Name: La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende a medir la fagocitosis de granulocitos y monocitos y la actividad de explosión oxidativa en sangre humana mediante citometría de flujo. Esta técnica sencilla permite evaluar la función inmune innata en estudios de ejercicio y nutrición.

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Los autores desean reconocer Zack Shue, Casey John y Lynn Cialdella-Kam por su ayuda durante la optimización de este procedimiento.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para la determinación de dos indicadores de granulocitos y la función de monocitos. Hemos identificado algunos pasos que son críticos para el éxito de este ensayo. Una de estas medidas es la incubación baño de hielo que se produce inmediatamente antes de la adición de bacterias. enfriamiento a fondo de todas las muestras minimizará el efecto de la temperatura sobre la actividad de fagocitosis y OB. Otro paso crítico es la adición de las bacterias a cada muestra. Un 8:...

El granulocitos y monocitos fagocitosis / explosión oxidativa (OB) ensayo de actividad es una técnica simple y directa que se utiliza con frecuencia para reunir información acerca de la función inmune innata después de un ejercicio prolongado e intensivo. 1-4 Al estudiar la respuesta del sistema inmune a un estímulo, los granulocitos y los monocitos son de particular interés, ya que juegan un papel central en la defensa del huésped y son las primeras células inmunes a acumularse en el sitio de infección. 5 neutrófilos, un tipo de granulocitos, son las primeras células de translocación de en el músculo dañado de tejidos después de un ejercicio intenso. 6 la fagocitosis y la actividad de OB son las medidas más comunes de granulocitos y monocitos función, 7 y se prefieren como indicadores de la función celular inmune innato debido a su papel central tanto en el proceso de infección y el proceso de reparación. El ensayo descrito en este manuscrito utilizes un flujo básico citómetro para proporcionar una determinación cuantitativa de granulocitos y la fagocitosis de monocitos y la actividad OB en la sangre entera. El uso de sangre total en esta técnica es ventajosa porque permite que el ensayo se lleva a cabo sin un procedimiento de purificación que consume tiempo. Este ensayo se puede modificar fácilmente para acomodar una variedad de diseños de investigación y capacidades de laboratorio. Por ejemplo, Liao et al. Utilizó una técnica similar para mostrar que la actividad de neutrófilos OB se incrementa y neutrófilos fagocitosis se disminuye después de una lesión cerebral traumática. 8 En otro ejemplo, McFarlin et al. Describe un elegante modificación de esta técnica que utiliza aloficocianina (APC ) conjugado con CD66b y CD45 etiquetado APC-conjugado tándem de alto rendimiento con la imagen basada en citometría de flujo para clasificar los granulocitos en términos de sus actividades fagocitosis y OB 7,9. Nuestro grupo de investigación ha utilizado diversas adaptaciones de la presente technique como un indicador de la función inmune innata en poblaciones con sobrepeso, obesos, y atléticas durante casi 20 años. 10,11 El texto a continuación proporcionará al lector con instrucciones paso a paso para realizar este ensayo y destacar las áreas que el lector pueda adaptarse para satisfacer las necesidades de sus investigaciones.

<table><tbody><tr><td>12 tubos de 75 mm, con tapón</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Necesitará 2 tubos por muestra ("H" y "F") más 3 tubos por lote (para controles de ensayo; "F", "H" y "Solo sangre").</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de botella 0.2 y micro; m filtro de acetato de celulosa (capacidad de 500 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa, polvo</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico (anhidro, cultivo celular probado, cultivo celular vegetal probado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio tribásico dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetidio (Hidroetidina) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilo sulfóxido (DMSO) Anhydrous</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Cepa de madera sin proteína A) Biopartículas, conjugado con fluoresceína (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Cepa de madera sin proteína A) Biopartículas, sin etiquetar</td><td>Life</td><td>Technologies S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Solución Azul de Tripano, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer de 4,0 ml que contiene 7,2 mg de K2EDTA, VWR secado por pulverización</td><td></td><td>BD367861</td><td>Necesitará 1 tubo de extracción de sangre K2EDTA por muestra.</td></tr><tr><td>Vacutainer de 4,0 ml que contiene 68 unidades USP de heparina de litio, VWR recubierta con spray</td><td></td><td>BD367884</td><td>Necesitará 1 tubo de extracción de sangre de heparina de litio por muestra.</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>i.e., analizador de hematología</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Enjuague</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER ac&middot; T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Cal Calibrador</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Diluyente</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l puntas de pipeta de longitud extendida</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de hielo aislada</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Para baño de agua helada.</td></tr><tr><td>Gradilla metálica abierta</td><td>para tubos VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Estación de trabajo TQ-Prep</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e., estación de trabajo automatizada de preparación de lisis celular</td></tr><tr><td>ImmunoPrep Sistema de reactivos</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e., sistema de reactivos fijos RBC lyse/WBC</td></tr><tr><td>Sistema de citometría de flujo Cytomics FC500 MCL con software CXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosferas de control de flujo&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>i.e., alineación y verificación de fluidos fluorosferas</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Software FlowJo FlowJo FlowJo</td><td></td><td>i.e., software de análisis de citometría de flujo Excel</td></tr><tr><td>Software</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>i.e., programa de hojas de cálculo electrónicas</td></tr></tbody></table>

la medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

El ensayo de fagocitosis de granulocitos y monocitos y actividad de estallido oxidativo (OB) se puede utilizar para estudiar el sistema inmune innato. Este manuscrito proporciona la metodología necesaria para añadir este ensayo a un arsenal de inmunología del ejercicio. El primer paso en este ensayo es preparar dos alícuotas ("H" y "F") de sangre total (heparina). Luego, se agrega dihidroetidio a la alícuota de H, y ambas alícuotas se incuban en un baño de agua tibia seguido de un baño de agua fría. A continuación, se añade Staphylococcus aureus (S. aureus) a la alícuota H y S. aureus marcado con isotiocianato de fluoresceína a la alícuota F (bacteria:fagocito = 8:1), y ambas alícuotas se incuban en un baño de agua tibia seguido de un baño de agua fría. Luego, se agrega azul de tripano a cada alícuota para apagar la fluorescencia extracelular y las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se lisan los glóbulos rojos y se fijan los glóbulos blancos. Por último, se utiliza un citómetro de flujo y un software de análisis adecuado para medir la fagocitosis de granulocitos y monocitos y la actividad de OB. Este ensayo se ha utilizado durante más de 20 años. Después de un esfuerzo intenso y prolongado, los atletas experimentan un aumento significativo pero transitorio de la fagocitosis y una disminución prolongada de la actividad obstétrica. El aumento de la fagocitosis después del ejercicio se correlaciona con la inflamación. A diferencia de los individuos de peso normal, la fagocitosis de granulocitos y monocitos está crónicamente elevada en los participantes con sobrepeso y obesidad, y se correlaciona modestamente con la proteína C reactiva. En resumen, este ensayo basado en citometría de flujo mide la fagocitosis y la actividad OB de los fagocitos y se puede utilizar como una medida adicional de la inflamación inducida por el ejercicio y la obesidad.

ejercicio prolongado e intensivo tiene profundos efectos en la función inmune innata, incluyendo función natural killer celular, la respuesta de macrófagos mediada por citoquinas a la infección viral, y de granulocitos y la fagocitosis de monocitos y la actividad OB. Múltiples estudios indican que los granulocitos y monocitos fagocitosis aumenta significativamente después del ejercicio, lo que refleja la inflamación inducida por el daño muscular y las demandas metabólicas. En contraste, ...

El propósito de este manuscrito es presentar un método para medir la fagocitosis de monocitos y granulocitos y la actividad de estallido oxidativo en muestras de sangre humana.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

El objetivo general de este ensayo es medir la fagocitosis y la actividad del estallido oxidativo de granulocitos y monocitos en sangre completa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo afecta una intervención dietética determinada a la respuesta inmunitaria al ejercicio. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un ensayo sencillo y directo que puede modificarse fácilmente según los recursos disponibles en el laboratorio y los intereses de investigación.Estamos utilizando esta medida de la función inmunitaria innata desde hace dos décadas en muchos de nuestros ensayos de ejercicio, y compartiremos algunos de estos datos más adelante en el video. Antes de comenzar el procedimiento, utilice un analizador hematológico para realizar un recuento sanguíneo completo con análisis diferencial de glóbulos blancos en las muestras de sangre según las instrucciones del fabricante. Anote el recuento de glóbulos blancos en células por mililitro y los valores porcentuales de neutrófilos y monocitos para las muestras.Luego, para cada tubo experimental y de control, utilice una punta de pipeta de longitud extendida para transferir

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Inmunología e Infección

Este video muestra un método para cuantificar la fagocitosis de esporas de hongos patógenos marcados con FITC por leucocitos humanos. Las esporas fagocitadas se distinguen de las esporas adherentes a las células mediante la contratinción, seguida de un análisis de citometría de flujo.

Medición cuantitativa por citometría de flujo de la fagocitosis de esporas fúngicas por fagocitos humanos

Este video muestra el ensayo para confirmar la actividad fagocítica de las células en la sangre humana a través de la citometría de flujo. Los granulocitos y monocitos confirman su actividad fagocítica al mostrar fluorescencia verde y roja, lo que confirma la presencia de bacterias engullidas y la actividad de estallido oxidativo, respectivamente.

Un ensayo para evaluar la fagocitosis y la actividad de estallido oxidativo en granulocitos y monocitos

Este video muestra un ensayo de monocapa de monocitos que utiliza monocitos primarios de sangre periférica para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fcγ con glóbulos rojos R2R2 opsonizados con anticuerpos poli D.

Un ensayo para el estudio de la fagocitosis impulsada por el receptor Fcγ en monocapas de monocitos

Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Leucocitos de la sangre y las plaquetas pueden ser utilizados como un marcador bioenergético de la salud general de un individuo y así tienen el potencial para controlar procesos patológicos y el impacto de los tratamientos. Aquí se describe un método para aislar y medir la función mitocondrial y la explosión oxidativa en estas células.

Bioenergética y los Oxidativo ráfaga: Los protocolos para el aislamiento y la Evaluación de leucocitos humanos y plaquetas

Este método demuestra una técnica para evaluar la función de los granulocitos midiendo simultáneamente la fagocitosis de las bacterias y el estallido oxidativo. La citometría de flujo basada en imágenes permitió la identificación de tres subconjuntos distintos de granulocitos activados que diferían en su capacidad funcional relativa.

Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos In Vitro

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El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

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Haemophilus influenzae induce inflamación en el tracto respiratorio. Este artículo se centrará en el uso de la citometría de flujo y la microscopía confocal para definir las respuestas inmunes de fagocitos y linfocitos en respuesta a esta bacteria.

Evaluación de las respuestas inmunitarias respiratorias a Haemophilus influenzae

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Predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos mediante el ensayo de monocitos y macrófagos

Este trabajo describe un protocolo estandarizado in vitro para cuantificar y comparar las tasas de fagocitosis de glóbulos rojos xenogénicos (humanos) y alogénicos (rata) por macrófagos de rata aislados.

Una evaluación cuantitativa de la fagocitosis de eritrocitos alogénicos y xenogénicos por macrófagos de rata in vitro

Aprende a medir la fagocitosis de granulocitos y monocitos y la actividad de explosión oxidativa en sangre humana mediante citometría de flujo. Esta técnica sencilla permite evaluar la función inmune innata en estudios de ejercicio y nutrición.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

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