Name: Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprende a implementar microscopía CARS para imagen celular sin marcadores usando láseres Ti:zafiro y OPO. Esta técnica permite estudiar procesos biológicos y enfermedades relacionadas con lípidos en tiempo real.

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Los autores quieren agradecer al Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Francia) por el préstamo del osciloscopio rápido y reconocer el apoyo financiero de Montpellier RIO Imaging (MRI). RR.HH. reconoce las subvenciones de ANR a las redes de infraestructura France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) y France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) para desarrollos coherentes de imágenes Raman. Este trabajo fue financiado principalmente por una beca del Consejo Europeo de Investigación (FP7-IDEAS-ERC 311610) y una beca INSERM - AVENIR a NT.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La parte más difícil del trabajo es la sincronización temporal de los rayos láser. Se requiere un fotodiodo rápido combinado con un osciloscopio rápido, pero sólo una superposición aproximada en el tiempo se puede realizar a primera. A continuación, se requiere un ajuste adicional de unos pocos centímetros. Por último, micrómetro se mueve por una etapa de traslación lineal permite realizar el ajuste fino final de la longitud de la línea de retardo con el fin de desencadenar la señal CARS. Esta señal se mantiene en un es...

La microscopía óptica se ha convertido en una técnica importante para la visualización no destructiva de los procesos dinámicos en los sistemas biológicos vivos con una resolución subcelular. Microscopía de fluorescencia es actualmente el contraste de imagen más popular usado en células vivas debido a su alta especificidad y sensibilidad 1. Una gran gama de sondas fluorescentes ha surgido (colorantes exógenos, las proteínas codificadas genéticamente, nanopartículas de semiconductores). Varios muestra de iluminación técnicas basadas en fluorescentes han florecido (como la microscopía confocal o de dos fotones) para realizar las imágenes en 3D y para reducir un inconveniente principal de esta técnica que se photobleaching 2. Otras limitaciones incluyen el requisito de etiquetado fluoróforo porque la mayoría de las especies moleculares no son intrínsecamente fluorescente y por lo tanto estos fluoróforos que ser introducido artificialmente en la muestra de imágenes. Esta manipulación artificial puede ser perjudicial, especialmente para las pequeñas moléculas o induzca a la ollaential fototoxicidad. Estas razones hacen que no microscopía de fluorescencia muy adecuado para las observaciones in vivo. Por lo tanto, el uso de técnicas de formación de imágenes ópticas con alta sensibilidad y contrastes moleculares específicos sin el uso de moléculas fluorescentes es muy deseable en la ciencia biomédica. Varias técnicas de imagen óptica no lineal sin etiquetado o tinción han surgido, incluyendo la generación del segundo armónico (SHG) 3,4 y la generación de tercera armónica (THG) 5. SHG microscopía se ha utilizado para disposiciones estructurales de la imagen en el nivel supramolecular tales como microtúbulos o colágeno 6. THG se genera a partir heterogeneidades ópticas tal como la interfaz entre un medio acuoso y lípidos 7. THG También se demostró que la imagen de la mielina 8,9. Ambas técnicas se pueden implementar en un microscopio de fluorescencia de dos fotones y requieren solamente un haz de láser. Sin embargo requieren la intensidad del láser de alta potencia (típicamente 50mW a 860 nm para SHG 10, 25 - 50 mW en 1180 nm para THG 9), que es perjudicial en muestras de vida, y no proporcionan la especificidad química que se requiere para inequívocamente imagen estructuras biológicas específicas. Químicamente imagen selectiva se puede obtener de las señales de vibración molecular inherentes en base a la dispersión Raman. Cuando un haz de luz incide en la materia, los fotones pueden ser absorbidos y dispersados ​​por átomos o moléculas. La mayoría de los fotones dispersados ​​tendrá la misma energía, es decir, la frecuencia, como los fotones incidentes. Este proceso se denomina dispersión de Rayleigh. Sin embargo, un pequeño número de fotones se dispersa en una frecuencia óptica diferente de la frecuencia de los fotones incidentes, es decir, con un proceso de dispersión inelástica llamada dispersión Raman. La diferencia de energía se origina a partir de la excitación de modos de vibración en función de la estructura molecular y el medio ambiente. Por lo tanto, Raman espontánea prov dispersiónidus de imagen químicamente selectivos diferentes moléculas tienen frecuencias vibratorias específicas. Sin embargo, es limitada debido a su señal extremadamente débil. Confocal Raman microscopía se ha desarrollado y proporciona una resolución espacial en 3D, pero requiere alta potencia media y la adquisición de mucho tiempo 11. Para superar estas dificultades, los recientes avances en la tecnología láser han permitido el aumento de la microscopía óptica no lineal vibratorio, en particular, dispersión coherente anti-Stokes Raman (CARS) 11,12,13. CARS es un proceso óptico no lineal de tercer orden. Tres rayos láser, compuesto de un haz de bombeo en ω frecuencia P, un haz de Stokes a la frecuencia ω S y un haz de sonda (siendo lo más a menudo la bomba) se centran en una muestra y generan un haz de anti-Stokes a la frecuencia ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. La señal anti-Stokes se puede mejorar de manera significativa cuando la diferencia de frecuenciaentre la bomba y el Stokes vigas está sintonizado a una R Ω vibración molecular Raman = (ω P - ω S). señal CARS se basa en la interacción múltiple de fotones. Por lo tanto, genera una señal coherentes órdenes de magnitud más fuerte que la dispersión Raman espontánea. CARS microscopía se demostró experimentalmente por primera vez por Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Mejoró entonces la técnica, mediante el uso de dos haces de láser de femtosegundo se centraron en el infrarrojo cercano con una lente de objetivo de gran apertura numérica, que permite la condición de coincidencia de fases de coches y evitando el de dos fotones de fondo no resonante 16. Por lo tanto CARS microscopía ha surgido como una poderosa herramienta para la formación de imágenes de células y tejidos en vivo, mediante la detección de moléculas químicamente tales como lípidos (a través de la vibración de estiramiento CH) 17,18, agua (a través de las vibraciones de estiramiento OH), proteínas, ADN en células vivas 19,20 pero también deuterado compuesto químicos para la industria farmacéutica 21 y 22 aplicaciones cosméticas. La principal limitación de la microscopía no lineal origina a partir de la complejidad y el costo de las fuentes ópticas. Un sistema CARS requiere dos láseres sintonizables de longitud de onda con duraciones de pulso corto y con trenes de impulsos sincronizados temporal y espacialmente. Los primeros microscopios CARS se basaron en dos picosegundos sincronizada Ti: zafiro láseres 20. CARS imágenes también se obtuvo a partir de una sola femtosegundo Ti: zafiro láser que genera una fuente de luz supercontinuo 23. Recientemente, fuentes de láser compuestos por un solo Ti femtosegundo: láser de zafiro de bombeo de un osciladores paramétricos ópticos sintonizables (OPO) se han utilizado para la microscopía CARS. Esta configuración permite intrínsecamente temporal sincronizada vigas con una diferencia de frecuencia entre la bomba y el haz de Stokes que cubre el espectro de vibración molecular completa 24. Además, microscopios de barrido láser basado en un volumen de negociosláser de fs clave y un OPO, que se utiliza principalmente para la fluorescencia de dos fotones (TPF) están ahora disponibles para los no-físicos. El potencial de este tipo de puestas a punto se puede mejorar en gran medida sin necesidad de inversión suplementaria por la incorporación de otras imágenes ópticas no lineales, ya que cada modalidad de imagen no lineal (NLO) es sensible a las estructuras o moléculas específicas. Por lo tanto, la imagen multimodal NLO capitaliza el potencial de la microscopía NLO para muestras biológicas complejas 25. El acoplamiento de estas técnicas ha permitido la investigación de muchos cuestiones biológicas, en particular, sobre el metabolismo de los lípidos, de la piel o cáncer de desarrollo 26, el desarrollo del músculo esquelético 27, 28 lesiones ateroscleróticas. Por otra parte, la aplicación de rayo láser de barrido con los coches da la capacidad de formación de imágenes de alta velocidad, es decir, una herramienta atractiva para estudiar los procesos dinámicos en vivo. El objetivo de este trabajo es mostrar cada paso para poner en práctica tél CARS técnica en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica. El microscopio se basa en un Ti FSEC: láser de zafiro y un OPO (bombeada por el Ti: Zafiro láser), operado por un software para los biólogos. La integración se llevó a cabo mediante el ajuste de la longitud de uno de la trayectoria del rayo láser con el fin de sincronizar en el tiempo los dos haces. Se describe la ejecución paso a paso de esta técnica que requiere sólo base de fondo en la óptica experimentales. También ilustramos CARS formación de imágenes obtenidas en las vainas de mielina del nervio ciático de roedores, y mostramos esta imagen se puede realizar simultáneamente con otra óptica no lineal de imágenes, tales como técnica de fluorescencia de dos fotones estándar y segundo armónico generación.

<table><tbody><tr><td>Osciloscopio</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotodetector</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm</td></tr><tr><td>Láser Ti:Zafiro Chameleon Ultra Family II</td><td>Oscilador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paramétrico óptico coherente OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Axio Examiner LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss Periscopio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>motorizado</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss Combinador</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>haz</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulador acústico-óptico</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atenuador de potencia OPO</td><td>Carl Zeiss Tubo fotomultiplicador Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Software ZEN Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Bandpass <td></td><td></td></tr><tr><td> filtros</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp; Nm; 465 - 610 nm</td></tr><tr><td>Espejo dicroico</td><td>Carl Zeiss Longitud de</td><td></td><td>onda de corte 760&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Espejos plateados</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20,000&nbsp; nm, Cantidad 4</td></tr><tr><td>Etapa de traslación de un eje con micrómetro estándar</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Cantidad 1</td></tr><tr><td>Placa de pruebas de aluminio</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Cantidad 1</td></tr><tr><td>Soporte de espejo</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Cantidad 4</td></tr><tr><td>Soporte de espejo para &Oslash; Óptica de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Cantidad 4</td></tr><tr><td>Diafragmas de iris&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>Cantidad 3</td></tr><tr><td>Caja protectora</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Cantidad 1</td></tr><tr><td>Postes ópticos</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Cantidad 8 (longitudes según la configuración)</td></tr><tr><td>661 - 690 nm Filtro</td> de paso de banda <td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine&reg; filtro de paso de banda monobanda</td><td>Cantidad 1</td></tr><tr><td>Perlas fluorescentes</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&comercio; Kit de tamaño de microesferas fluorescentes</td> Tarjeta de visualización láser Tarjeta de visualización láser Thorlabs IR Vidrio de seguridad láser Newport LV-F22.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromielina&comercio; Tinción de mielina fluorescente roja &nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

implementación de un sistema coherente anti-stokes raman scattering (cars) en un ti: zafiro y opo láser basado en laser standard microscopio de barrido

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

microscopios de barrido láser de femtosegundo que combinan una Ti: zafiro láser y un oscilador paramétrico óptico (OPO) para duplicar la línea de láser se han hecho disponibles para los biólogos. Estos sistemas están diseñados principalmente para múltiples canales de dos fotones microscopía de fluorescencia. Sin embargo, sin ninguna modificación, microscopía óptica no lineal complementaria tales como la generación de segundo armónico (SHG) o tercera generación armónica (THG) también se puede realizar con esta puesta a punto, permitiendo de imágenes libre de etiquetas de moléculas estructuradas o medio acuoso interfaces de lípidos. Estas técnicas son muy adecuadas para la observación in vivo, pero son limitados en la especificidad química. Químicamente imagen selectiva se puede obtener de las señales de vibración inherentes en base a la dispersión Raman. Confocal Raman microscopía proporciona una resolución espacial en 3D, pero requiere alta potencia media y de largo tiempo de adquisición. Para superar estas dificultades, los recientes avances en la tecnología láser han permitido el desarrollo de la microscopía óptica no lineal vibratorio, en particular, coherente anti-Stokes dispersión Raman (CARS). Por lo tanto, la microscopía CARS ha surgido como una poderosa herramienta para imágenes de células biológicas y en directo, por los lípidos químicamente mapeo (a través de la vibración de estiramiento CH), agua (a través de las vibraciones de estiramiento OH), proteínas o ADN. En este trabajo se describe la aplicación de la técnica de los coches en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica OPO acoplado. Se basa en la sincronización en tiempo de las dos líneas de láser mediante el ajuste de la longitud de uno de la trayectoria del haz láser. Presentamos una implementación paso a paso de esta técnica en un sistema múltiple de fotones existentes. Una base de fondo en la óptica experimental es servicial y el sistema que se presenta no requiere costosos equipos suplementarios. También ilustramos CARS por imágenes obtenidas en las vainas de mielina del nervio ciático de roedores, y se muestra que esta imagen se puede realizar simultáneamente con otra óptica no lineal de imágenes, tal como t normawo-fotón técnica de fluorescencia y la generación de segundo armónico.

<html> La frecuencia de los trenes de impulsos de Ti estándar: láser de zafiro es típicamente alrededor de 80 MHz. La OPO tiene la misma frecuencia, ya que se bombea por el Ti: Zafiro láser. por lo tanto, se requiere un osciloscopio rápido de al menos 200 MHz. Un fotodiodo rápido en el rango también se requiere de 600 a 1.100 nm. El desplazamiento temporal máxima se produce cuando el Ti: las señales OPO zafiro y se desplazan de 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanosegundos. Se corresp...

Coherente dispersión anti-Stokes Raman (CARS) microscopía basada en la vibración inherente de la molécula se adhiere permite imágenes de células vivas químicamente selectivo libre de etiquetas. Este trabajo presenta la aplicación de una técnica de microscopía complementaria en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica basado en un femtosegundo Ti: zafiro láser y un láser de OPO.

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

El objetivo general de este procedimiento es implementar una técnica complementaria de microscopía denominada CARS, que permite imágenes sin marcado, selectivas desde el punto de vista químico y en condiciones de vida, utilizando un microscopio estándar de barrido láser multiphotón basado en un láser de titanio-safiro de femtosegundos y un oscilador paramétrico óptico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología o la neurociencia, como comprender enfermedades relacionadas con lípidos, mecanismos de penetración en la piel o trastornos dérmicos. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de implementar en un microscopio estándar de barrido láser basado en láseres Ti:Safiro y OPO.Quien demostrará el procedimiento será Hassan Boukhaddaoui, investigador asociado y responsable de la plataforma de imagen del laboratorio, y Vasyl Mytskaniuk. Encienda los láseres de titanio-zafiro y OPO según se indica en el protocolo escrito. Encienda la computadora del microscopio.Encienda los interruptores de los componentes del microscopio. Inicie el software haciendo doble clic en el icono del escritorio y configúrelo según el protocolo escrito. A continuación, coloque un espejo dicróico con una longitud de onda de corte a 760 nanómetros en el deslizador del puerto lateral.Búsquelo en el espacio de infinito por encima del portaobjetivos. Coloque el filtro de banda estrecha y el cubo de reflexión delante de PMT1 para registrar únicamente la señal CARS a 670 nanómetros y así reproducir los resultados presentados. Luego, coloque filtros de banda estrecha específicos delante de PMT3 para la observación de fluorescencia de la mielina y delante de PMT4 para la observación de SHG.En el software, configure la señal en el detector con un filtro paso banda ad hoc. Abra la herramienta de trayectoria de luz en el menú del administrador de configuración bajo la pestaña de adquisición, luego active el PMT deseado y seleccione un color para el canal. Por ejemplo, utilice verde para CARS y magenta para SHG.Los dos haces que se originan a partir del mismo láser de titanio zafiro no están sincronizados cuando llegan al microscopio porque el haz OPO se retrasa al generarse. Siga este procedimiento para volver a sincronizarlos ajustando la longitud de uno de los caminos del haz láser mediante la incorporación de una línea de retardo. Se requiere el uso de un fotodiodo rápido y un osciloscopio rápido.Primero, utilizando cables BNC, conecte el canal de entrada CH1 del osciloscopio a la salida eléctrica BNC de sincronización del láser. A continuación, conecte el canal de entrada CH2 al fotodiodo. Luego, seleccione el canal CH1 como disparador pulsando el menú de disparo, después el botón principal del menú de fuente y, a continuación, el botón del menú lateral que corresponde al canal seleccionado como CH1.Ahora coloque y fije con postes de montaje óptico al fotodiodo en el plano focal de un objetivo microscópico aéreo de 10x. En la herramienta Canales, defina la longitud de onda del láser de titanio-zafiro a 830 nanómetros a baja potencia, que es menos del 1 % de la potencia total. En la herramienta Modo de Adquisición, reduzca el área de escaneo a un solo punto con el fin de iluminar el fotodiodo con el haz más pequeño posible.Luego encienda el escaneo láser haciendo clic en el botón continuo. Presione Autoset en el osciloscopio y mueva manualmente el fotodiodo para obtener una serie de pulsos en la pantalla del osciloscopio. Presione el botón de ejecutar/detener para congelar la pantalla.A continuación, apague el escaneo del láser de titanio-zafiro. En el software, haga clic en la herramienta Canales, desactive el láser de 830 nanómetros y configure la señal del OPO en 1107 nanómetros y baja potencia. Luego encienda el escaneo del láser OPO, registre las series de pulsos del láser OPO en el osciloscopio y apague el escaneo del láser OPO.Ahora, compare el desplazamiento temporal entre las señales de titanio-zafiro y del OPO. Calcule la longitud de la línea de retardo, que se utilizará para posicionar los espejos. Antes de continuar, póngase gafas de seguridad y retire cualquier brazalete o reloj de las muñecas.Ahora, abra la línea láser de titanio-safiro donde se implementará la línea de retardo retirando los tubos protectores. Luego, seleccione una longitud de onda en el rango visible para poder observar fácilmente el haz láser, por ejemplo, 700 nanómetros a baja potencia, y active el barrido láser. Ahora coloque dos diafragmas de iris en la línea láser abierta utilizando los soportes ópticos.Coloque una iris en la salida de la línea de retardo y coloque la otra iris en la entrada del periscopio. A continuación, reduzca la abertura del diafragma iris y ajuste las posiciones del diafragma para que coincidan con la trayectoria del haz láser, luego fíjelos sobre la mesa óptica. Finalmente, ajuste la posición vertical de un tercer diafragma iris móvil.Los diafragmas de tamaño servirán como control para el procedimiento de realineación, a fin de verificar la posición del haz láser mientras se colocan sucesivamente los cuatro espejos de la línea de retardo. Ahora, coloque el espejo M1 sobre un soporte cinemático compacto para espejo en la entrada de la línea de retardo, y ajuste su posición y su orientación para mantener la altura del haz utilizando el diafragma de iris móvil. Luego, coloque los espejos M2 y M3 a 90 grados sobre la etapa de traslación según la longitud calculada de la línea de retardo, y ajuste su orientación utilizando el diafragma de iris móvil.Coloque el espejo M4 a la salida de la línea de retardo, justo antes del diafragma de iris, y ajuste cuidadosamente su posición y ángulo para que coincida con la trayectoria del haz láser a través de los dos diafragmas de iris fijos. A continuación, coloque la tarjeta de visualización del láser a la salida del objetivo del microscopio y verifique el perfil del haz láser. Si es necesario, ajuste ligeramente la orientación del espejo M4 para observar un disco brillante uniforme.Por último, reposicione el fotodiodo rápido debajo del haz láser en el plano focal de la muestra. Luego observe el desplazamiento temporal entre el haz láser de titanio-safiro y el haz OPO en el osciloscopio. Si es necesario, cambie la longitud de la línea de retardo moviendo toda la etapa de traslación para sincronizar los pulsos.La superposición espacial de los dos haces necesarios para una señal CARS se obtiene visualizando microesferas fluorescentes de poliestireno fijadas a una portaobjetos de microscopio. Enfóquese en las microesferas utilizando un objetivo acuático de 20x. A continuación, en la herramienta Canales de la pestaña de adquisición, agregue una pista o utilice la pista existente.Seleccione la longitud de onda a 830 nanómetros y baja potencia para el haz láser de titanio-zafiro. Cambie el color a verde en el cuadro de la pista uno de la ventana de canales, y en el cuadro del PMT3 o del PMT4 de la ventana de trayectoria de luz. A continuación, agregue la pista dos para el haz láser OPO y establezca la longitud de onda a 1107 nanómetros y baja potencia.Activea el color rojo en el cuadro de la pista dos de la ventana de canales y en el cuadro PMT3 o PMT4 de la ventana de trayectoria de luz. A continuación, selecciona el área máxima de escaneo y ajusta la ganancia de ambas pistas a 600. Luego, aplica secuencialmente el escaneo de los dos haces sobre la muestra haciendo clic en continuo.Observe la imagen en el área de la pantalla en la vista 2D. Aumente la potencia de ambos láseres. Si es necesario, mueva ligeramente el mecanismo de enfoque para encontrar el plano de enfoque de las perlas.Finalmente, ajuste el recorte y acerque la imagen a una sola perla o a un grupo de perlas adyacentes. A continuación, utilice el control del periscopio para superponer los haces en el plano XY. En el software, abra la pestaña Maintain.Haga clic en las opciones del sistema y muestre la ventana de herramientas del periscopio motorizado. Se describen más detalles en el protocolo escrito. Después de superponer las imágenes de ambos haces láser, se logra la sincronización.Para lograr el ajuste temporal preciso para activar CARS, prepare un portaobjetos de vidrio con una gota de aceite de oliva y una cubierta. Luego, utilizando un objetivo de inmersión en agua de 20x, enfoque en el borde de la cubierta. A continuación, en el canal uno, establezca la longitud de onda en 830 nanómetros para el haz láser de titanio-safiro y en 1107 nanómetros para el OPO.Active ambos láseres en la pista uno para obtener una escaneo simultáneo. Comience con ambos láseres a baja potencia. A continuación, en la ventana de trayectoria de luz, desactive PMT4 y seleccione PMT1.Luego, seleccione el área máxima de escaneo y active los escaneos con láser haciendo clic en el botón continuo. Ajuste la ganancia a 600 y, si es necesario, aumente la potencia en ambos láseres. A continuación, ajuste la intensidad de visualización en el bloque de control de la opción de vista de visualización.Luego, mueva lentamente la etapa de traslación de la línea de retardo hasta que la señal se intensifique significativamente. A continuación, disminuya la potencia de ambos láseres. Ahora, verifique si la señal es una señal CARS alternando la desconexión de uno de los dos láseres.Si la intensidad de la señal se debilita o desaparece, se ha obtenido una señal CARS. Dado que el sistema final está destinado a personas no especializadas en física, encierre el trayecto de la luz de la línea de retardo con una caja y tubos protectores para evitar el acceso directo a un haz láser peligroso, no visible y de alta potencia pico. Sin embargo, permita el acceso al botón del micrómetro del dispositivo de traslación.Se utilizó un colorante rojo fluromielina, que tiene selectividad para la mielina, para observar la vaina de mielina. La iluminación simultánea a 830 y a 1095 nanómetros proporciona una señal CARS. Los círculos corresponden a la vaina de mielina que rodea los axones en un corte transversal.La misma estructura se observa al superponer imágenes de CARS y de fluorescencia. El nivel de detalle de CARS y del marcado fluorescente es muy similar. Esto podría eliminar la necesidad de usar colorantes.El sistema también puede generar simultáneamente una señal de segundo armónico a partir de las fibras de colágeno en la superficie externa de los nervios ciáticos. Se utiliza un detector diferente para registrar una señal a 550 nanómetros, ya que se emplea un filtro de paso de banda estrecha a 670 nanómetros para la grabación de la señal CARS. Las fibras se ilustran con un color magenta falso.La señal CARS por sí sola muestra claramente las vainas de mielina. Al visualizar simultáneamente ambas señales, se observan las vainas de mielina en verde rodeadas por fibras de colágeno en magenta. Una señal CARS requiere menos energía que las señales SHG o THG.Las señales CARS se obtuvieron con cuatro milivatios a 830 nanómetros y 13 milivatios a 1095 nanómetros, mientras que se requirieron 50 milivatios a 1095 nanómetros para obtener una señal SHG. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo modificar paso a paso una de las trayectorias del haz láser para sincronizar temporalmente ambos haces láser. La implementación de la línea de retardo puede lograrse en unas pocas semanas por biólogos con conocimientos básicos en óptica experimental o en colaboración con físicos.No olvide que trabajar con haces láser de alta potencia e invisibles puede ser extremadamente peligroso. Se deben tomar precauciones, como usar gafas protectoras durante el procedimiento y encerrar completamente el recorrido del haz láser.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una combinación de tres única longitud de onda de pulso corto láser se utiliza para generar coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS) y el CARS doblemente resonante (DR-CARS). La diferencia entre estas señales proporciona una mayor sensibilidad de otro modo difíciles de detectar señales de Raman coherente, lo que permite imágenes de la debilidad de dispersores Raman.

Diferencial de imágenes de las estructuras biológicas con doblemente resonante coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Fuente: Espinoza, R., et al. Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro de ratón para el diagnóstico de tejidos. J. Vis. Exp. (2022).  El video muestra imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) de dos colores de secciones de tejido cerebral de ratón. Dos rayos láser sincronizados se dirigen a la sección del tejido para excitar vibraciones moleculares, lo que resulta en un cambio de intensidad relativa en los haces. Los lípidos y las proteínas en el...

Imágenes de dispersión Raman estimulada a dos colores del tejido cerebral de ratón

En este manuscrito, se describe la implementación de un microscopio de dispersión Raman (SRS) estimulado, obtenido mediante la integración de una configuración experimental SRS con un microscopio de escaneo láser. El microscopio SRS se basa en dos fuentes láser de femtosegundo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) y un oscilador paramétrico óptico sincronizado (OPO).

Implementación de un microscopio no lineal basado en la dispersión estimulada de Raman

Se describe una metodología coherente de imágenes de dispersión Raman para visualizar y cuantificar compuestos farmacéuticos dentro de la piel. Este artículo describe la preparación del tejido de la piel (humano y ratón) y la aplicación de formulación tópica, la adquisición de imágenes para cuantificar los perfiles de concentración espaciotemporal y el análisis farmacocinético preliminar para evaluar la administración tópica de fármacos.

Visualización y cuantificación de compuestos farmacéuticos dentro de la piel utilizando imágenes de dispersión Raman coherente

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

La imagen electrónica de dispersión Raman estimulada por pre-resonancia (epr-SRS) de tintes Raman similares al arco iris es una nueva plataforma para imágenes de proteínas basadas en epítopos altamente multiplexados. Aquí, presentamos una guía práctica que incluye preparación de anticuerpos, tinción de muestras de tejido, ensamblaje de microscopio SRS e imágenes de tejido epr-SRS.

Imágenes de tejidos altamente multiplexados con tintes Raman

Este artículo presenta la integración de un módulo de enfoque espectral y un láser de pulso de doble salida, lo que permite obtener imágenes hiperespectrales rápidas de nanopartículas de oro y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas ópticas no lineales multimodales en un microscopio de escaneo láser estándar.

Imágenes biomoleculares de la captación celular de nanopartículas mediante microscopía óptica multimodal no lineal

Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.

Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

Visualizar la mielinización es un objetivo importante para muchos investigadores que estudian el sistema nervioso. CARS es una técnica que es compatible con la inmunofluorescencia que puede obtener imágenes nativas de lípidos dentro de tejidos como el cerebro que iluminan estructuras especializadas como la mielina.

Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

Aprende a implementar microscopía CARS para imagen celular sin marcadores usando láseres Ti:zafiro y OPO. Esta técnica permite estudiar procesos biológicos y enfermedades relacionadas con lípidos en tiempo real.

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido (Video) | JoVE Journal

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

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