM03050</td><td>- 30 mm de diámetro, 0,4 &mu; m tamaño de poro membrana hidrofílica de PTFE</td></tr><tr><td>Matriz extracelular (por ejemplo, matriz de Matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Hemos utilizado la matriz de Matrigel en nuestros estudios. Es un sólido a temperatura ambiente y a -20 °C. Evite la congelación/descongelación repetida. Descongele la botella hasta la solución viscosa a 4 °C; C, y preparar ~ 300 &mu; L alícuotas en la cámara frigorífica con puntas de pipeta refrigeradas. Almacene las alícuotas a -20 &deg;C.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 16% p/v solución acuosa&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Para la fijación de tejidos, se realiza una nueva preparación de paraformaldehído al 4% diluyendo este stock en PBS.</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo de tejidos, mantenida a 37 &deg; C, 5% de CO2, 3% de oxígeno (opcional para cultivos de órganos vellosos)</td><td></td><td></td><td>Para algunos experimentos, puede ser preferible la hipoxia. Esto se puede establecer de múltiples maneras, incluida la adición de nitrógeno exógeno a través de un cilindro de gas, una tubería Tygon y un regulador. &nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td> de sobremesa</tr></tbody></table>

los cultivos humanos de la placenta y decidual de órganos para el estudio de infecciones en la interfase materno-fetal

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

La placenta se muestra un alto grado de variabilidad anatómica entre especies. Para entender mejor la biología y la fisiopatología de la placenta humana, es imperativo para diseñar experimentos utilizando células y tejidos humanos. Una ventaja de cultivo de órganos es el mantenimiento de tres dimensiones (3D) organización estructural y de la matriz extracelular. El objetivo del método descrito aquí es el establecimiento exitoso de ex vivo cultivos de órganos tejidos humanos gestacional y su mantenimiento sana cultura de 72-96 h. El protocolo detalla el procesamiento inmediato de la investigación con autorización, de la placenta y la decidua especímenes frescos de la sala de operaciones. Estos son abundantes especímenes que de otro modo serían descartados. Las instrucciones detalladas sobre la recogida estéril de estas muestras, incluyendo los detalles morfológicos sobre cómo seleccionar los tejidos adecuados para establecer cultivos de órganos en 3D, se proporciona. Tejidos vellosos y deciduales placentarios se microdissected en 2-3 mm de 3 piezasy se colocan por separado en filtros transwell matriz forrado y se cultivaron durante varios días. Velloso y cultivos de órganos deciduales son muy adecuadas para el estudio de la interacción huésped-patógeno humano. En comparación con otros organismos modelo, estas culturas humanas son particularmente ventajosas para examinar el mecanismo de la infección por patógenos que demuestran patrones variables de especificidad de huésped. A modo de ejemplo, se demuestra la infección de cultivos de órganos de la placenta y la decidua con el patógeno bacteriano Listeria monocytogenes intracelulares facultativos, clínicamente relevantes.

La Figura 1 (modificado de Zeldovich y Bakardjiev 22) Diagramas de la placenta y la anatomía relevante del útero. La figura 2 muestra representativa bruto e imágenes histológicas de las vellosidades placentarias, mientras que la figura 3 muestra de tejido decidual. Este protocolo describe por primera vez la colección de la placenta fresco y tejido decidual en el hospital o clínica. La muestra recogida es una mezcla de la placenta fetal (vellosidades) y los componentes uterinas maternas (decidua). Después de aclarar con tampón que contiene antibióticos de amplio espectro y antifúngicos, toda la muestra se inspeccionó visualmente usando una caja de luz. Villi y decidua se colocan en tubos separados y transportados en hielo al laboratorio. En el laboratorio, un microscopio de disección se utiliza para apreciar las características morfológicas finas de tejido sano. fotografías representativas delas vellosidades (Figura 2A) y tejidos deciduales (Figura 3A) que fueron adquiridos con un microscopio de disección con dos fuentes de luz de cuello de cisne externos se muestra como referencia. cultivos de órganos de las vellosidades se generan a partir de muestras primer trimestre. Culturas consisten en pequeños árboles de las vellosidades terminales con 2-6 ramas. Es importante para diseccionar ramas vellosos que terminan en columnas trofoblásticas extravillous y son bien vascularizada. Estas características se ven como extremos de derivación (puntas de flecha) &quot;esponjoso&quot; o &quot;fuzzy&quot;, y el color de rosa a rojo débil lineal que corre por las ramas del árbol a la izquierda en la figura 2A. Por el contrario, vasculatura y trofoblastos extravillous no se visualizan fácilmente para el árbol de la derecha de esta imagen, lo que sería óptimo para el cultivo. Durante el primer día de la cultura, los trofoblastos extravillous migran a la ECM, tHus anclaje de los árboles vellosos en la matriz en la transwell. cultivos de órganos deciduales se generan a partir de muestras primera y principios del segundo trimestre. Todo el revestimiento del útero se transforma en decidua muy poco después de la implantación. Más específicamente, decidua basal define la mucosa uterina directamente subyacente del sitio placenta / implantación, decidua capsular define mucosa que recubre el feto, y decidua parietal se refiere al resto de las paredes del útero. La visualización bajo un microscopio de disección muestra que el espécimen gestacional temprana consiste en gran parte de la decidua parietal y decidua capsular (izquierda y derecha fragmentos de tejido, respectivamente, en la figura 3A). La decidua capsular se distingue fácilmente por su naturaleza fina, membranosa. Para cultivos de órganos, decidua parietal se recorta a 3 mm 3 fragmentos con unas tijeras de disección y micro-adhealquiler sangre coagulada se retira con una pinza. Después de la incubación durante la noche, los tejidos están infectados con L. monocytogenes. El protocolo de infección descrito anteriormente se basa en el ensayo de protección de gentamicina utilizado para estudiar el crecimiento intracelular y la propagación de las bacterias intracelulares facultativas 16. Cultivos de órganos en medio libre de antibiótico se incuban con L. monocytogenes durante 5 horas. Los cultivos se lavaron con PBS estéril para eliminar las bacterias del medio. A partir de entonces, se añade gentamicina para eliminar los organismos extracelulares. Literatura previa de nuestro laboratorio utiliza inmunofluorescencia y microscopía confocal para determinar la localización del tejido bacteriana en diferentes puntos de tiempo después de la infección 2. Cultivos de órganos se enjuagan en PBS, se fijaron en 4% de paraformaldehído, y, o bien en medio OCT y se almacena a -80 ° C, o incluido en parafina y se almacena a temperatura ambiente embebido congelado. Las secciones de tejido pueden ser stained para inmunofluorescencia (IF) o análisis inmunohistoquímico (IHC) de las bacterias y la localización de células eucariotas. La Figura 2B es un representante si la imagen de una sección congelada preparado a partir de un 8,3 semanas de cultivo de órganos de las vellosidades en 72 hr después de la infección. Tenga en cuenta la pesada carga bacteriana (fluorescencia verde) en las EVT en los extremos de las ramas de las vellosidades, y la relativa falta de bacterias dentro de la capa de revestimiento del árbol-sincitiotrofoblasto (fluorescencia roja). En trabajos anteriores, se utilizó la tinción similar si se localice L. monocytogenes en los cultivos de órganos de las vellosidades en diferentes puntos de tiempo tras la infección. Más de 72 horas, la infección se extendió desde EVT en citrofoblastos sub-sincitial y el estroma de las vellosidades subyacente. En particular, la capa de synyctiotrophoblast era resistente a la infección 2. Representativos imágenes de microscopía óptica de secciones de tejido decidual incluidos en parafina teñidas con H &amp; E preparan a partir de 14,3 semanas specimens se muestran en las figuras 3B y 3C. Esta membrana transwell ECM-revestido se incrusta para mostrar el cultivo de órganos in situ (Figura 3B). La imagen muestra glándulas revestidas de epitelio (asterisco) y la vasculatura endotelial forrado (diamante) posicionados de forma heterogénea dentro del compartimento de células del estroma decidual. Además, hay células inmunes maternas repartidos por todo el estroma decidual a una densidad variable. IHC e IF tinción puede ser utilizado para determinar la localización microanatómico bacteriana, con relación a las células inmunes residentes específico. Como un ejemplo, los macrófagos CD14 + (fluorescencia verde) se localizan en el revestimiento de la vasculatura y se dispersan dentro de la estroma (Figura 3D), mientras que los grandes agregados de L. monocytogenes (fluorescencia roja) se observó principalmente en el estroma decidual a las 48 horas después de la infección (Figura 3D). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> tampón de lavado </td><td> medio Collection </td><td> medio de las vellosidades </td><td> medio decidual </td></tr><tr><td> PBS </td><td> DMEM / F-12 con GlutaMAX </td><td> DMEM / F-12 con GlutaMAX </td><td> DMEM / F-12 con GlutaMAX </td></tr><tr><td> La penicilina 100 UI / ml </td><td> Suero bovino fetal al 2,5% </td><td> Suero bovino fetal al 20% </td><td> Suero bovino fetal al 2,5% </td></tr><tr><td> Estreptomicina 100 mg / ml </td><td> La penicilina 100 UI / ml </td><td> La penicilina 100 UI / ml </td><td> 17β-estradiol de 300 pg / ml </td></tr><tr><td> La gentamicina 50 mg / ml </td><td> Estreptomicina 100 mg / ml </td><td> Estreptomicina 100 mg / ml </td><td> Progesterona 20 ng / ml </td></tr><tr><td> La anfotericina B 1,25 g / ml </td><td> La gentamicina 50 mg / ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;<html> / Td&gt; <td> La anfotericina B 1,25 g / ml </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Recetas de medios Componentes y concentraciones para la preparación de tampón de lavado, medio de recogida, medio de las vellosidades y medio decidual. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig1.jpg" /> Figura 1. placentario estructura. (A) Estructura de la unidad feto-placentaria en el útero materno, (B) Ampliación de la caja en (A) destaca que trofoblasto fetal (T) forrado vellosidades placentarias se bañan en sangre materna y anclados en la decidua por trofoblastos extravillous (EVT). Contenido dentro de vellosidades son vasos fetales (FV), fibroblastos, macrófagos y fetales. Modificado de Zeldovich y Bakardjiev 22.<html> &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig2.jpg" /> Figura 2: cultivos de órganos vellosos - Representante bruto e imágenes microscópicas (A) Dos árboles de las vellosidades terminales con una edad gestacional de 6 semanas, como se observa bajo un microscopio de disección.. Tenga en cuenta los extremos &quot;suaves&quot; (puntas de flecha) y prominente vasculatura fetal que cursan a través de las ramas del árbol de la izquierda lo que hace de esta pieza adecuada para el cultivo de órganos. (B) La inmunofluorescencia de cultivo de órganos (edad gestacional 8,3 semanas) después de la infección de 72 horas con Listeria monocytogenes, destacando pesada carga bacteriana [verde] en trofoblastos extravillous. DAPI se muestra en azul, y ßhCG + sinciciotrofoblastos en rojo. Barras de escala = 1 mm (A), 250 m (B).7 / 54237fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig3.jpg" /> Figura 3:. Decidual cultivo de órganos - Representante bruto y las imágenes microscópicas (A) decidua parietal [izquierda] y decidua capsular [derecha] a la edad de 6 semanas de gestación, tal como se observa bajo un microscopio de disección. Sección teñida-E (B) H &amp; de cultivo de órganos 14,3 semanas de gestación decidua parietal edad muestra glándulas y vasos organizados de forma heterogénea a lo largo estroma decidual. El (diamante, ◆) y el (asterisco, *) destacan buque representativa y la glándula, respectivamente. línea marrón en el borde inferior de la membrana es transwell, en el borde. (C) H &amp; E-manchado sección de 14,3 semanas de edad gestacional decidua parietal cultivo de órganos a mayor aumento demonstrates arterias espirales musculares de paredes incrustadas en el estroma decidual. Las células inmunes maternas son pequeñas con núcleos redondos oscuros, y se distribuyen de manera irregular a lo largo del estroma. (D) La inmunofluorescencia de cultivo de órganos de 48 horas después de la infección con L. monocytogenes, destacando grandes zonas de bacterias [rojo] en el estroma decidual, y CD14 + maternos macrófagos [verde] bordean un espacio vascular tortuosa y dispersos en el estroma. Las barras de escala = 1 mm (A), 250 mm (B), 50 micras (C y D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54237/54237fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se describe un método simple para establecer la placenta humana primaria (vellosidades) y cultivos de órganos de la decidua. cultivos de órganos de las vellosidades y decidua son herramientas muy valiosas para el estudio de la patogénesis en la interfase materno-fetal humano. La infección con la bacteria intracelular Listeria monocytogenes facultativos se demuestra.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos organoides primarios de placenta humana y decidua para el estudio de la infección en la interfaz materno-fetal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología placentaria y las enfermedades infecciosas, como por ejemplo: ¿dónde cruzan los patógenos la interfaz materno-fetal durante el embarazo? Las principales ventajas de esta técnica sencilla y eficiente son el uso de muestras humanas frescas y la conservación de la estructura tisular tridimensional en el cultivo organoide.Este método puede utilizarse para estudiar infecciones en la interfaz materno-fetal. También puede aplicarse a otras áreas de investigación, como el desarrollo placentario. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la selección del tejido adecuado para el cultivo es difícil sin conocimientos previos de la microanatomía, y será la Dra. Gabrielle Rizzuto quien demuestre este método.Utilizando técnica estéril en una campana de cultivo de tejidos, llenar los viales de matriz extracelular sobre hielo, luego diluir la matriz extracelular calentada uno a uno con medio de recolección frío. Mezclar la suspensión mediante pipeteo, teniendo cuidado de no inducir burbujas. A continuación, colocar insertos transbien con poros de 0,4 micrones en pozos individuales de una placa de cultivo de tejidos de seis pozos, y recubrir cada inserto con 100 microlitros de la suspensión de matriz extracelular.Coloque la placa sobre hielo y enjuague los especímenes dos veces en medio de recolección, transfiriendo el tejido a una placa de Petri estéril bajo un microscopio estereoscópico después del segundo lavado. Los especímenes contienen dos tipos distintos de tejidos deciduales: la decidua parietal y la decidua capsular. Utilizando tijeras y pinzas estériles para disección, seccione microscópicamente la decidua parietal en fragmentos de 3 milímetros cúbicos, usando las pinzas para separar cualquier sangre materna coagulada, y utilice las pinzas para transferir tres o cuatro fragmentos de decidua a cada cámara transwell.Identifique las vellosidades bien vascularizadas, con columnas prominentes de células trofoblásticas extravilosas y utilice pinzas para transferir tres o cuatro árboles vellosos a cada trans-bien. Ajuste las ramas para que los árboles queden colocados planos sobre la matriz extracelular, y separe las ramas agrupadas. Luego agregue un mililitro de medio de recolección en el fondo de cada pozo e incube las culturas durante la noche a 37 grados Celsius en un ambiente con 5% de dióxido de carbono.Doce a 16 horas después, agregue un mililitro del medio de cultivo adecuado en la parte superior de cada trans-bien. Antes de comenzar la infección, inocule una colonia individual de L. monocytogenes proveniente de una placa de agar infusión cerebral-cardíaca en tres mililitros de caldo infusión cerebral-cardíaca. Incube el cultivo durante la noche en posición inclinada a 30 grados Celsius para permitir que el crecimiento bacteriano alcance la fase estacionaria.A la mañana siguiente, utilice pinzas estériles para retirar cualquier fragmento de cultivo de órganos que flote y que no haya invadido la matriz extracelular, y aspire cuidadosamente el medio del fondo de cada cámara transwell. A continuación, pipete suavemente un mililitro de PBS tibio en las cámaras transwell superior e inferior, dos veces, eliminando cada lavado mediante aspiración cuidadosa. Después del segundo lavado, pipete suavemente un mililitro del medio adecuado en las cámaras transwell superior e inferior, teniendo cuidado de no perturbar los cultivos de órganos, y devuelva los cultivos al incubador durante una hora.Al final de la incubación, reemplace el medio en la parte superior de los transbolsillos con un mililitro de inóculo y coloque nuevamente las placas en el incubador de cultivo celular para facilitar la invasión bacteriana, reemplazando diariamente todo el medio en cada pocillo. Para los cultivos de órganos vellosos, es esencial diseccionar únicamente las ramas vellosas placentarias que terminan en columnas de citotrofoblasto extravilosas bien vascularizadas, de aspecto esponjoso o borroso. En contraste, los árboles vellosos cuya vascularización y citotrofoblastos extravilosos no son fácilmente visibles son subóptimos para el cultivo.El análisis de un cultivo de órganos vellosos a las 72 horas posteriores a la infección con Listeria monocytogenes muestra una elevada carga bacteriana en los citotrofoblastos extravillosos y una relativa escasez de bacterias dentro de la capa de sincitiotrofoblasto que recubre los vellosidades. En el caso de los cultivos de órganos deciduales, es importante saber que las muestras de las primeras etapas gestacionales consisten principalmente en decidua capsularis, fácilmente distinguible por su naturaleza delgada y membranosa, y decidua parietalis, que se recorta como se muestra y se utiliza para los cultivos. La tinción con hematoxilina y eosina (H y E) de cultivos organoides deciduales incluidos en parafina revela glándulas revestidas de epitelio y vasos sanguíneos revestidos de endotelio posicionados de manera heterogénea dentro del compartimento de células estromales deciduales.48 horas después de la infección, los macrófagos positivos para CD-14 se localizan cerca de la vasculatura y se distribuyen por todo el estroma deciduar, mientras que grandes agregados de listeria monocytogenes se agrupan predominantemente dentro del estroma. Una vez dominado, los cultivos de órganos pueden establecerse en menos de 60 minutos por muestra si se preparan adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la esterilidad en la cabina de cultivo de tejidos y al trabajar con el microscopio de disección.Tras su preparación, estos cultivos de órganos pueden infectarse con los patógenos bacterianos, fúngicos o virales pertinentes de interés, para responder preguntas adicionales sobre qué tipos celulares son más vulnerables a la infección. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los microbiólogos exploraran la patogénesis de las infecciones placentarias con patógenos clínicamente relevantes, como Listeria monocytogenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer cultivos orgánicos deciduales y vellosos en insertos de cultivo de tejidos tipo trans-well recubiertos con matriz extracelular.

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Este video demuestra el establecimiento de cultivos primarios de placenta humana, vellosidades y órganos deciduales en condiciones ex vivo. Estos modelos son muy adecuados para estudiar la patogénesis en la interfaz materno-fetal humana.

Establecimiento de cultivos de órganos vellosos y deciduales como modelos ex vivo de la interfaz materno-fetal humana

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección en tejidos placentarios para estudiar la propagación de la infección. Un cultivo de órganos placentarios ex vivo está infectado con Listeria monocytogenes, un parásito intracelular facultativo. Las bacterias invaden los trofoblastos extravellosos (EVT) para entrar en el tejido placentario y luego se propagan a otras células a través de la propagación de célula a célula.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en un cultivo de órganos ex vivo

En este trabajo se describe un protocolo para aislar y estudiar más a fondo los leucocitos infiltrantes de la decidua basalis y la decidua parietalis - la interfaz materno-fetal humana. Este protocolo mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y produce suficientes celdas viables para aplicaciones posteriores, como lo demuestra el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

En este trabajo se describe un protocolo para aislar y analizar los leucocitos infiltrantes de tejidos en la interfaz materno-fetal (útero, decidua y placenta) de ratones. Este protocolo mantiene la integridad de la mayoría de los marcadores de superficie celular y produce suficientes células viables para aplicaciones posteriores, incluido el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

A continuación se presenta un protocolo para el cultivo de explantes placentarios en condiciones de flujo constante. Este enfoque mejora los sistemas tradicionales de cultivo estático de vellosidades al permitir la replicación de entornos fisiológicos dinámicos.

Ex Vivo Cultivo de flujo de explante placentario: imitación de las condiciones dinámicas en el útero

Este protocolo describe la preparación de explantaciones de tejido placentario humano cultivadas en una interfaz aire-líquido para el estudio de infecciones virales.

Ex vivo Cultivo de explantes placentarios humanos para el estudio de la transmisión viral a través de la interfaz materno-fetal

La tuberculosis y la malaria son dos de las infecciones más prevalentes en los humanos y las principales causas de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. Hemos establecido un sistema de modelo experimental para estudiar los resultados de la coinfección tuberculosis-la malaria en ratones tras la exposición a ambos patógenos a través de su vía natural de infección.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Neisseria meningitidis es un patógeno específico humana que infecta a los vasos sanguíneos. En este protocolo microvasos humanos se introducen en un ratón mediante el injerto de piel humana en ratones inmunodeprimidos. Las bacterias se adhieren ampliamente a los vasos humanos, dando lugar a daño vascular y el desarrollo de la erupción purpúrica típicamente observado en casos humanos.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Aprende a establecer cultivos de órganos placentarios y deciduales humanos para estudiar infecciones en la interfase materno-fetal. Esta técnica mantiene la arquitectura tisular tridimensional y permite investigar patógenos como Listeria monocytogenes.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

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