Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y medir el injerto in vivo de células sanguíneas trasplantadas a nichos de médula ósea receptores. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización de procesos celulares como la localización, la expansión y la localización en diferentes nichos de médula ósea de las células hematopoyéticas del donante después del trasplante. Utilizado en combinación con los modelos animales modificados, este enfoque puede ayudar a definir vías moleculares críticas para la regeneración de células hematopoyéticas.

A diferencia de la histología u otras técnicas de imagen, la microscopía intravital permite capturar las interacciones célula a célula en un animal vivo a nivel celular y en tiempo real. Decidimos utilizar este método para determinar si el microambiente de la médula ósea fue el sitio inicial del desarrollo de la enfermedad mieloproliferativa causada por la pérdida de la señalización de Notch. Los desafíos para las personas nuevas en esta técnica incluyen minimizar el artefacto de respiración, posicionar y estabilizar la cabeza de manera óptima y evitar la saturación de la imagen.

Una o dos horas antes del trasplante, rocíe un ratón EGFP lisado con etanol al 70%. A continuación, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel de cada pierna alrededor del tobillo y pinzas quirúrgicas para quitar la piel y el pelaje juntos para exponer el tejido muscular limpio. Retira la mayor cantidad de músculo posible de las piernas.

Luego, corte los huesos en las articulaciones de la rodilla y el tobillo y use esponjas de gasa para eliminar cualquier tejido muscular restante de los fémures y las tibias. Enjuague los huesos limpios en una placa de seis pocillos que contenga DMEM suplementado con 10% de FBS. Luego transfiera los cuatro huesos de la pata trasera a 10 mililitros de EDTA frío en PBS a un mortero y triture los huesos con un mortero.

Triturar las células de la médula ósea para obtener una suspensión unicelular y filtrar la suspensión a través de un filtro de 70 micras en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Enjuague el filtro con dos o tres mililitros de PBS. A continuación, centrifugar las células y resuspender el pellet en 10 mililitros de DMEM fresco más 10% de FBS.

Para la inyección, centrifugar la suspensión celular, luego contar y ajustar la concentración de células a 1,5 por 10 a la séptima célula por mililitro en IMDM sin suero. Coloque las celdas en hielo. Cinco o seis horas después de la segunda dosis de radiación, inyecte tres veces 10 células de la médula ósea en la vena de la cola de cada animal receptor radiado.

Agregue el punto de tiempo apropiado después del trasplante. Coloque el ratón receptor anestesiado en una almohadilla térmica a 37 grados centígrados y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie. Aplique ungüento en los ojos del animal y administre 100 microlitros del marcador fluorescente adecuado a través de la vena de la cola.

A continuación, utiliza una pequeña maquinilla eléctrica para eliminar el pelo de la superficie dorsal de la cabeza del animal, seguido de la aplicación de una crema depilatoria. Después de cinco minutos, retire la crema con esponjas de gasa y enjuague cualquier solución restante con solución salina. Desinfecte el cuero cabelludo con un bastoncillo de algodón empapado en etanol al 70%.

Luego, use pinzas finas y tijeras para hacer una incisión de 10 a 20 milímetros en la piel de la línea media en el cuero cabelludo para exponer la superficie dorsal del cráneo subyacente. Con seda quirúrgica 5-0, coloque dos suturas atirantadas a cada lado de la incisión creando un colgajo para exponer el cinvario para la obtención de imágenes. Aplica una gota de aceite sobre el cráneo expuesto.

Con el ratón en posición supina, sumerja el cuero cabelludo expuesto en un plato con fondo de vidrio lleno de aceite de microscopio. A continuación, coloque al animal en una platina de imágenes multifotónica con el calvario por encima del objetivo y cubra al animal con una almohadilla térmica de 37 grados centígrados. Es esencial que la cabeza permanezca estabilizada en la posición correcta durante la adquisición de la imagen multifotónica.

Utilice un dispositivo estereotáctico o asegure el mouse con cinta adhesiva, según corresponda. Usando un sistema confocal invertido modificado para imágenes multifotónicas, ajuste el láser de dos fotones a 830 nanómetros. A continuación, abra el software de adquisición de imágenes adecuado.

En el menú de configuración de adquisición, confirme que el modo de escaneo unidireccional está seleccionado y establezca la velocidad de escaneo en cuatro microsegundos por píxel, la velocidad de fotogramas en 512 por 512 píxeles y el zoom en 1,5. Seleccione los 20X vatios en un objetivo de 0,95. Abra la ventana de la lista de tintes y seleccione dos fotones.

A continuación, seleccione el espejo RDM690 en la ventana del controlador del microscopio. En la ventana de ruta de luz y dados, seleccione la casilla de unidad láser dos para verificar si el obturador láser de dos fotones está abierto. Seleccione Lámpara EPI y elija el cubo de filtro B/G EPI.

A continuación, enfocar el objetivo en la muestra para visualizar el flujo vascular en el nicho de la médula ósea del calvario, utilizando como puntos de referencia la bifurcación de la vena central y la sutura coronaria. Usando el modo de escaneo sin desescaneo, seleccione tres detectores externos y obtenga una imagen de la muestra a una velocidad de escaneo de cuatro microsegundos por píxel sin promedio y con una potencia láser constante y una ganancia del detector para utilizar el rango dinámico completo del detector con una saturación mínima. Después de recolectar una serie de secciones a través de la profundidad del tejido, abra el software de cuantificación y visualización de imágenes 3 a 4D apropiado.

Visualice de forma interactiva las pilas Z utilizando el algoritmo de renderizado 3D adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, utilice el módulo de segmentación de objetos puntuales para segmentar las celdas GFP y aplique el procesamiento aritmético de pila para eliminar las celdas GFP falsos positivas en los canales verde y rojo. Por último, utilice el módulo de segmentación de superficie para reformar la segmentación de la vasculatura y la superficie ósea, aplicando algoritmos de distancia de tensión X del punto a la superficie para calcular las distancias de las células a cualquiera de las superficies distales según sea necesario.

Aquí, las pilas Z recolectadas de cada una de las seis regiones estándar del calvario de la médula ósea se renderizaron como proyección de intensidad máxima en 3D, proyección de sombras en 3D, incluido el componente óseo, e imágenes segmentadas en 3D, lo que permitió la cuantificación de las células y la medición de sus distancias desde el hueso y los vasos. En este experimento, las imágenes in vivo de células mieloides en el microambiente de médula ósea defectuosa de Notch revelaron que las células GFP lisadas del donante tienen una eficiencia de localización similar en los receptores de tipo salvaje y knockout a las 24 horas después del trasplante, mientras que exhiben un injerto diferente en puntos de tiempo posteriores. El análisis de la dinámica de la expansión de los progenitores mieloides mostró que las células trasplantadas de médula ósea de forma adaptativa se expandieron más rápidamente y en mayor número en los receptores knockout a las dos semanas después del trasplante.

Las células de la médula ósea del donante en los receptores de tipo salvaje se expandieron más tarde, pero en cantidades dos veces mayores que las células del donante y los receptores knockout a las cuatro semanas, un momento en el que las células del donante en la médula ósea knockout disminuyen porque entra rápidamente en circulación. Y que a las seis semanas, las diferencias en el número de células donantes en el calvario de la médula ósea se estabilizan. Además, el análisis de segmentación en 3D de la región media inferior de la calvaria knockout y de tipo salvaje a las seis semanas después del trasplante de médula ósea indica que las células GFP lisadas se localizan a la misma distancia del hueso en ambos tipos de animales receptores, pero curiosamente, residen más distantes de la vasculatura en los ratones knockout.

Una vez dominadas, las imágenes de médula ósea intravital pueden completarse en una hora y 30 minutos por ratón si se realizan correctamente. Al utilizar este enfoque, es importante recordar tomar muestras de varias áreas de la médula ósea del cráneo por ratón y analizar al menos tres ratones por experimento para abordar cualquier variación dentro y entre muestras. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo combinar el trasplante de médula ósea y las imágenes intravitales para determinar la cinética del injerto de una subpoblación sanguínea específica en el microambiente de la médula ósea.