El uso de una batería de químicos y ecotoxicológicos Métodos para la Evaluación de la eficacia de procesos de tratamiento de aguas residuales para quitar potencia estrogénica

El objetivo general de la batería de pruebas descritas aquí, incluida la química analítica y los métodos in vitro e in vivo, es determinar la eficacia de las tecnologías de tratamiento de aguas residuales emergentes y novedosas para eliminar los contaminantes estrogénicos. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en ingeniería ambiental, por ejemplo, al seleccionar los procesos de tratamiento de aguas residuales más efectivos en una potencia estrogénica móvil de aguas residuales. La principal ventaja de estas técnicas, es que son sensibles a concentraciones muy bajas de compuestos activos, evidenciando así, las mejores tecnologías para proteger la vida acuática.

Los procedimientos demostrarán la becaria postdoctoral, el Dr. Chris Green, la estudiante de posgrado, Angela Pinzon, la becaria de investigación, la Dra. Alice Baynes, y la técnica de investigación superior, Nicola Beresford. El proceso SPE requiere una gran atención a la limpieza y el orden para evitar la contaminación de la muestra. Limpie previamente todos los tubos, grifos y fritas con metanol.

Antes de procesar las muestras, conecte las líneas de transferencia al colector de extracción y enjuague todo el sistema con agua desionizada. Para procesar las muestras, primero coloque los revestimientos de válvulas desechables, luego coloque los cartuchos SPE de estireno divinilbenceno. A continuación, pipetee cinco mililitros de acetato de etilo en cada depósito para acondicionar los cartuchos.

Durante este paso, asegúrese de que el SPE esté sellado. A continuación, encienda la bomba de vacío para obtener un caudal de 10 milímetros por minuto. Antes de que los cartuchos se sequen, cargue cinco mililitros de metanol, seguidos de cinco mililitros de agua.

Es muy importante que los cartuchos SPE no se sequen. Una vez que el agua haya pasado en su mayor parte, apague la bomba y rellene cada depósito de cartucho con agua. Luego, conecte tubos de PTFE de 1/8 de pulgada entre los depósitos de cartucho y las botellas de muestra de vidrio.

Ahora, cambie el vacío a un caudal inferior a 10 mililitros por minuto y permita que toda la muestra pase a través del cartucho. A continuación, seque bien los cartuchos SPE, hasta que el contenido del cartucho cambie de color. Utilice una aspiradora o un chorro de gas.

Ahora, cargue viales de recolección de vidrio limpios y secos de 10 mililitros en una rejilla y coloque la rejilla dentro del colector de extracción. Compruebe que cada revestimiento esté encima de un vial. Cargue los depósitos de muestra con dos veces cuatro mililitros, para un total de ocho mililitros de diclorometano, encienda la bomba de vacío y deje que el líquido pase a través del SPE y hacia los viales de recolección.

A continuación, utilice un concentrador para reducir el volumen de todos los viales de recogida a un mililitro. Transfiera cada muestra a un vial de muestreador automático y concéntrelas hasta 100 microlitros, utilizando un equipo de purga de nitrógeno. La siguiente etapa en el proceso es usar GPC para eliminar las interferencias macromoleculares.

Primero, inyecte 95 microlitros del extracto de muestra eluido, en la HPLC equipada con GPC. Concentre el extracto de GPC hasta 200 microlitros, usando un concentrador y el aparato de purga de nitrógeno, y luego llénelo hasta dos mililitros con hexano. A continuación, conecte los revestimientos de válvulas desechables, los cartuchos de amino púrpura y los depósitos de cartuchos al colector SPE y a través de los viales de recolección de vidrio de 10 mililitros.

Ahora, cargue dos mililitros de hexano en cada cartucho, para acondicionarlos y desechar el solvente. A continuación, cargue el extracto de muestra de GPC en el depósito y succiónelo. Deje la recolección de extractos a un lado y vuelva a colocar el vial en la rejilla para recoger el lavado.

A continuación, pase dos mililitros de acetato de etilo y hexano del 30 por ciento volumen por volumen a través del cartucho. Luego, agregue dos mililitros más de acetato de etilo y hexano, luego deseche las colecciones de solución de lavado y devuelva el vial de recolección de 10 mililitros a la rejilla. Ahora, agregue dos mililitros de 50 por ciento de volumen por volumen de acetato de etilo y acetona en el depósito, y encienda la bomba a un caudal bajo, por debajo de dos mililitros por minuto.

Después de que el líquido se filtre, agregue otros dos mililitros de acetato de etilo al 50 por ciento al depósito. Ahora, use un concentrador para reducir el volumen del extracto a un mililitro. Luego, transfiera la muestra a un vial de vidrio más pequeño y use un equipo de purga de nitrógeno para evaporar el extracto a incipiente para agregar 100 microlitros de metanol, mezcle bien la muestra y transfiera a un vial de muestreador automático con un inserto de 0,3 mililitros.

A continuación, realice el análisis LC-MS/MS del extracto. El día antes de comenzar el ensayo, prepare un medio de crecimiento fresco e inocule con el muelle tenax de la cepa HER utilizada. Al día siguiente, prepárese para el ensayo, haciendo delirios en serie de 100 microlitros de los productos químicos de prueba o extractos de efluentes, y luego una curva estándar E2 en etanol.

Ahora, transfiera 10 alícuotas de microlitros a una placa estéril de 96 pocillos etiquetada. Luego, deje la placa destapada para evaporar el etanol. A continuación, prepare 50 mililitros de medio de crecimiento, con 0,5 mililitros de solución CPRG.

A partir del cultivo de levadura de 24 horas, mida la turbidez a 620 nanómetros para estimar la densidad celular. A continuación, añada 40 millones de células de levadura a los 50 mililitros de medio de ensayo. Transfiera el medio de ensayo inoculado a un canal estéril y utilice una pipeta multicanal para transferir 200 microlitros de medio a cada pocillo de la placa de ensayo.

Vuelva a colocar la tapa de la placa de ensayo, selle los bordes con cinta adhesiva y agite vigorosamente la placa de ensayo durante dos minutos con un agitador de placas. A continuación, incuba la placa a 32 grados centígrados, en un armario calefactor con ventilación natural. Después de tres días de incubación, repita el batido nuevamente y luego deje que la levadura se asiente durante aproximadamente una hora.

Por último, mida los absorbentes de luz por las muestras, a 540 y 620 nanómetros. Las muestras de agua de un plan convencional de tratamiento de aguas residuales para activar su proceso de lodos, se analizaron utilizando electrospray de iones negativos LCMS, el etinilestradiol estaba presente a una concentración superior al nivel de ningún efecto pronosticado. Utilizando un tratamiento avanzado del agua, como el carbón activado granulado, o GAC, fue posible reducir sustancialmente los niveles de etinilestradiol.

Todos los extractos de aguas residuales se analizaron con un patrón interno marcado isotópicamente, pico rojo, para permitir la cuantificación. El ensayo de cribado de levadura a estrógeno fue claramente sensible al estradiol estándar, pero no eligió ninguna respuesta al etanol, que es esencialmente el blanco. Las celdas de cribado de levadura respondieron claramente al efluente del proceso de lodo activado, mientras que el efluente tratado con GAC produjo una respuesta disminuida, aún así fue biológicamente más activo que el blanco.

Utilizando esta novedosa tecnología de tratamiento de aguas residuales, tanto la concentración de etanol estradiol, que se muestra en azul, como la actividad estrogénica, que se muestra en verde, se redujeron significativamente mediante el tratamiento combinado de peróxido de hidrógeno y TAML. Las plantas de tratamiento de aguas residuales son la principal fuente de contaminación de las aguas superficiales con sustancias estrogénicas. Las nuevas formas en que los procesos de tratamiento de agua mejoran estos efluentes requieren pruebas en profundidad de la actividad estrogénica.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de una batería de pruebas químicas y de ecotoxicología, necesarias para medir la actividad estrogénica en muestras de agua. Es extremadamente importante asegurarse de que la contaminación de las muestras y extractos se minimice con un manejo cuidadoso de las muestras y extractos. Por ejemplo, los plásticos de uso común contienen compuestos estrogénicos, por lo que es fundamental incluir controles negativos para comprobar la contaminación química, y controles positivos para comprobar que el método de extracción ha funcionado y que hay una buena recuperación de los estrógenos enriquecidos.