La purificación de todo el genoma de ADN circular Extracromosómica a partir de células eucariotas
4 de abril de 2016
Este artículo presenta un método sensible llamado Circle-Seq para purificar el ADN circular extracromosómico (eccDNA). El método abarca la purificación en columna, la eliminación del ADN cromosómico lineal restante, la amplificación en círculo rodante y la secuenciación de alto rendimiento. Circle-Seq es aplicable al cribado a escala genómica del ECCDNA eucariota y al estudio de la inestabilidad del genoma y la variación del número de copias.
Purificación a nivel del genoma de ADN circular extracromosómico de células eucariotas. Hola, soy Rasmus. Aquí presentaré el esquema completo del método para la purificación de ADN circular.
En la primera parte, se cultivan y cosechan células de levadura. Luego, el ADN circular se purifica y amplifica en tres pasos. Primero, mediante separación por columna, donde se purifican y enriquecen los círculos de ADN.
Luego, mediante el tratamiento del ADN con exonucleasa para digerir todo el ADN lineal restante y, finalmente, mediante la amplificación de los círculos de ADN utilizando la polimerasa phi-29. En la quinta parte de este protocolo, los círculos de ADN se secuencian y las lecturas se alinean al genoma de referencia de Saccharomyces cerevisiae. Al final de este video, les mostraremos algunos resultados representativos.
Discutiremos las perspectivas para estudios futuros y las ventajas de utilizar este método. Parte uno, cosecha de células. El cultivo inicial se crece a 30 grados con agitación hasta alcanzar la densidad máxima, que es aproximadamente 200 millones de células por mililitro y se alcanza después de 24 a 48 horas.
El cultivo desarrollado se transfiere a un tubo Falcon y se centrifuga durante tres minutos para formar un pellet. Se elimina el sobrenadante. El pellet grande se vortexa en tampón TE y se centrifuga nuevamente para volver a formar un pellet.
Parte dos, purificación mediante columna. En este paso, utilizamos un kit comercialmente disponible para la purificación por columna que permite obtener plásmidos altamente purificados a partir de ADN bacteriano genómico. Antes de usar este kit con levadura, es necesario romper la pared celular.
Esto se realiza resuspendiendo el pellet celular lavado en tampón L-1 del kit. La suspensión celular se transfiere a un tubo de microcentrífuga y se añaden perlas de vidrio hasta un tercio del volumen total. La muestra se agita en vórtex a velocidad máxima durante 10 minutos y las perlas se eliminan por centrifugación a 2.000 revoluciones por minuto durante 30 segundos.
El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo. En este método, agregamos plásmidos altamente diluidos al sobrenadante en tres proporciones diferentes. Proponemos incluir plásmido altamente diluido en el ciclo.
Esto puede servir como guías de referencia interna. Puede utilizarlo para verificar la calidad de la purificación y amplificación del ADN, así como para realizar una estimación semicuantitativa de las moléculas de ADN no circulares por célula mediante estos plásmidos de control. Solo deben agregarse plásmidos altamente diluidos, ya que podrían afectar la resolución de secuencia de otros ADNs circulares.
La suspensión celular que contiene los plásmidos añadidos se trata con la solución L-2 del kit y se sigue el protocolo del kit. Después de cargar la columna, se eliminan las proteínas, lípidos y ADN cromosómico mediante dos lavados de la columna. El ADN circular extracromosómico se enriquece ampliamente en la fracción eluida.
Tercera parte, digestión de ADN lineal. En este paso, utilizamos una exonucleasa para digerir el ADN lineal remanente. Una exonucleasa dependiente de ATP dirige específicamente el ADN bicatenario y monocatenario lineal sin digerir el ADN circular.
La especificidad de la exonucleasa para el ADN lineal se confirmó mediante electroforesis en gel tras 29 horas de tratamiento con DNasa. Los resultados muestran que el ADN genómico es digerido mientras que el ADN plasmídico permanece, tal como indica la flecha roja. La levadura contiene 16 cromosomas, de hasta 1 500 kilobases de longitud.
Para facilitar la digestión por exonucleasa, se utiliza una endonucleasa de corte raro para obtener un mayor número de extremos de ADN accesibles. Si se emplea la enzima de restricción basada en ate, NotI, cada cromosoma se corta hasta siete veces, como se indica. El ADN purificado por columna se trata con NotI a 37 grados en un bloque térmico durante la noche.
Después de la inactivación térmica de NotI, el ADN cortado se trata con exonucleasas a 37 grados según el protocolo del fabricante. Después del tratamiento con exonucleasas, las enzimas se inactivan por calor a 70 grados durante 30 minutos. Pueden transcurrir varios días para digerir todo el ADN cromosómico lineal mediante ATP adicional y exonucleasa. Para asegurar que todo el ADN lineal se ha digerido completamente, las muestras se analizan mediante métodos de PCR o qPCR utilizando un gen de referencia interno como ACTI.
Paso cuatro, amplificación del ADN. En este paso, enriquecemos y amplificamos el ADN circular utilizando la polimerasa phi-29. La reacción tiene lugar a 30 grados utilizando oligonucleótidos hexaméricos aleatorios y phi-29.
La polimerasa tiene una alta fidelidad y actividad de corrección de pruebas, lo que garantiza una amplificación de ADN imparcial. Cada polimerasa puede, mediante la replicación en círculo rodante, sintetizar hasta 100 kilobases de ADN. La polimerasa también es altamente procesiva, amplificando el ADN hasta 10 a la novena potencia.
Paso cinco, secuenciación. Siguiendo el protocolo para una plataforma de secuenciación de nueva generación de alto rendimiento, el ADN se sonicó hasta un tamaño promedio de 300 pares de bases y se secuenció como lecturas simples de 141 nucleótidos. Las lecturas de secuencia se alinean contra el genoma de referencia de Saccharomyces cerevisiae utilizando la base de datos gratuita Galaxy.
Los datos secuenciados se cargan en Galaxy y las lecturas se alinean utilizando el alineador de lecturas cortas Bowtie2, que permite el mapeo de lecturas parciales. Parte seis, resultados representativos. Después del secuenciamiento y el mapeo al genoma de referencia de Saccharomyces cerevisiae, las lecturas pueden visualizarse en el navegador genómico dentro del software Galaxy.
El ADN de origen circular puede, por ejemplo, contarse como regiones que contienen lecturas coherentes mayores a un kilobase, tal como se indica en la pantalla. Un ejemplo de una región en el cromosoma cuatro que contiene lecturas coherentes que abarcan más de un kilobase es la región con los genes del transportador de hexosas seis y siete. Al utilizar este método en una población de células de levadura, con frecuencia se encuentran lecturas mapeadas en este locus y la cobertura de lecturas sugiere claramente que se ha formado un círculo de ADN entre los genes parálogos del transportador de hexosas.
Debido a la alta homología de secuencia entre los genes de transportadores de hexosas, proponemos que la recombinación homóloga ilegítima conduce a la circularización de este ADN. El modelo para la mutación de ADN circular ocurre cuando el proceso de reparación de ADN se lleva a cabo de forma imperfecta. Por ejemplo, si se produce una rotura de doble cadena en un elemento repetitivo, entonces la secuencia homóloga en el mismo cromátida puede utilizarse como molde para la reparación del ADN mediante recombinación homóloga.
Después de la resección, la invasión de la hebra, la síntesis de ADN y la resolución de todas las uniones, un círculo de ADN puede formarse a partir del genoma, provocando una deleción de ADN en el cromosoma. Los efectos de tratar el ADN con exonucleasas y polimerasa phi-29 se pueden visualizar utilizando tinción con yoduro de propidio. Los controles de tinción del ADN genómico aparecen como en la imagen izquierda, mientras que el ADN plasmídico aparece como en la imagen derecha.
Después de 29 horas de tratamiento con exonucleasa de 400 nanogramos de ADN genómico, la mayoría del ADN se degrada, como se indica en la imagen izquierda. Este resultado se confirma mediante electroforesis en gel, como se muestra en la imagen del gel a la derecha. Después de 72 horas de tratamiento con exonucleasa seguido de la síntesis de AD por la polimerasa phi-29, aún pueden identificarse millones de copias de ADN.
Asimismo, tras 29 horas de tratamiento con exonucleasa de 400 nanogramos de ADN genómico, más 100 nanogramos adicionales de ADN plasmídico, la mayor parte del ADN genómico se degrada. Sin embargo, el ADN plasmídico no se degrada, tal como indica la imagen de electroforesis. Tras el tratamiento con la polimerasa phi-29 de la muestra tratada con exonucleasa durante 72 horas, la mayor parte del ADN amplificado aparece como plásmidos teñidos.
Así que primero analizamos genes en busca de ADN circular y nos sorprendió mucho encontrar varios cientos de tipos diferentes de muestras de ADN. Sí, fue realmente sorprendente descubrir lo comunes que son los círculos de ADN en la población de levaduras, y creemos que este método puede utilizarse para muchos tipos de estudios. Obviamente, uno de ellos sería analizar tejido humano.
Sabemos que un gen puede amplificarse en elementos circulares en levaduras, por supuesto, e incluso en células tumorales. Creo que en general será interesante examinar las células somáticas e investigar qué tipos de ADN circular vamos a encontrar allí y cómo podríamos influir en este efecto. En las células envejecidas tenemos círculos que se acumulan con la edad y esperamos encontrar más genes en el ADN circular.
Y además, nos gustaría analizar los mecanismos moleculares de la circularización del ADN, y lo obvio sería estudiar la levadura, donde disponemos de mutantes defectuosos en la recombinación homóloga y en la no homóloga. Al analizar estos mutantes, esperamos que el perfil de circularización del ADN sea diferente según el tipo de mutante, y con suerte, a partir de los estudios en levadura podremos aprender mucho más sobre la circularización del ADN. Por lo tanto, en comparación con otros métodos, este es mucho más sensible y podría permitir encontrar el círculo de ADN en aproximadamente una de cada 10.000 células.
Y, hasta donde sé por estudios de ensayos realizados extensamente, normalmente los alelos mutantes deben alcanzar una proporción del 1 al 10 % de la población antes de que puedan detectarse. Correcto, y con esta técnica no se necesita ningún conocimiento previo sobre los círculos de ADN formados, a diferencia de otras técnicas donde los círculos de ADN deben estar algo amplificados y luego pueden detectarse fácilmente como amplificaciones mediante secuenciación o tinción cromosómica.
Sí, entonces supongo que realmente la principal ventaja es la sensibilidad y espero que podamos hacer muchas cosas interesantes con este método.
Resumen
Este artículo presenta Circle-Seq, un método sensible y robusto para la purificación, amplificación y detección a nivel del genoma completo de ADN circular extracromosómico (eccDNA) en Saccharomyces cerevisiae. El protocolo combina la purificación mediante columnas, digestión extensiva con exonucleasa, amplificación mediante ciclo rodante y secuenciación de nueva generación para permitir un perfilado integral de las poblaciones de eccDNA. El método revela la prevalencia y diversidad de los eccDNA y ofrece una amplia aplicabilidad para estudios sobre la estabilidad y evolución del genoma eucariota.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genética molecular
- Genómica
- Purificación y secuenciación de ADN
Antecedentes
- Los ADN circulares extracromosómicos (eccADN) son comunes en levaduras y otros eucariotas.
- Los eccADN contribuyen a la variación genética y pueden influir en la estabilidad y evolución del genoma.
- Los métodos existentes para la detección de eccADN carecen de sensibilidad o requieren conocimiento previo de las secuencias diana.
- Se necesitan métodos de detección mejorados para estudiar la formación y función de los eccADN.
Objetivo del estudio
- Desarrollar y validar un método sensible y de genoma completo para la purificación y detección de ADNcc.
- Caracterizar la diversidad y abundancia de ADNcc en poblaciones de levaduras.
- Proporcionar un protocolo aplicable a otros sistemas eucariotas.
Métodos Utilizados
- Crecimiento y cosecha de células de levadura a alta densidad.
- Purificación basada en columnas de ADN circular, que incluye la ruptura de la pared celular y la eliminación de proteínas, lípidos y ADN cromosómico.
- Digestión extensiva con exonucleasas (con tratamiento previo con endonucleasas de corte raro) para degradar el ADN lineal mientras se preserva el ADN circular.
- Amplificación por ciclo rodante de eccADN utilizando la polimerasa phi-29 y hexámeros aleatorios.
- Secuenciación de alto rendimiento y mapeo de lecturas al genoma de referencia de levadura mediante Bowtie2 y visualización en la plataforma Galaxy.
- Inclusión de controles internos de plásmidos adicionados altamente diluidos para evaluación de calidad y cuantificación.
Resultados principales
- Se detectaron cientos de especies distintas de eccADN mayores de 1 kb en poblaciones de levaduras.
- La identificación repetida de genes específicos (por ejemplo, ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7) en ADN circular en diferentes cepas de levaduras sugiere loci conservados para la circularización del ADN.
- El método demostró una alta sensibilidad, detectando eccADN presentes en tan solo 1 de cada 10.000 células.
- La amplificación por ciclo rodante y el tratamiento con exonucleasa enriquecieron eficazmente el ADN circular y eliminaron el ADN lineal, tal como se confirmó mediante electroforesis en gel y tinción.
Conclusiones
- Circle-Seq permite la detección sensible, imparcial y de todo el genoma de las ADNc extracromosómicas en células eucariotas.
- El método es ampliamente aplicable para estudiar la diversidad de ADNc, sus mecanismos de formación y sus funciones en la estabilidad y evolución del genoma.
- Circle-Seq puede adaptarse para su uso en otros organismos, incluyendo tejidos humanos y células tumorales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La purificación y caracterización a nivel del genoma del ADN circular extracromosómico (eccDNA) permite a los equipos de biofármacos investigar la estabilidad del genoma, la variación somática y los mecanismos adaptativos en sistemas eucariotas. El flujo de trabajo Circle-Seq ofrece una detección sensible e imparcial del eccDNA, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas y la validación de dianas en las fases iniciales del descubrimiento y la investigación traslacional. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en las decisiones del portafolio cuando la plasticidad genómica o las reorganizaciones del ADN puedan afectar las estrategias terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la cartografía integral del eccDNA para aclarar los mecanismos de reordenamiento genómico.
- Apoya la validación funcional de dianas al revelar loci propensos a circularización y variación genética.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos en sistemas donde la inestabilidad del genoma puede dificultar la evaluación de dianas.
- Proporciona una detección imparcial, reduciendo la dependencia del conocimiento previo sobre alteraciones genómicas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara muestras altamente purificadas de ADN circular para flujos de trabajo de secuenciación y análisis posteriores.
- Normaliza la preparación de muestras con controles internos para garantizar la reproducibilidad y la evaluación cuantitativa.
- Permite el cribado escalable y de alto rendimiento de perfiles de ADN ecc en poblaciones celulares.
- Proporciona resultados cuantitativos adecuados para análisis comparativos y optimización de ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades al permitir la detección de eccDNA en diversos modelos eucariotas.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento de marcadores de inestabilidad genómica.
- Proporciona información ajustada al riesgo para avanzar en candidatos donde la eccDNA podría influir en el fenotipo o la resistencia.
- Facilita el descubrimiento de biomarcadores relacionados con la plasticidad y adaptación del genoma.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Circle-Seq se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir el perfilado de eccADN a nivel del genoma completo, desde la prueba temprana de hipótesis hasta la investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la estabilidad del genoma y los mecanismos adaptativos mediante la detección imparcial de eccDNA.
- Tamizaje: Proporciona perfiles cuantitativos y reproducibles de eccDNA para tamizajes comparativos entre condiciones o líneas celulares.
- Análisis: Ofrece datos de secuenciación de alta resolución y resultados de mapeo para análisis estadísticos rigurosos.
- Investigación Traducional: Permite el seguimiento del eccDNA como biomarcadores potenciales en modelos de enfermedad o estudios del envejecimiento.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo ampliamente aplicable y sensible, adaptable a múltiples sistemas eucariotas y preguntas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas y estudios mecanicistas que involucran inestabilidad genómica.
- Valor operativo: Estandariza la purificación y detección de ADNec con controles internos y protocolos escalables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al aclarar los factores de riesgo genómicos y el potencial adaptativo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas en los que el ADNec pueda influir en la respuesta terapéutica o la resistencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular, purificación de ADN y análisis de secuenciación de nueva generación.
- Necesita acceso a polimerasas de alta fidelidad, exonucleasas e infraestructura de secuenciación.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para la preparación de muestras y el análisis de datos.
- Adaptable a diversos modelos eucariotas, aunque puede requerir optimización del protocolo para tejidos o tipos celulares específicos.
- Los tratamientos extensivos con exonucleasa y los pasos de control de calidad son fundamentales para la eliminación confiable del ADN lineal.
