Name: La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprende a cultivar macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados con M-CSF mediante criopreservación y elutriación centrífuga. Este protocolo mejora la disponibilidad celular y reduce la variabilidad entre donantes para estudios de biología inmunológica.

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El Departamento de Medicina Transfusional, Centro Clínico, Institutos Nacionales de Salud, proporcionó monocitos elutriados. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros, Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, Institutos Nacionales de Salud.

Leucoféresis se llevó a cabo bajo el protocolo de investigación de un sujeto humano aprobado por los Institutos Nacionales de Salud junta de revisión institucional. 1. Aislamiento y la criopreservación de los monocitos <ol><li> Obtener células mononucleares por leucoféresis de donantes humanos, y enriquecer los monocitos por centrifugación de contracorriente continua de elutriación de las células mononucleares tal como se describe en las referencias 7,8. Obtener aproximadamente 100 x 10 6 células elutriated (aproximadamente 80 - 90% monocitos) en tampón de elutriación especificado por el fabricante. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> monocitos de centrífuga en un tubo de polipropileno de 15 ml a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las células suavemente en FBS seguido de sulfóxido de dimetilo para lograr una concentración final de 90% de FBS / 10% de dimetilsulfóxido y 50 x 10 6 células / ml. </li><li> Añadir cada ml de suspensión de células to un criovial individual. </li><li> Coloque los crioviales en un recipiente de congelación de células y la transferencia a un congelador a -80ºC durante 24 horas antes de transferir a un tanque de almacenamiento criovial nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 2. La diferenciación de monocitos en macrófagos <ol><li> Descongelar un criovial de las células mediante la transferencia rápidamente a un baño de agua C 37 ° y luego retirar inmediatamente cuando la suspensión de células se ha descongelado sobre 70%. </li><li> Inmediatamente después de la descongelación completa a temperatura ambiente, transferir 1 ml contenidos criovial en 50 ml de 37 ° C se calentó Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleucina-10 (IL-10), y 10% de FBS (medio completo). </li><li> 25 ml de la suspensión de monocitos en cada uno de dos 75 cm 2 frascos de cultivo celular de plástico. </li><li> Incubar culturas en un 37 ° C incubadora de cultivo de células con 5% de CO2 / 95% de aire durante 48 hr. </li><li> Enjuague el cultures 3 veces con 10 ml de medio RPMI 1640 (pre-calentado a 37 ° C), eliminando suavemente el medio de cultivo para evitar que se desprenda cualquier célula poco adheridas. </li><li> Tras el aclarado, se añade medio completo fresco, el cambio de medio cada 2 días hasta que los monocitos se diferencian y proliferan suficientemente para convertirse en confluentes. Esto requiere aproximadamente una semana de cultivo. </li></ol> 3. Los macrófagos de cosecha para iniciar experimentos <ol><li> Enjuague los macrófagos diferenciados en un matraz de 3 veces con 10 ml de pre-calentado solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 37 ° C sin Ca 2+ y Mg 2+ antes de añadir 10 ml de solución de pre-calentado (EDTA) 37 ° C 0,25% de ácido etilendiaminotetraacético tripsina. </li><li> Place matraz en una incubadora de cultivo celular durante 10 - 15 min, en cuyo momento aproximadamente 90% de los macrófagos debería haber redondeado y distante. Verificar esta por examen microscópico del matraz. </li><li> Añadir 10 ml de RPMI 1640 que contiene 10% de FBS a sla parte superior de la tripsinización. </li><li> Transferir la suspensión celular de macrófagos del matraz en un tubo de 50 ml de polipropileno, de centrifugación 300 xg durante 5 min, y descartar el sobrenadante. </li><li> resuspender suavemente los macrófagos en 1 ml de medio completo. </li><li> Mezclar 10 l de suspensión celular de macrófagos con 10 l solución de azul de tripano y determinar el número de células de macrófagos y la viabilidad (típicamente&gt; 95%) utilizando un hemocitómetro. </li><li> Basado en el número de células (por lo general alrededor de 15 - 18 x 10 5 macrófagos), añadir medio completo adicional para alcanzar la densidad celular de siembra deseada. Nota: 1 x 10 5 macrófagos en 1,5 ml de medio por pocillo de una placa de 12 pocillos producirá una cultura casi confluentes. </li><li> Después de la siembra, incubar los macrófagos durante la noche en un 37 ° C incubadora de cultivo celular con 5% de aire de CO2 / 95% para permitir la unión celular. A continuación, iniciar los experimentos deseados. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La generación de los tipos definidos de macrófagos puede aclarar algunos de los resultados contradictorios obtenidos por los investigadores en el estudio de la biología de los macrófagos. El uso de varias condiciones de cultivo y los factores de diferenciación para generar los macrófagos humanos primarios pueden conducir a muy diferentes tipos de macrófagos, un hecho que no se puede apreciar por el investigador. Por ejemplo, los macrófagos a veces se generan a partir de monocitos humanos usando no suero, suero humano so...

El estudio de macrófagos cultivados es un modelo útil para comprender la función de estas células en la inflamación, tal como ocurre en las placas ateroscleróticas. Cuando la investigación se centra en enfermedades humanas que afectan a los macrófagos, es útil estudiar los macrófagos humanos primarios en lugar de los macrófagos no humanos para evitar diferencias entre especies. Además, los efectos de la transformación celular se pueden evitar mediante el uso de macrófagos primarios en lugar de líneas celulares de macrófagos. Para ello, los macrófagos diferenciados de los monocitos aislados de la sangre humana sirven como medio para obtener macrófagos humanos primarios. 
Los macrófagos tisulares pueden residir dentro de los tejidos o pueden derivarse de monocitos que migran al tejido y se diferencian en macrófagos 1. Se han definido dos tipos de macrófagos derivados de monocitos humanos que difieren no solo en la morfología, sino también en la expresión génica y la función celular 2. Estos dos tipos se obtienen a partir de monocitos que se diferencian en macrófagos en presencia de M-CSF + suero fetal bovino (FBS) y monocitos que se diferencian en macrófagos en presencia de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) + FBS 2-6. En nuestra experiencia (observación no publicada), el uso de suero humano en lugar de FBS genera el tipo GM-CSF, independientemente de si M-CSF o GM-CSF se incluyen en el medio de diferenciación. Los macrófagos de tipo M-CSF tienden a ser más alargados que los macrófagos de tipo GM-CSF, que se asemejan a los huevos fritos en su morfología. Los investigadores deben reconocer que los macrófagos derivados de monocitos M-CSF y GM-CSF humanos no son lo mismo que los llamados macrófagos derivados de la médula ósea de ratón M1 y M2 6.
Durante la investigación utilizando macrófagos diferenciados M-CSF derivados de monocitos humanos, experimentamos dificultades relacionadas con la disponibilidad de monocitos para iniciar experimentos y la variación en las densidades celulares obtenidas de macrófagos durante la diferenciación de monocitos en macrófagos. Para superar estos problemas, hemos desarrollado el siguiente protocolo en el que los monocitos se congelan hasta que se requiere su uso, y los monocitos se diferencian a granel en macrófagos que luego se pueden eliminar de los matraces de cultivo y sembrar a las densidades celulares deseadas para obtener cultivos más uniformes de un experimento a otro.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo Cellbind de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, matraz T-75, tratamiento para cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-One North America 658157</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio de cultivo</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>calentado a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Criovial&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>DPBS sin Ca2+ y Mg2+&nbsp;</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro de luz brillante mejorado Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td>610031 http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>Congelación celular CoolCell LX contenedor</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>otros contenedores de congelación también deberían&nbsp; ser adecuados para este paso</td></tr><tr><td>Sistema de almacenamiento de nitrógeno líquido, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>Cualquier tanque de nitrógeno líquido debe ser adecuado</td></tr></tbody></table>

la cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Para el inicio de los experimentos, los monocitos frescos o congelados se cultivan en matraces durante 1 semana con M-CSF para inducir su diferenciación en macrófagos. Luego, los macrófagos se pueden cosechar y sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos. El uso de un número definido de macrófagos en lugar de un número definido de monocitos para iniciar cultivos de macrófagos para experimentos produce cultivos de macrófagos en los que la densidad celular deseada se puede lograr de manera más consistente. El uso de monocitos criopreservados reduce la dependencia de la disponibilidad del donante y produce cultivos de macrófagos más homogéneos.

La viabilidad de los monocitos frescos o crioconservados era mayor que 95% según se determinó con azul de tripano tinción 9. Figura 1 y la Figura 2 compara a aumentos inferiores y superiores, respectivamente, el progreso de frescos y criopreservados (es decir, congelada) diferenciación de los monocitos en macrófagos. Tenga en cuenta que la fresca en comparación con los monocitos criopreservados muestran una subpoblaci...

Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El protocolo utiliza la criopreservación de monocitos junto con su diferenciación masiva en macrófagos. Luego, los macrófagos cosechados se pueden sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la disponibilidad de monocitos y minimizar la variación en las densidades celulares obtenidas durante la diferenciación inducida por MCSF de monocitos sanguíneos humanos en macrófagos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la biología de los macrófagos humanos. La principal ventaja de esta estrategia es que las culturas de macrófagos derivados de monocitos humanos se pueden obtener fácilmente con una dependencia reducida de la disponibilidad de donantes.Además, se puede lograr de forma constante la densidad celular de macrófagos deseada y cultivos homogéneos. Para comenzar este procedimiento, obtenga las células mononucleares mediante leucoaféresis de donantes humanos y luego enriquezca los monocitos mediante elutriación centrífuga de flujo contracorriente continua de las células mononucleares. Después de eso, cuente las células utilizando un hemocitómetro.A continuación, centrifugue los monocitos en un tubo de polipropileno de 15 mililitros durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, elimine el sobrenadante y re-suspenda suavemente las células en suero bovino fetal seguido de DMSO para ob

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el cebado de monocitos primarios en macrófagos. Los monocitos humanos primarios pueden aislarse y diferenciarse a un fenotipo proinflamatorio similar a M1 utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) o a un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 utilizando el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).

Cultivo in vitro y diferenciación de monocitos primarios en macrófagos

En este video, demostramos un procedimiento para inducir la diferenciación y polarización de monocitos derivados de sangre periférica en macrófagos M1 o M2. La incubación con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, lipopolisacárido e interferón-gamma produce macrófagos M1 proinflamatorios, mientras que la incubación con factor estimulante de colonias de macrófagos e interleucina-4 induce la producción de macrófagos M2 antiinflamatorios.

Diferenciación y polarización de células derivadas de monocitos en células similares a macrófagos

Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Aquí se presenta un protocolo para detectar la producción de trampaextracelular de macrófagos (MET) en el cultivo de células vivas mediante microscopía y tinción de fluorescencia. Este protocolo se puede ampliar aún más para examinar marcadores específicos de proteína MET mediante la tinción de inmunofluorescencia.

Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.

Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Aprende a cultivar macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados con M-CSF mediante criopreservación y elutriación centrífuga. Este protocolo mejora la disponibilidad celular y reduce la variabilidad entre donantes para estudios de biología inmunológica.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

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