El uso de una batería de químicos y ecotoxicológicos Métodos para la Evaluación de la eficacia de procesos de tratamiento de aguas residuales para quitar potencia estrogénica

El objetivo general de la batería de pruebas descritas aquí, que incluyen métodos de química analítica y técnicas in vitro e in vivo, es determinar la eficacia de tecnologías emergentes y novedosas de tratamiento de aguas residuales para eliminar contaminantes estrogénicos. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en ingeniería ambiental, por ejemplo, al seleccionar los procesos de tratamiento de aguas residuales más eficaces frente a una potencia estrogénica variable en las aguas residuales. La principal ventaja de estas técnicas es que son sensibles a concentraciones muy bajas de compuestos activos, evidenciando así las mejores tecnologías para proteger la vida acuática.

Los procedimientos serán demostrados por el becario postdoctoral, el Dr. Chris Green, la estudiante de posgrado, Angela Pinzon, la becaria de investigación, la Dra. Alice Baynes, y la técnica superior de investigación, Nicola Beresford. El proceso de SPE requiere una atención rigurosa a la limpieza y el orden para prevenir la contaminación de las muestras. Limpie previamente todos los tubos, grifos y fritas con metanol.

Antes de analizar las muestras, conecte las líneas de transferencia al manifold de extracción y enjuague todo el sistema con agua desionizada. Para analizar las muestras, primero coloque los revestimientos desechables de la válvula y luego conecte los cartuchos de SPE de estireno-divinilbenceno. A continuación, pipetee cinco mililitros de acetato de etilo en cada depósito para acondicionar los cartuchos.

Durante este paso, asegúrese de que el SPE esté sellado. Luego, encienda la bomba de vacío para obtener un caudal de 10 milímetros por minuto. Antes de que los cartuchos se sequen, cargue cinco mililitros de metanol, seguidos de cinco mililitros de agua.

Es muy importante que las cartuchas de EPE no se sequen. Después de que el agua haya pasado casi por completo, apague la bomba y rellene cada depósito de la cartucha con agua. A continuación, conecte tubos de PTFE de 1/8 de pulgada entre los depósitos de las cartuchas y los frascos de vidrio para muestras.

Ahora, cambie el vacío a un caudal inferior a 10 mililitros por minuto y permita que toda la muestra pase a través del cartucho. A continuación, seque completamente los cartuchos de extracción en fase sólida hasta que el contenido del cartucho cambie de color. Utilice un vacío o una corriente de gas.

Ahora, cargue viales de vidrio limpios y secos de 10 mililitros en un portaviales y coloque el portaviales dentro del manifold de extracción. Verifique que cada inserto esté sobre un vial. Cargue los depósitos de muestra con dos veces cuatro mililitros, para un total de ocho mililitros de diclorometano, encienda la bomba de vacío y deje que el líquido pase a través de la SPE y entre en los viales de recolección.

Luego, utilice un concentrador para reducir el volumen de todos los viales de recolección a un mililitro. Transfiera cada muestra a un vial de muestreador automático y concéntrela aún más hasta 100 microlitros, utilizando equipo de evaporación con nitrógeno. La siguiente etapa del proceso consiste en usar la CLG para eliminar interferencias macromoleculares.

Primero, inyecte 95 microlitros del extracto de muestra eluida en el HPLC equipado con GPC. Concentre el extracto de GPC hasta 200 microlitros utilizando un concentrador y el equipo de evaporación con nitrógeno, y luego complete hasta dos mililitros con hexano. A continuación, coloque forros desechables para válvulas, cartuchos de amino púrpura y depósitos para cartuchos en el manifold de SPE, así como los viales de recolección de vidrio de 10 mililitros.

Ahora, cargue dos mililitros de hexano en cada cartucho para acondicionarlos y deseche el disolvente. A continuación, cargue el extracto de la muestra de GPC en el depósito y hágalo pasar mediante succión. Aparte el extracto recolectado y sustituya el vial en el soporte para recolectar el lavado.

A continuación, pase dos mililitros de acetato de etilo y hexano al 30 por ciento en volumen a través del cartucho. Luego, agregue otros dos mililitros de acetato de etilo y hexano, deseche las recolecciones del líquido de lavado y devuelva el vial recolector de 10 mililitros al soporte. Ahora, agregue dos mililitros de acetato de etilo y acetona al 50 por ciento en volumen al depósito y encienda la bomba a un flujo bajo, inferior a dos mililitros por minuto.

Después de que el líquido pase, agregue otros dos mililitros de acetato de etilo al 50 por ciento al depósito. Ahora, utilice un concentrador para reducir el volumen del extracto a un mililitro. A continuación, transfiera la muestra a un vial de vidrio más pequeño y use equipo de evaporación con nitrógeno para evaporar el extracto hasta incipiente. Agregue 100 microlitros de metanol, mezcle bien la muestra y transfiérala a un vial para autosampler con un inserto de 0,3 mililitros.

Luego, realice el análisis por LC-MS/MS del extracto. El día anterior a la iniciación del ensayo, prepare medio de crecimiento fresco e inocúlelo con el tenáculo del cepa HER utilizado. Al día siguiente, prepare el ensayo realizando diluciones seriadas de 100 microlitros de los productos químicos de prueba o extractos de efluentes, y luego la curva patrón de E2 en etanol.

Ahora, transfiera alícuotas de 10 microlitros a una placa estéril de 96 pocillos etiquetada. Luego, deje la placa destapada para que el etanol se evapore. A continuación, prepare 50 mililitros de medio de crecimiento, con 0,5 mililitros de solución CPRG.

De la cultura de levaduras de 24 horas, mida la turbidez a 620 nanómetros para estimar la densidad celular. Luego, agregue 40 millones de células de levadura al medio de ensayo de 50 mililitros. Transfiera el medio de ensayo inoculado a una cubeta estéril y utilice una pipeta multicanal para transferir 200 microlitros de medio a cada pocillo de la placa de ensayo.

Sustituya la tapa de la placa de ensayo, selle los bordes con cinta y agite vigorosamente la placa de ensayo durante dos minutos utilizando un agitador de placas. Luego, incube la placa a 32 Celsius, en un gabinete de calentamiento con ventilación natural. Después de tres días de incubación, repita la agitación y luego deje que la levadura sedimente durante aproximadamente una hora.

Finalmente, mida la absorción de luz por las muestras a 540 y 620 nanómetros. Se analizaron muestras de agua de una planta convencional de tratamiento de aguas residuales para activar su proceso de lodo activado, utilizando LCMS con ionización por electrospray en modo ión negativo; se detectó etinilestradiol a una concentración superior al nivel predicho sin efecto. Mediante tratamientos avanzados del agua, como carbón activado granular o GAC, fue posible reducir sustancialmente los niveles de etinilestradiol.

Todos los extractos de aguas residuales se analizaron con un estándar interno marcado isotópicamente, pico rojo, para permitir la cuantificación. El ensayo de detección de levaduras a estrógenos fue claramente sensible al estradiol estándar, pero no mostró ninguna respuesta frente al etanol, que es esencialmente el blanco. Las células de detección de levaduras respondieron claramente al efluente del proceso de lodo activado, mientras que el efluente tratado con carbón activado granular produjo una respuesta reducida, aunque aún era más biológicamente activo que el blanco.

Mediante esta novedosa tecnología de tratamiento de aguas residuales, tanto la concentración de etanol estradiol, mostrada en azul, como la actividad estrogénica, mostrada en verde, se redujeron significativamente con el tratamiento combinado de peróxido de hidrógeno y TAML. Las plantas de tratamiento de aguas residuales son la principal fuente de contaminación del agua superficial con sustancias estrogénicas. Se requieren pruebas exhaustivas de la actividad estrogénica para evaluar nuevas formas de mejorar estos efluentes mediante procesos de tratamiento del agua.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de una batería de pruebas químicas y ecotoxicológicas necesarias para medir la actividad estrogénica en muestras de agua. Es extremadamente importante asegurarse de que la contaminación de las muestras y extractos se minimice mediante un manejo cuidadoso de las mismas. Por ejemplo, los plásticos comúnmente utilizados contienen compuestos estrogénicos; por lo tanto, es esencial incluir controles negativos para verificar la contaminación química y controles positivos para comprobar que el método de extracción haya funcionado y que exista una buena recuperación de los estrógenos añadidos.