Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

El objetivo general de este procedimiento es implementar una técnica de microscopía complementaria llamada CARS, que permite obtener imágenes de estilo de vida sin etiquetas, químicamente selectivas en un microscopio de escaneo láser multifotónico estándar basado en un láser de titanio-zafiro de femtosegundo y un oscilador de parámetros ópticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología o la neurociencia, como la comprensión de las enfermedades relacionadas con los lípidos, los mecanismos de penetración de la piel o los trastornos de la piel. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de implementar en una microscopía de barrido láser estándar basada en láseres Ti:Zafiro y OPO.

Hassan Boukhaddaoui, investigador asociado y jefe de la plataforma de imágenes del laboratorio, y Vasyl Mytskaniuk, demostrarán el procedimiento. Encienda los láseres de titanio-zafiro y OPO como se presenta en el protocolo de texto. Encienda la computadora del microscopio.

Encienda los interruptores de los componentes del microscopio. Inicie el software haciendo doble clic en el icono en el escritorio y configúrelo de acuerdo con el protocolo de texto. Luego, coloque un espejo dicroico con una longitud de onda de corte de 760 nanómetros en el control deslizante del puerto lateral.

Ubícalo en el espacio infinito sobre la pieza de la nariz del objetivo. Configure el filtro de paso de banda estrecha y el cubo reflector frente a PMT1 para grabar solo la señal CARS a 670 nanómetros para reproducir los resultados presentados. A continuación, coloque filtros específicos de banda estrecha delante de PMT3 para la observación de fluorescencia de la mielina y delante de PMT4 para la observación de SHG.

En el software, configure la señal en el detector con un filtro de paso de banda ad hoc. Abra la herramienta de trayectoria de luz en el menú del administrador de configuración en la pestaña de adquisición, luego active el PMT deseado y seleccione un color para el canal. Por ejemplo, use verde para CARS y magenta para SHG.

Los dos haces que se originan en el mismo láser de zafiro de titanio no están sincronizados cuando llegan al microscopio porque el haz de OPO se retrasa cuando se genera. Siga este procedimiento para volver a sincronizarlos ajustando la longitud de una de las almohadillas del rayo láser incorporando una línea de retardo. Se requiere el uso de un fotodiodo rápido y un osciloscopio rápido.

Primero, usando cables BNC, conecte el canal de entrada CH1 del osciloscopio a la salida de sincronización de salida láser BNC eléctrica. A continuación, conecte el canal de entrada CH2 al fotodiodo. A continuación, elija el canal CH1 como disparador pulsando el menú de disparo, luego la fuente del botón del menú principal y luego el botón del menú lateral que corresponde al canal seleccionado como CH1.

Ahora colóquelo y fíjelo con postes de montaje óptico al fotodiodo en el plano focal de un objetivo de microscopio de aire 10x. En la herramienta Canales, defina la longitud de onda del láser de titanio-zafiro a 830 nanómetros a baja potencia, que es menos del 1% de la potencia total. En la herramienta Modo de adquisición, reduzca el área de escaneo a un punto para iluminar el fotodiodo con el haz más pequeño.

A continuación, encienda el escaneo láser haciendo clic en el botón continuo. Presione Autoset en el osciloscopio y mueva manualmente el fotodiodo para obtener un tren de pulsos en la pantalla del osciloscopio. Presione el botón run/stop para congelar la pantalla.

A continuación, apague el escaneo láser de titanio-zafiro. En el software, haga clic en la herramienta Canales, anule la selección del láser de 830 nanómetros y establezca la señal OPO en 1107 nanómetros y baja potencia. A continuación, encienda el escaneo láser OPO, registre los trenes de pulsos del láser OPO en el osciloscopio y apague el escaneo láser OPO.

Ahora, compare el cambio temporal entre las señales de titanio-zafiro y OPO. Calcule la longitud de la línea de retardo, que se utilizará para colocar los espejos. Antes de continuar, póngase las gafas de seguridad y quítese los brazaletes de cadena o los relojes de las muñecas.

Ahora, abra la línea láser de titanio-zafiro donde se implementará la línea de retardo quitando los tubos protectores. A continuación, seleccione una longitud de onda en el rango visible para poder observar fácilmente el rayo láser, por ejemplo, 700 nanómetros a baja potencia, y encienda el escaneo láser. Ahora coloque dos diafragmas de iris en la línea láser abierta usando los postes de montaje óptico.

Coloque un iris a la salida de la línea de retardo y coloque el otro iris en la entrada del periscopio. A continuación, disminuya la apertura del diafragma del iris y ajuste las posiciones del diafragma para que se ajusten a la trayectoria del rayo láser, luego fíjelos en la mesa óptica. Por último, ajuste la posición vertical de un tercer diafragma de iris móvil.

Los diafragmas de tamaño servirán como control para el procedimiento de realineación para verificar la posición del rayo láser mientras se colocan sucesivamente los cuatro espejos de la línea de retardo. Ahora, coloque el espejo M1 en un soporte de espejo cinemático compacto en la entrada de la línea de retardo y ajuste su posición y su orientación para mantener la altura del haz con el uso del diafragma de iris móvil. A continuación, coloque los espejos M2 y M3 a 90 grados en la platina de traslación según la longitud de la línea de retardo calculada y ajuste su orientación con el diafragma de iris móvil.

Ajuste M4 en la salida de la línea de retardo justo antes del iris y ajuste cuidadosamente su posición y ángulo para que se ajuste a la trayectoria del rayo láser a través de los dos diafragmas de iris fijos. Ahora coloque la tarjeta de visualización láser en la salida del objetivo del microscopio y verifique el perfil del rayo láser. Si es necesario, ajuste ligeramente la orientación de M4 para observar un disco brillante uniforme.

Por último, vuelva a colocar el fotodiodo rápido debajo del rayo láser en el plano de enfoque de la muestra. A continuación, observe el cambio temporal entre el rayo láser de titanio-zafiro y el haz OPO en el osciloscopio. Si es necesario, cambie la longitud de la línea de retardo moviendo toda la etapa de traslación para sincronizar los pulsos.

La superposición espacial de los dos haces necesarios para una señal CARS se obtiene visualizando perlas de poliestireno fluorescente fijadas a un portaobjetos de microscopio. Concéntrese en las cuentas usando un objetivo de agua 20x. Ahora, en la herramienta Canales de la pestaña de adquisición, agregue la pista uno o use la pista existente.

Seleccione la longitud de onda a 830 nanómetros y baja potencia para el rayo láser de titanio-zafiro. Cambie el color a verde en el cuadro de la pista uno de la ventana Canales y el cuadro PMT3 o PMT4 de la ventana de ruta de luz. A continuación, agregue la pista dos para el rayo láser OPO y establezca la longitud de onda en 1107 nanómetros y baja potencia.

Cambie el color a rojo en el cuadro de la pista dos de la ventana Canales y en el cuadro PMT3 o PMT4 de la ventana de la ruta de luz. Ahora, seleccione el área máxima de escaneo y ajuste la ganancia de ambas pistas a 600. A continuación, aplique secuencialmente el escaneo de los dos haces sobre la muestra haciendo clic en continuo.

Observe la imagen en el área de la pantalla en la vista 2D. Aumenta la potencia de ambos láseres. Si es necesario, mueva ligeramente la unidad de enfoque para encontrar el plano de enfoque de las cuentas.

Por último, ajusta el recorte y amplía la imagen en una sola cuenta o en un grupo de cuentas adyacentes. A continuación, utilice el controlador de periscopio para superponer los haces en el plano XY. En el software, abra la pestaña Mantener.

Haga clic en las opciones del sistema y muestre la ventana de herramientas del periscopio motorizado. Se discuten más detalles en el protocolo de texto. Después de superponer las imágenes de ambos rayos láser, se logra la sincronización.

Para lograr el ajuste temporal preciso para activar CARS, prepare un portaobjetos de vidrio con una gota de aceite de oliva y cubra el cubreobjetos. Luego, usando un objetivo de inmersión en agua de 20x, concéntrese en el borde del cubreobjetos. Ahora, en la pista uno, se establece la longitud de onda en 830 nanómetros para el rayo láser de titanio-zafiro y en 1107 nanómetros para el OPO.

Alterne ambos láseres en la pista uno para obtener un escaneo simultáneo. Comience con ambos láseres a baja potencia. A continuación, en la ventana de la ruta de luz, desmarque PMT4 y seleccione PMT1.

A continuación, elija el área máxima de escaneo y active los escaneos láser haciendo clic en el botón continuo. Ajuste la ganancia a 600 y, si es necesario, aumente la potencia de ambos láseres. A continuación, ajuste la intensidad de la pantalla en el bloque de control de opciones de visualización de visualización.

A continuación, mueva lentamente la etapa de traducción de la línea de retardo hasta que la señal mejore significativamente. A continuación, disminuya la potencia de ambos láseres. Ahora, compruebe si la señal es una señal CARS apagando alternativamente uno de los dos láseres.

Si la intensidad de la señal se debilita o desaparece, se ha obtenido una señal CARS. Dado que el sistema final está dedicado a los no físicos, encierre la trayectoria de luz de la línea de retardo con una caja de carcasa y tubos para evitar el acceso directo a un rayo láser dañino, no visible y de alta potencia. Sin embargo, proporcione acceso a la perilla de la etapa de traducción.

Se utilizó un colorante rojo de flurometilina, que tiene selectividad para la mielina, para observar la vaina de mielina. La iluminación simultánea a 830 y 1095 nanómetros proporciona una señal CARS. Los círculos corresponden a la vaina de mielina que rodea los axones en un corte transversal.

La misma estructura se encuentra mientras se superponen las imágenes de CARS y fluorescencia. El nivel de detalle de los CARS y el etiquetado fluorescente es muy similar. Potencialmente obviando la necesidad del uso de tintes.

El sistema también puede generar simultáneamente una segunda señal armónica a partir de las fibras de colágeno al servicio externo de los nervios ciáticos. Se utiliza un detector diferente para registrar una señal a 550 nanómetros, ya que se utiliza un filtro de paso de banda estrecha a 670 nanómetros para el registro de la señal CARS. Las fibras están ilustradas por un falso color magenta.

La señal CARS por sí sola muestra claramente las vainas de mielina. Al visualizar simultáneamente ambas señales, las vainas de mielina en verde se ven rodeadas de fibras de colágeno en magenta. Una señal CARS requiere menos energía que las señales SHG o THG.

Las señales CARS se lograron con cuatro milivatios a 830 nanómetros y 13 milivatios a 1095 nanómetros, mientras que se requirieron 50 milivatios a 1095 nanómetros para obtener una señal SHG. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modificar paso a paso una de las trayectorias del rayo láser para sincronizar temporalmente ambos rayos láser. La implementación de la línea de retardo puede lograrse en unas pocas semanas por biólogos con conocimientos básicos en óptica experimental o en colaboración con físicos.

No olvide que trabajar con rayos láser invisibles de alta potencia puede ser extremadamente peligroso. Y se deben tomar precauciones, como el uso de gafas protectoras mientras se realiza el procedimiento y el cierre final de la trayectoria del rayo láser.