-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células endoteliales de vena umbilical humana y analizar la dinámica del citoesqueleto y la migración celular mediante imágenes de lapso de tiempo en células vivas. Los métodos descritos en este video pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, molecular y mecanobiología. Por ejemplo, este protocolo puede utilizarse para identificar cómo la forma celular y la motilidad son moduladas por la interacción con diferentes matrices extracelulares (ECM).

La demostración visual es fundamental porque los pasos de preparación de la muestra son difíciles de realizar. Requieren un manejo preciso de las células de manera oportuna durante todo el proceso. Aunque este método puede proporcionar información sobre la motilidad de las células endoteliales durante la angiogénesis, también puede aplicarse a investigaciones microscópicas de prácticamente cualquier sistema modelo de células adherentes.

Usando pinzas, tome una laminilla de un frasco de almacenamiento con etanol al 100 % y pásela a través de la llama de un mechero Bunsen para esterilizarla. Luego colóquela en una placa de Petri de 35 milímetros. Prepare una laminilla para cada muestra.

A un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, añada 10 microlitros de una solución stock de fibronectina de 1 miligramo por mililitro y 990 microlitros de PBS. Luego, pipetee 250 microlitros de la solución sobre cada cubreobjetos. Distribuya la solución uniformemente para cubrir toda la superficie.

Incube los cubreobjetos durante un mínimo de tres horas a 37 grados Celsius. Antes de usarlos, enjuague cada cubreobjeto tres veces con dos mililitros de PBS. Mediante un hemocitómetro, determine el número de HUVECs cultivadas y transfiera un volumen que contenga 100.000 células por cubreobjeto para experimentos de no migración, o 500.000 células por cubreobjeto para experimentos de migración, a un tubo de microcentrifugado.

Centrifugar las células a 1.400 × g durante cuatro minutos para formar el pellet. Después de la centrifugación, para cada condición que se va a probar, resuspender hasta un millón de células en 100 microlitros de tampón de electrotransferencia y combinarlas con un microgramo de ADNc. Transferir las células a una cubeta de electrotransferencia.

Transfecte las células y la mezcla de ADN utilizando el programa designado para la electroforesis de HUVEC. A continuación, recupere las células transfectadas añadiendo 500 microlitros de medio basal endotelial completo. Luego, siembre el volumen celular apropiado sobre cubreobjetos recubiertos con fibronectina.

Incube las células a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas para permitir tiempo para la expresión de los constructos de ADNc. En preparación para la obtención de imágenes, tome dos tiras de cinta adhesiva doble cara de 2,5 centímetros por 0,65 centímetros y fíjelas horizontalmente a lo largo de los bordes superior e inferior de un portaobjetos limpio. Tenga en cuenta que es importante dejar un pequeño espacio entre la cinta y el borde del portaobjetos para sellar la cámara.

Coloque el cubreobjetos con el lado de las células hacia abajo de modo que los dos bordes del cubreobjetos reposen sobre la cinta. Utilice pinzas para presionar suavemente y fijar el cubreobjetos. Con una micropipeta, agregue 40 microlitros de medio de imagen entre el cubreobjetos y la placa.

Asegúrese de que el espacio entre la lámina cubreobjetos y la portaobjetos esté completamente lleno con el medio de imagen. Elimine cualquier exceso de medio con una toalla de papel si es necesario. Selle todos los bordes del portaobjetos con VALAP caliente.

Verifique las fugas presionando suavemente la cubreobjetos de vidrio. Coloque la cubreobjetos montada y sellada sobre la platina de un microscopio precalentada a 37 grados Celsius. Utilizando un microscopio confocal de disco giratorio, capture secuencias de imágenes de lapso de tiempo, imágenes de proteína verde fluorescente y imágenes de contraste de interferencia diferencial.

Analice la dinámica de los microtúbulos y la co-localización según se describe en el documento adjunto. Para realizar un ensayo de migración celular, después del paso de electroforesis, recupere las células transfectadas añadiendo 80 microlitros de medio basal endotelial completo. Luego, pipete toda la muestra de 80 microlitros como una sola gota en el centro de una laminilla recubierta con fibronectina seca.

No extienda la gota. Es necesario secar la laminilla para evitar que la gota de 80 microlitros se separe al entrar en contacto con la laminilla. Este enfoque permite concentrar las HUVECs en un área pequeña de la laminilla y, por lo tanto, promueve la formación rápida de una monocapa celular confluente.

Incube el cubreobjetos a 37 grados Celsius durante tres o cuatro horas para permitir que las células se adhieran y formen una monocapa confluente. Luego, enjuague los portaobjetos dos veces con medio basal endotelial completo para eliminar cualquier célula que no se haya adherido. Para crear un borde de herida en la monocapa de HUVEC, use pinzas para sostener suavemente el cubreobjetos en su lugar y arrastre firmemente una cuchilla de afeitar a través del centro de la monocapa celular.

Deje que las células se recuperen en un incubador a 37 grados Celsius durante tres horas. Luego, ensamble y monte las laminillas para la adquisición de imágenes como antes. Adquiera imágenes de contraste de fase a intervalos de 10 minutos durante 12 horas utilizando un objetivo de fase de 10X y apertura numérica 0,45 y un condensador de larga distancia de trabajo con apertura numérica 0,52.

Utilice el panel de Adquisición ND del programa de software para la adquisición de imágenes. Finalmente, cuantifique la ramificación y la migración de las HUVEC según se describe en el documento adjunto. Las HUVEC fueron transfectadas para expresar EB3 marcado con mApple, una proteína de unión al extremo de los microtúbulos, y se capturaron imágenes de lapso de tiempo.

Las imágenes originales de EB3 se muestran a la izquierda. Los cometas azules de EB3 rastreados por el software plusTipTracker se muestran a la derecha. Los cometas detectados dentro de cada cuadro se vincularon según su cambio de posición de un cuadro a otro para generar trayectorias de EB3 y una superposición visual de las trayectorias de EB3, como se muestra aquí.

El crecimiento lento y de corta duración de los microtúbulos se muestra en rojo, el crecimiento lento y de larga duración de los microtúbulos se muestra en verde, el crecimiento rápido y de corta duración de los microtúbulos se muestra en amarillo, y el crecimiento rápido y de larga duración de los microtúbulos se muestra en azul. Para analizar la ramificación de las células endoteliales, se capturó una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) y una imagen fluorescente de una célula HUVEC individual con un aumento de 60 veces. Se trazó manualmente un límite alrededor del borde celular en la imagen fluorescente.

Los orígenes de las ramas se definieron trazando una línea recta a través de la rama y pasando por el ángulo de mayor curvatura en cualquiera de sus lados. Se contaron las ramas que eran más largas que anchas y que tenían al menos 10 micrones de longitud, y se midió su longitud desde el origen de la rama hasta el extremo distal de la misma. Para evaluar la migración de las células endoteliales hacia el borde de la herida, las HUVEC se cultivaron a alta densidad y se realizó imágenes de lapso de tiempo con células vivas tras la inducción de la herida, como se describe en este video.

Como se muestra aquí, las células endoteliales del borde de la herida migraron direccionalmente hacia el área de la herida. Este movimiento se analizó utilizando el nucléolo como marcador de referencia para rastrear la velocidad, la persistencia y la distancia de migración. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar, transfectar y preparar las HUVECs para experimentos de imagen de la forma celular y de la dinámica del citoesqueleto, o para estudios de migración celular en el borde de la herida.

Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la poliacrilamida o la conjugación de colágeno para responder preguntas adicionales relacionadas con la interacción celular con MEC modificadas. Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.