-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células endoteliales de la vena umbilical humana y analizar la dinámica del citoesqueleto y la migración celular utilizando imágenes de lapso de tiempo de células vivas. Los métodos descritos en este video pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, molecular y mecanobiología. Por ejemplo, este protocolo se puede utilizar para identificar cómo la forma y la motilidad de la célula se modulan mediante la participación de diferentes ECM.

La demostración visual es fundamental porque los pasos de preparación de la muestra son difíciles de realizar. Requieren un manejo preciso de las células de manera oportuna durante todo el proceso. Aunque este método puede proporcionar información sobre la motilidad de las células endoteliales durante la angiogénesis, también se puede aplicar a investigaciones microscópicas de prácticamente cualquier sistema modelo de células adherentes.

Con fórceps, tome un cubreobjetos de un frasco de almacenamiento de etanol al 100% y páselo a través de la llama de un mechero Bunsen para esterilizarlo. Luego colócalo en una placa de Petri de 35 milímetros. Prepare un cubreobjetos para cada muestra.

A un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros añadir 10 microlitros de un miligramo por mililitro de solución madre de fibronectina y 990 microlitros de PBS. A continuación, pipetee 250 microlitros de la solución en cada cubreobjetos. Extienda la solución uniformemente para cubrir la superficie.

Incubar los cubreobjetos durante un mínimo de tres horas a 37 grados centígrados. Antes de usar, enjuague cada cubreobjetos tres veces con dos mililitros de PBS. Utilizando un hemocitómetro, determine el número de HUVEC cultivados y transfiera un volumen que contenga 100.000 células por cubreobjetos para los experimentos de no migración, o 500.000 células por cubreobjetos para los experimentos de migración a un tubo de microcentrífuga.

Gire las celdas a 1, 400 veces por G durante cuatro minutos para pelletizarlas. Después del centrifugado, para cada condición que se vaya a probar, resuspenda hasta un millón de células en 100 microlitros de tampón de electroporación y combínelas con un microgramo de ADNc. Transfiera las celdas a una cubeta de electroporación.

Transfecte las células y la mezcla de ADN utilizando el programa designado para la electroporación HUVEC. A continuación, rescata las células transfectadas añadiendo 500 microlitros de medio basal endotelial completo. A continuación, coloque el volumen celular adecuado en cubreobjetos recubiertos de fibronectina.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante tres o cuatro horas para dar tiempo a la expresión de las construcciones de ADNc. En preparación para la toma de imágenes, tome dos tiras de cinta adhesiva de doble cara de 2,5 centímetros por 0,65 centímetros y asegúrelas horizontalmente a lo largo del borde superior e inferior de un portaobjetos de vidrio limpio. Tenga en cuenta que es importante dejar una pequeña cantidad de espacio entre la cinta y el borde de la corredera para sellar la cámara.

Monte el cubreobjetos con el lado de la celda hacia abajo de modo que los dos bordes del cubreobjetos descansen sobre la cinta. Use fórceps para presionar suavemente hacia abajo para asegurar el cubreobjetos. Con una micropipeta, agregue 40 microlitros de medio de imagen entre el cubreobjetos y el portaobjetos.

Asegúrese de que el espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos esté completamente lleno de medio de imagen. Seque el exceso de medio con una toallita de papel si es necesario. Selle todos los bordes de la corredera con VALAP tibio.

Compruebe si hay fugas empujando suavemente el cubreobjetos de vidrio. Coloque el cubreobjetos montado y sellado en una platina de microscopio precalentada a 37 grados centígrados. Con un microscopio confocal de disco giratorio, capture secuencias de imágenes de lapso de tiempo, imágenes de proteínas fluorescentes azules e imágenes DIC.

Analice la dinámica de los microtúbulos y la colocalización como se describe en el documento adjunto. Para realizar un ensayo de migración celular, después de la etapa de electroporación, rescatar las células transfectadas mediante la adición de 80 microlitros de medio basal endotelial completo. A continuación, pipetee toda la muestra de 80 microlitros como una sola gota en el centro de un cubreobjetos seco recubierto de fibronectina.

No esparza la gota. Es necesario secar el cubreobjetos para evitar que la gota de 80 microlitros se separe al entrar en contacto con el cubreobjetos. Este enfoque permite que los HUVC se concentren dentro de una pequeña área del cubreobjetos y, por lo tanto, promueve la rápida formación de una monocapa confluente de células.

Incube el cubreobjetos a 37 grados centígrados durante tres o cuatro horas para dar tiempo a que las células se adhieran en una monocapa confluente. A continuación, enjuague los portaobjetos dos veces en medio basal endotelial completo para eliminar las células que no se hayan adherido. Para crear un borde de herida en la monocapa HUVEC, use pinzas para sujetar suavemente el cubreobjetos en su lugar y arrastre firmemente una hoja de afeitar por el centro de la monocapa celular.

Deje que las células se recuperen en una incubadora a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, ensamble y monte las cubiertas para obtener imágenes como antes. Adquiera imágenes de contraste de fase a intervalos de 10 minutos durante 12 horas utilizando un objetivo de fase de apertura numérica de 10X 0,45 y un condensador de larga distancia de trabajo de apertura numérica de 0,52.

Utilice el panel ND Acquisition del programa de software de adquisición de imágenes. Por último, cuantifique la ramificación y la migración de HUVEC como se describe en el documento adjunto. Los HUVEC se transfectaron para expresar EB3 marcado con mApple, una proteína de unión al extremo de los microtúbulos, y se capturaron imágenes de lapso de tiempo.

A la izquierda se muestran imágenes en bruto de EB3. Los cometas azules EB3 rastreados por el software plusTipTracker se muestran a la derecha. Los cometas detectados dentro de cada fotograma se vincularon en función de su cambio de posición de fotograma a fotograma para generar pistas EB3 y una superposición visual de pistas EB3, como se muestra aquí.

El crecimiento lento y de corta vida de los microtúbulos se muestra en rojo, el crecimiento lento y longevo de los microtúbulos se muestra en verde, el crecimiento rápido y de corta vida de los microtúbulos se muestra en amarillo y el crecimiento rápido y longevo de los microtúbulos se muestra en azul. Para analizar la ramificación de las células endoteliales, se capturó una DIC y una imagen fluorescente de un HUVEC individual con un aumento de 60 veces. Se dibujó a mano un límite alrededor del borde de la célula en la imagen fluorescente.

Los orígenes de las ramas se definieron dibujando una línea recta a través de la rama y a través del mayor ángulo de curvatura a cada lado de la rama. Se contaron las ramas que eran más largas que anchas y de un mínimo de 10 micras de longitud y se midió la longitud desde el origen de la rama hasta la punta distal de la misma. Para evaluar la migración del borde de la herida de las células endoteliales, las HUVEC se cultivaron a alta densidad y se realizaron imágenes de lapso de tiempo de células vivas después de la herida, como se describe en este video.

Como se muestra aquí, las células endoteliales del borde de la herida migraron direccionalmente hacia el área de la herida. Este movimiento se analizó utilizando el nucléolo como marcador fiduciario para rastrear la velocidad de migración, la persistencia y la distancia. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar, transfectar y preparar HUVEC para experimentos de imágenes de forma celular y dinámica del citoesqueleto o para estudios de migración celular en el borde de la herida.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la poliacrilamida o la conjugación de colágeno para responder a preguntas adicionales relacionadas con la participación celular de las ECM modificadas. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.