Name: Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a combinar microscopía intravital fluorescente con modelos genéticos para estudiar la dinámica del engraftamiento de células hematopoyéticas en nichos de médula ósea. Esta técnica permite visualizar procesos celulares en tiempo real.

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La proyección de imagen se llevó a cabo en el centro de Indiana para microscopia biológica en la Universidad de Indiana, dirigido por el Dr. Ken Dunn. El dispositivo estereotáctica es un prototipo diseñado y realizado por Mark Soonpaa, Wells Center for Pediatric Research. Este trabajo fue financiado por NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), la investigación MPN Fundación (NC) y la colaboración de CTSI proyecto íntimamente/Notre Dame (NC).

Se realizaron todos los procedimientos que implican el uso de animales con autorización de cuidado Animal y Use Comité de Indiana University School of Medicine. Asegurar que se adhieran a la legislación sobre experimentación animal del país donde se realiza el trabajo.
1. preparación de Mx1CreRBPJ- / - ratones receptores
<ol><li>Cruzar ratones RBPJlox/lox ratones10 para obtener Cre Mx1 Mx1-Cre+ positivo RBPJlox/lox ratones12 y Mx1-Cre negativo hermanos de camada delox/lox RBPJ utilizar como controles. Verifique que el genotipo por PCR10.</li>
	<li>Use 6-8 semanas-viejo Mx1Cre+/RBPJlox/lox y Mx1Cre–/RBPJlox/lox ratones con realizar la inducción de polyI:C.</li>
	<li>
Inyectar polyI:C 200 μg i.p. en Cre+ y Cre– ratones. Dar una inyección de polyI:C diariamente durante 3 días la primera semana. Dar una inyección de polyI:C la segunda semana, 7 días después de la inyección anterior (cuatro inyecciones en total).
	<ol>
<li>Usar RBPJKO (inducida por Mx1Cre+/RBPJlox/lox) y RBPJWT (inducida por Mx1Cre–/RBPJlox/lox) ratones como destinatarios 3 semanas después de la última inyección de polyI:C. Nota: Se recomienda utilizar ratones inducidos por pI: pC 3 semanas después de la inyección. La respuesta IFNα desencadenada por polyI:C induce cambios significativos en el BM, dando como resultado la expansión de immunophenotypic de HSC y disminución del gasto de progenitores maduros en la sangre periférica16,17. Representación de los subconjuntos hematopoyéticos es normalizados 3 semanas después de la inyección y los ratones pueden ser utilizados sin los efectos de confusión de la inflamación. Este protocolo de inducción ha sido optimizado para RBPJ. Si eliminar un gen distinto, el protocolo de inducción puede variar dependiendo de la construcción, y eliminación debe estar validada. Validamos la canceladura de ~ 100% de la región RBPJ entre loxP sitios por RT-PCR después de un total de cuatro inyecciones de polyI:C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de células de Lys-EGFP donantes de médula ósea para el trasplante
<ol><li>Eutanasia a un ratón de Lys-EGFP (dióxido de carbono seguido por dislocación cervical) 1 o 2 h antes del trasplante.</li>
	<li>Rocíe la superficie del cuerpo animal con etanol al 70%.</li>
	<li>Utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel en ambas piernas alrededor del tobillo y con fórceps quirúrgico separe la piel y piel para exponer tejido muscular limpio.</li>
	<li>Utilice tijeras quirúrgicas para quitar tanto músculo de las piernas como sea posible. Utilizando unas tijeras, cortar los huesos (en la rodilla y la articulación del tobillo) y limpie cualquier tejido remanente del músculo de los fémures y tibias usando esponjas de Gasa. Coloque los huesos (dos fémures y dos tibias) en una placa de 6 pozos con DMEM 10% FBS.</li>
	<li>Machacar los huesos en un mortero con 10 mL frío 2mM EDTA PBS y pipetear las células de la médula ósea para poner las células en suspensión unicelular. También lavar los huesos con tiempos de 2 mM EDTA PBS 3 de cada lado con una jeringa de 1 mL.</li>
	<li>Filtro de las células de la médula ósea mediante el uso de un filtro de 70 μm en un tubo de centrífuga de 15 mL. Enjuague el filtro con 2-3 mL de PBS. Centrifugar las células a 10 min a 460 x g y resuspender las células en 10 mL de DMEM fresco 10% FBS.</li>
	<li>Contar las células de la médula ósea en un hemocitómetro y ajustar la concentración a 1.5 x 107 células/mL de IMDM sin suero. Utilice el 3 x 106 células por animal con un volumen de 200 μl. Células de aproximadamente 1/3 del total BM son células GFP + mieloides. Dejar las células en hielo hasta que esté listo para la inyección. Usar 0,5 x 105 células para determinar la expresión de GFP por FACS9.</li>
</ol>3. médula ósea trasplante de Lys-GFP de células en ratones RBPJKO
<ol><li>Refrenar el receptoras ratones en una jaula de pie. Irradiar a ratones con una dosis letal de radiación gamma (1.200 Rad) en un irradiador de 137 Cs. Utilizar un protocolo de dosis divididas: 900 rads en la noche seguido por 300 rads a la mañana siguiente (16 h aparte).</li>
	<li>Trasplante los ratones receptores RBPJWT y RBPJKO letalmente irradiados 5-6 h después de la segunda dosis de la radiación. BM de inyectar células de ratones de Lys-EGFP en una concentración de 3 x 106 células por animal vía cola inyección en la vena (ver detalles para la recolección de las células en la sección 2).</li>
	<li>Cohortes independientes de ratones trasplantados por IVFM en momentos diferentes de la imagen: 24 h y a las semanas 2, 4 y 6, como se describe a continuación (véase la sección 4 y 5 para en vivo imágenes de procedimiento).</li>
</ol>4. quirúrgico preparación imagen Intravital
<ol><li>Esterilizar los instrumentos quirúrgicos. Dos finas pinzas (una recta, un ángulo), un par de tijeras finas y un par de sostenedores de la aguja. Preparar el área operativa con todos los suministros necesarios para el procedimiento.</li>
	<li>Poner el ratón una inyección IP de ketamina anestésico cóctel (xilacina 2.5-5 mg/kg + acepromacina 1.0-2.5 mg/kg + ketamina 90-100 mg/kg) utilizando una jeringa de aguja de 26-28 G.  Animal se monitorearán cada 15 min durante el procedimiento y anestesia se complementarán según sea necesario en 1/4 de la dosis original.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una fuente de calor adecuada (37 ° C almohada, animal protegido del contacto directo con el cojín de calefacción) y monitorear visualmente la frecuencia respiratoria.</li>
	<li>Controlar reflejos utilizando el dedo pizca de respuesta. Asegúrese que el animal esté completamente bajo anestesia antes de iniciar cualquier procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Uso un 26-28 calibre aguja jeringa darle ratones una inyección de vena de la cola de un marcador fluorescente vascular (dextrano, 100 μL de solución de 20 mg/mL).</li>
	<li>Aplicar ungüento oftálmico de veterinario en ambos ojos. Clip de la superficie dorsal de la cabeza del animal con cortauñas eléctricos pequeño. Aplicar una crema para esponjas de Gasa de uso 5 minutos retirar la crema y luego enjuague con una solución salina de la depilación. Preparar el cuero cabelludo limpio con alcohol al 70% utilizando un hisopo de algodón.</li>
	<li>Use finas pinzas y tijera para hacer una incisión en la piel pequeña de la línea media (10-20 mm) en el cuero cabelludo para exponer la superficie dorsal del cráneo subyacente. Utilizar seda quirúrgica de 5-0 colocar dos suturas de estancia en la piel a cada lado de la incisión, creando una aleta para dejar al descubierto la calota para la proyección de imagen.</li>
	<li>Coloque el ratón en su parte posterior y sumerja el cuero cabelludo expuesto en un plato de fondo de cristal con aceite de microscopio. Transportar al animal a la mutiphoton sala de proyección de imagen.</li>
	<li>Coloque el animal en la platina del microscopio con la bóveda craneal colocado sobre el plato de vidrio sobre el objetivo y luego cubrir con una 37cojín de calentamiento ° C (el animal debe ser protegido de contacto directo con el calor).</li>
</ol>5. in Vivo proyección de imagen de alta resolución de la bóveda de ratón
<ol><li>Utilizar un sistema confocal invertido modificado para la proyección de imagen multifotón (véase tablade materiales ). Siguientes instrucciones sintonizar un laser de 2 fotones a 830 nm, ponga un 20 X W, NA 0.95 objetivo en el pedazo de nariz de microscopio y comprobar la alineación de haz láser. Nota: Sistemas de microscopio vertical son más comúnmente utilizados para estos estudios, pero también puede utilizarse un sistema invertido de multifotón. En este estudio, se utilizó un dispositivo estereotáctica personalizado diseño atraumático. Aunque hay varios dispositivos disponibles comercialmente estereotáctica para sistemas del microscopio vertical, no hay ningún dispositivo estereotáxicas comercialmente disponible para un sistema de microscopio invertido encaminado a lograr el cráneo de ratón. Como alternativa a un dispositivo estereotáctica personalizado, el cráneo puede fijarse en posición sobre el objetivo utilizando varios métodos de cinta o goma para la estabilidad.</li>
	<li>Abra un software de adquisición de imagen. En la"adquisición" panel comprobar si se ha seleccionado un modo de análisis direccional. Configurar la velocidad de escaneo de 4 μs/píxeles, velocidad de fotogramas a 512 x 512 píxeles y zoom a 1,5. Seleccione el objetivo 20 X W Na 0.95 de la lista de disponibles lentes del objetivo para que coincida con la lente colocada en la boquilla.</li>
	<li>Acceder a la "lista de tinte» desde el panel de"Control de adquisición de imagen"y seleccione"Dos fotones". Abrir la ventana de "Luz camino y colorantes" y seleccione DM690 980 excitación DM. abierto el obturador de laser P 2 marcando la casilla de verificación en la unidad de láser 2. En la ventana "Controlador de microscopio", seleccione RDM690 espejo.</li>
	<li>Selecciona "Lámpara EPI", elegir cubo de epi-filtro B/G y enfocar el objetivo en la muestra para visualizar el flujo vascular y el nicho de la médula ósea bóveda craneal, utilizando como referencia la bifurcación de la vena central (a) y la sutura coronaria (b) (figura 2A).</li>
	<li>
Recoger imágenes usando el modo no descanned. Seleccione tres detectores externos: detector1 PMT para recoger señal SHG de colágeno (filtro de emisión - 430/100 nm), detector2 de GaAsP para recoger señal GFP (filtro de emisión - 525/50) y detector3 de GaAsP para recoger señal de dextrano TRITC (filtro de emisión - 605/90 nm).
	<ol>
<li>Realizar la proyección de imagen a una velocidad de exploración de 4μs/pixel con ningún promedio para minimizar la fototoxicidad. Recoger imágenes en un aumento de potencia y detector de láser constante ajustado para utilizar el rango dinámico completo del detector con mínima saturación.</li>
		<li>Recoger serie de secciones a través de la profundidad del tejido (60 x 1 μm Z stacks) de 6 regiones de la médula de la bóveda craneal. Utilizar la configuración de tamaño de paso de 1 μm, zoom de 1,5 y tamaño de fotograma de 512 x 512 píxeles (423 μm x 423 μm). Nota: En general el tiempo total requerido para un ratón de la imagen es 1-1.5 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. análisis cuantitativo
<ol><li>Realizar las reconstrucciones de cuantificación y 3D de imagen utilizando un software de cuantificación y visualización de imagen 3D/4D dedicada según las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). Visualizar interactivamente Z-pilas en 3D utilizando proyección de intensidad máxima (MIP), mezcla de alfa o algoritmos de renderizado de volumen de proyección de sombra.</li>
	<li>Segmento las células GFP utilizando el "módulo de segmentación de punto objeto". Aplicar el procesamiento aritmético de pila (resta de canal) para eliminar falsos positiva cuenta de células GFP (Esto elimina la señal de las células óseas mostrando fuerte fluorescencia en los canales rojos y verdes).</li>
	<li>Realizar segmentación de vasculatura y hueso superficie utilizando el módulo de la segmentación superficial. Si es necesario, calcular distancias de células a cualquiera de las anteriores superficies aplicando algoritmos de X-tension, denominadas "distancia de punto a la superficie".</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un diseño optimizado para estudiar la cinética del engraftment de células hematopoyéticas por microscopia Intravital de fluorescentes. En este estudio, la expansión de las células progenitoras mieloides en un BM de WT o en una muesca señalización defectuosa BM fue localizada en la bóveda ósea por células mieloides positivas siguientes de Lys-GFP después de BMT en recipientes RBPJWT o RBPJKO. Este enfoque se propone como un modelo que puede aplicarse para responder preguntas similares, por ejemplo:...

La microscopia intravital de fluorescencia multifotón (IVFM) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la alta resolución y en tiempo real la proyección de imagen de tejidos con profundidad hasta 1mm, dependiendo del tejido. Cuando se aplica a la bóveda del ratón, permite observar el comportamiento de las células hematopoyéticas en el BM en una manera no invasiva hasta 60-100 μm11. Aquí se utiliza este enfoque para determinar la cinética del engraftment de progenitores mieloides normales en los ratones knock-out de BM de RBPJ falta de señalización de Notch canónica.
Trabajos recientes de nuestro grupo demostraron defectuosa señalización canónica de muesca en el BM microambiente conduce a una Enfermedad mieloproliferativa como12. Pérdida de la señalización de Notch se obtuvo por supresión condicional del dominio de unión de ADN de RBPJ, el factor de transcripción crítico aguas abajo de la muesca canónica de señalización, utilizando Mx1-Cre inducida por recombinación10. En este estudio, se utilizó el modelo de ratones de Mx1-Cre/RBPJlox/lox . Supresión condicional adorno DNA-obligatorio del RBPJ de resultados en la pérdida de la señalización de los receptores Notch. En el modelo Mx1-Cre Cre expresión es conducida por el promotor de Mx1 activado tras la administración de polyI:C dando por resultado la inducción específica de canceladura del gene en células de la sangre así como en componentes stromal de múltiples órganos, incluyendo el BM, el bazo y el hígado.
MX1-Cre+/RBPJlox/lox y Mx1-Cre–/RBPJlox/lox ratones inducidos con polyI:C (aquí en adelante denominadas RBPJKO y RBPJWT, respectivamente) fueron irradiados letalmente y trasplantados con las células hematopoyéticas normales, tipo salvaje. A partir de la 4 semana después del trasplante, los receptores RBPJKO desarrollaron leucocitosis significativa seguido por esplenomegalia. Aunque ratones RBPJKO presentaron mayor porcentaje de progenitores mieloides en el BM en la semana 8 después del trasplante y en momentos más adelante, el análisis de BM en las semanas 4 y 6 no reveló diferencias llamativas en su contenido de células mieloides en comparación con el control RBPJWT destinatarios. Esta observación, junto con el hecho de que Cre Mx1 se expresa en diferentes órganos hematopoyéticos, planteó la cuestión de si el microambiente del BM tuvo impacto directo en la iniciación del fenotipo mieloproliferativo.
Para determinar si el BM era un sitio crítico inicial de desarrollo de la enfermedad, IVFM de la bóveda de ratón se usa en combinación con BM trasplante el modelo knock-out RBPJ y un sistema de seguimiento de linaje. Ratones transgénicos que expresaban EGFP bajo el control del promotor (Lys-GFP) lisozima específico9 fueron utilizados para obtener células de un donante que podrían visualizarse durante BM imagen después de BMT. Expresión de lisozima es específica de las células mieloides y Lys-GFP marca células del progenitor mieloide común (CMP) para los granulocitos maduros13.
IVFM del BM en diferentes puntos temporales demostró que las células GFP Lys alojados de manera similar a los destinatarios BM de RBPJWT y RBPJKO, pero ampliaron y engrafted rápidamente en los receptores de la BM de RBPJKO. Esta diferencia fue dramática en el momento anterior (semana 2) y disminuye con el tiempo (semanas 4 y 6). Sin embargo, en estos momentos más adelante, evaluación del compartimiento hematopoyético en el mismo recipiente demostró un aumento constante del número de células mieloides circulantes en la PB y localizados en el bazo de los ratones RBPJKO, lo que indica un aumento de la producción de células del BM en la circulación. Análisis de localización de células Lys-GFP en el BM de ratones trasplantados a las 6 semanas reveló que las células mieloides residían más lejos de la vasculatura en el microambiente de la RBPJKO que en el control.
Colectivamente, la combinación de IVFM con estos modelos animales específicos proporciona penetraciones en la dinámica del engraftment de células mieloides en el microambiente RBPJKO BM. El diseño experimental y el enfoque cuantitativo que se descrito aquí se propone como un paradigma que puede ser aplicado para hacer frente a preguntas similares. Por ejemplo, puede permitir el uso de otro linaje específico celular seguimiento de modelos, tales como GFP RAG114 o Gata1-GFP15 ratones, siguiendo el comportamiento de linfoide o progenitores eritroides, respectivamente, en el BM.

<table><tbody><tr><td>Cóctel de ketamina</td><td>IU Facultad de Medicina</td><td></td><td>Ketamina 90-100 mg/kg, Xilacina 2,5-5,0 mg/kg, Acepromazina 1,0-2,5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC dextrano</td><td>Tdb Consultancy</td><td>TD150-100mg</td> Se <td>puede utilizar otro color.</td></tr><tr><td>Recortadora de pelo Andis</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gasa</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4 capas, 2 x 2</td></tr><tr><td>Crema depilatoria Nair Tienda</td><td></td><td></td><td></td>comercial</tr><tr><td>Saline</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0.9% Cloruro de sodio frasco de polietileno</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28 g, 1/2 cc</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>pinza recta, pinza angular</td></tr><tr><td>Tijera</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>Se pueden utilizar otras suturas no absorbibles</td></tr><tr><td>WillCo- plato con fondo de vidrio</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de microscopio óptico</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserto de platina estereotáxica&nbsp;</td><td>Escuela de Medicina de IU</td><td>Diseño personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microscopio confocal Olympus FV1000&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objetivo&nbsp;</td><td>Almohadilla</td> térmica pequeña Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tienda</td><td></td> comercial <td>Almohadilla térmica para reptiles Zoo Med</td></tr><tr><td>Imaris 8.1 software de imagen</td><td>Bitplane</td><td></td><td>3/4 D Software de visualización y análisis de imágenes</td></tr></tbody></table>

combina la microscopia intravital fluorescente (ivfm) con modelos genéticos para estudiar dinámica del engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Creciente evidencia indica que la hematopoyesis normal está regulada por distintas señales microambiental en el BM, que incluyen nichos celulares especializadas modulación crítica de células madre hematopoyéticas (HSC) funciones1,2. De hecho, un cuadro más detallado del microambiente hematopoyético ahora surge, en el cual los endoóseos y los nichos endoteliales forman unidades funcionales para la regulación de HSC normal y su progenie3,4,5 . Nuevos estudios han revelado la importancia de las células perivasculares, adipocitos y células neuronales en el mantenimiento y regulación de la función HSC6,7,8. Además, hay evidencias de que células de diferentes linajes, es decir, las células mieloides y linfoides, hogar y residen en nichos específicos dentro del microambiente de BM. Sin embargo, una asignación completa del microambiente del BM y de sus ocupantes aún está en progreso.
Cepas de ratón transgénico que expresan marcadores fluorescentes específicos de linaje o ratones genéticamente modificados para carecer de las moléculas en células específicas del nicho BM están ahora disponibles. Knock-out y linaje seguimiento de modelos, en combinación con métodos de trasplante, proporcionan la oportunidad de perfeccionar el conocimiento sobre el papel de específicas "niche" células para poblaciones hematopoyéticas definidas como HSC, de células B, células T, células mieloides y células eritroides. Esta estrategia puede ser potenciada aún más combinando el uso de la microscopía de dos fotones de la bóveda craneal. Proporcionando en vivo imágenes de alta resolución y 3D Render de la bóveda de BM, ahora podemos determinar precisamente el lugar donde subconjuntos hematopoyéticos específicos Inicio en el BM y evaluar la cinética de su expansión en el tiempo. Aquí, Lys-GFP ratones transgénicos (marcando las células mieloides)9 y RBPJ ratones knock-out (falta de señalización de Notch canónica)10 se utilizan en combinación con IVFM determinar el engraftment de células mieloides en un microambiente de BM defectuoso de muesca.

Cohortes de 2 RBPJKO y 2 RBPJWT beneficiarios se reflejada en una sesión de imágenes individual en diferentes puntos temporales: 24 h y 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de las células del BM Lys-GFP (flujo de trabajo se ilustra en la figura 1A).
En cada ratón, se adquirieron imágenes de 6 regiones estándar de la bóveda de la BM, identificados por su posición en relación con la bifurcación de la vena centr...

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y medir el injerto in vivo de células sanguíneas trasplantadas a nichos de médula ósea receptores. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización de procesos celulares como la localización, la expansión y la localización en diferentes nichos de médula ósea de las células hematopoyéticas del donante después del trasplante. Utilizado en combinación con los modelos animales modificados, este enfoque puede ayudar a definir vías moleculares críticas para la regeneración de células hematopoyéticas.A diferencia de la histología u otras técnicas de imagen, la microscopía intravital permite capturar las interacciones célula a célula en un animal vivo a nivel celular y en tiempo real. Decidimos utilizar este método para determinar si el microambiente de la médula ósea fue el sitio inicial del desarrollo de la enfermedad mieloproliferativa causada por la pérdida de la señalización de Notch. Los desafíos para las personas nuevas en esta técnica incluyen minimizar el artefacto de respiración, posicionar y estabilizar la cabeza de manera óptima y evitar la saturación de la imagen.Una o dos horas antes del trasplante, rocíe un ratón EGFP lisado con etanol al 70%. A continuación, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel de cada pierna alrededor del tobillo y pinzas quirúrgicas para quitar la piel y el pelaje juntos para exponer el tejido muscular limpio. Retira la mayor cantidad de músculo posible de las piernas.Luego, corte los huesos en las articulaciones de la rodilla y el tobillo y use esponjas de gasa para eliminar cualquier tejido muscular restante de los fémures y las tibias. Enjuague los huesos limpios en una placa de seis pocillos que contenga DMEM suplementado con 10% de FBS. Luego transfiera los cuatro huesos de la pata trasera a 10 mililitros de EDTA frío en PBS a un mortero y triture los huesos con un mortero.Triturar las células de la médula ósea para obtener una suspensión unicelular y filtrar la suspensión a través de un filtro de 70 micras en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Enjuague el filtro con dos o tres mililitros de PBS. A continuación, centrifugar las células y resuspender el pellet en 10 mililitros de DMEM fresco más 10% de FBS.Para la inyección, centrifugar la suspensión celular, luego contar y ajustar la concentración de células a 1,5 por 10 a la séptima célula por mililitro en IMDM sin suero. Coloque las celdas en hielo. Cinco o seis horas después de la segunda dosis de radiación, inyecte tres veces 10 células de la médula ósea en la vena de la cola de cada animal receptor radiado.Agregue el punto de tiempo apropiado después del trasplante. Coloque el ratón receptor anestesiado en una almohadilla térmica a 37 grados centígrados y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie. Aplique ungüento en los ojos del animal y administre 100 microlitros del marcador fluorescente adecuado a través de la vena de la cola.A continuación, utiliza una pequeña maquinilla eléctrica para eliminar el pelo de la superficie dorsal de la cabeza del animal, seguido de la aplicación de una crema depilatoria. Después de cinco minutos, retire la crema con esponjas de gasa y enjuague cualquier solución restante con solución salina. Desinfecte el cuero cabelludo con un bastoncillo de algodón empapado en etanol al 70%.Luego, use pinzas finas y tijeras para hacer una incisión de 10 a 20 milímetros en la piel de la línea media en el cuero cabelludo para exponer la superficie dorsal del cráneo subyacente. Con seda quirúrgica 5-0, coloque dos suturas atirantadas a cada lado de la incisión creando un colgajo para exponer el cinvario para la obtención de imágenes. Aplica una gota de aceite sobre el cráneo expuesto.Con el ratón en posición supina, sumerja el cuero cabelludo expuesto en un plato con fondo de vidrio lleno de aceite de microscopio. A continuación, coloque al animal en una platina de imágenes multifotónica con el calvario por encima del objetivo y cubra al animal con una almohadilla térmica de 37 grados centígrados. Es esencial que la cabeza permanezca estabilizada en la posición correcta durante la adquisición de la imagen multifotónica.Utilice un dispositivo estereotáctico o asegure el mouse con cinta adhesiva, según corresponda. Usando un sistema confocal invertido modificado para imágenes multifotónicas, ajuste el láser de dos fotones a 830 nanómetros. A continuación, abra el software de adquisición de imágenes adecuado.En el menú de configuración de adquisición, confirme que el modo de escaneo unidireccional está seleccionado y establezca la velocidad de escaneo en cuatro microsegundos por píxel, la velocidad de fotogramas en 512 por 512 píxeles y el zoom en 1,5. Seleccione los 20X vatios en un objetivo de 0,95. Abra la ventana de la lista de tintes y seleccione dos fotones.A continuación, seleccione el espejo RDM690 en la ventana del controlador del microscopio. En la ventana de ruta de luz y dados, seleccione la casilla de unidad láser dos para verificar si el obturador láser de dos fotones está abierto. Seleccione Lámpara EPI y elija el cubo de filtro B/G EPI.A continuación, enfocar el objetivo en la muestra para visualizar el flujo vascular en el nicho de la médula ósea del calvario, utilizando como puntos de referencia la bifurcación de la vena central y la sutura coronaria. Usando el modo de escaneo sin desescaneo, seleccione tres detectores externos y obtenga una imagen de la muestra a una velocidad de escaneo de cuatro microsegundos por píxel sin promedio y con una potencia láser constante y una ganancia del detector para utilizar el rango dinámico completo del detector con una saturación mínima. Después de recolectar una serie de secciones a través de la profundidad del tejido, abra el software de cuantificación y visualización de imágenes 3 a 4D apropiado.Visualice de forma interactiva las pilas Z utilizando el algoritmo de renderizado 3D adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, utilice el módulo de segmentación de objetos puntuales para segmentar las celdas GFP y aplique el procesamiento aritmético de pila para eliminar las celdas GFP falsos positivas en los canales verde y rojo. Por último, utilice el módulo de segmentación de superficie para reformar la segmentación de la vasculatura y la superficie ósea, aplicando algoritmos de distancia de tensión X del punto a la superficie para calcular las distancias de las células a cualquiera de las superficies distales según sea necesario.Aquí, las pilas Z recolectadas de cada una de las seis regiones estándar del calvario de la médula ósea se renderizaron como proyección de intensidad máxima en 3D, proyección de sombras en 3D, incluido el componente óseo, e imágenes segmentadas en 3D, lo que permitió la cuantificación de las células y la medición de sus distancias desde el hueso y los vasos. En este experimento, las imágenes in vivo de células mieloides en el microambiente de médula ósea defectuosa de Notch revelaron que las células GFP lisadas del donante tienen una eficiencia de localización similar en los receptores de tipo salvaje y knockout a las 24 horas después del trasplante, mientras que exhiben un injerto diferente en puntos de tiempo posteriores. El análisis de la dinámica de la expansión de los progenitores mieloides mostró que las células trasplantadas de médula ósea de forma adaptativa se expandieron más rápidamente y en mayor número en los receptores knockout a las dos semanas después del trasplante.Las células de la médula ósea del donante en los receptores de tipo salvaje se expandieron más tarde, pero en cantidades dos veces mayores que las células del donante y los receptores knockout a las cuatro semanas, un momento en el que las células del donante en la médula ósea knockout disminuyen porque entra rápidamente en circulación. Y que a las seis semanas, las diferencias en el número de células donantes en el calvario de la médula ósea se estabilizan. Además, el análisis de segmentación en 3D de la región media inferior de la calvaria knockout y de tipo salvaje a las seis semanas después del trasplante de médula ósea indica que las células GFP lisadas se localizan a la misma distancia del hueso en ambos tipos de animales receptores, pero curiosamente, residen más distantes de la vasculatura en los ratones knockout.Una vez dominadas, las imágenes de médula ósea intravital pueden completarse en una hora y 30 minutos por ratón si se realizan correctamente. Al utilizar este enfoque, es importante recordar tomar muestras de varias áreas de la médula ósea del cráneo por ratón y analizar al menos tres ratones por experimento para abordar cualquier variación dentro y entre muestras. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo combinar el trasplante de médula ósea y las imágenes intravitales para determinar la cinética del injerto de una subpoblación sanguínea específica en el microambiente de la médula ósea.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el...

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.

Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Se presenta un método para crear y vivir-imagen diferentes nichos humanizados de médula ósea en ratones. Basándose en el nicho de soporte creado por las células mesenquimales humanas, la adición de células endoteliales humanas induce la formación de vasos humanos, mientras que la adición de rhBMP-2 induce la formación de tejido óseo maduro quimérico humano-ratón.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.

Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos 

La microscopía intravital permite el estudio de procesos biológicos dinámicos como la regeneración de tejidos y el desarrollo de tumores. La médula ósea del calvario, un tejido altamente dinámico, ofrece información sobre la hematopoyesis y la función vascular. El uso de un implante de fijación de cabeza biocompatible impreso en 3D permite obtener imágenes longitudinales repetitivas, lo que mejora nuestra comprensión de la dinámica de los tejidos y el microambiente tumoral.

Imagen longitudinal intravital de la dinámica vascular en la médula ósea del calvario

Aprende a combinar microscopía intravital fluorescente con modelos genéticos para estudiar la dinámica del engraftamiento de células hematopoyéticas en nichos de médula ósea. Esta técnica permite visualizar procesos celulares en tiempo real.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea (Video) | JoVE Journal

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

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