Name: -Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a analizar la dinámica de microtúbulos y migración celular en células endoteliales de vena umbilical humana mediante imagen de lapso de tiempo. Este protocolo permite estudiar la motilidad y el citoesqueleto en tiempo real.

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Un agradecimiento especial a la Dra Clara M. Waterman para la tutoría y discusiones, Michelle Baird y Mike Davidson para proporcionar muchas de las construcciones de ADNc fluorescentes utilizados en estos estudios, y Kathryn Applegate y Gaudenz Danuser para el desarrollo de software de análisis plusTipTracker MT. Este trabajo fue apoyado, en parte, por una subvención de KAM de la Nacional del Corazón Pulmón y la Sangre (NHLBI) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El uso de HUVEC en la morfología y migración experimentos. imágenes de células vivas de la dinámica de crecimiento MT EB3 marcado dentro de las HUVEC requiere condiciones de cultivo celular adecuados y reproducibles con el fin de medir y evaluar los cambios en el crecimiento y la morfología de las células HUVEC MT, de tal manera que pueden ser asignados a una señal de señalización de ECM. HUVECs representan un excelente modelo para el estudio de la forma celular y la motilidad. Ellos son altamente susceptibles a la transfección con ADNc marcados con fluorescencia, presentan morfologías dramáticos en respuesta a ambas señales de señalización solubles y físicas, y mantienen la capacidad de organizarse en tubos vasculares cuando se proporcionan condiciones de cultivo celular adecuados 65-70. cultivos de células primarias, tales como HUVECs, requieren un manejo y la supervisión del número de pases celulares cuidado a fin de asegurar que las células están sanas y que se comportarán normalmente durante la experimentación. Por ejemplo, cuando se realizan experimentos que investigan el cytoskeletonelada y / o la morfología celular, HUVECs no deben ser utilizados para los experimentos de más allá del paso de cultivo de células décimo, como HUVECs típicamente comienzan a mostrar morfologías no uniformes alrededor de pasaje doce y quince. La densidad celular también es un regulador crítico de HUVEC de la salud y la proliferación. HUVEC investigaciones de ramificación (véase el Protocolo de 10/01 a 10/04, más arriba) utilizan cultivos de células de densidad relativamente baja con el fin de proporcionar las células espacio físico para interactuar con su ECM y para ampliar salientes ramificados. Por el contrario, en los estudios de migración herida de punta (ver Protocolo de 10.05 a 10.08), HUVECs son la cultura en una monocapa antes de la herida. Como tal, las HUVECs herida de punta exhiben una morfología relativamente poco ramificado, que lleva extender salientes de borde, y exhiben las interacciones célula-célula con sus vecinos inmediatos mientras se desplazan hacia la herida. Salvedades y ventajas de Seguimiento MT Dinámica de estar en HUVEC. Spinning microscopía de disco es una excelente aproximación aprobar las hipótesis experimentales que requieren una claridad de imagen confocal con una alta resolución temporal. Con el módulo de la cámara y el láser apropiado, este enfoque es sensible a la microscopía de fluorescencia de baja emisión y puede ayudar en la reducción de photobleaching en comparación con otros tipos de microscopía de fluorescencia. Es importante destacar que este enfoque es también muy adecuado para la moderada a alta resolución de imagen tiempo que se requiere para generar mediciones integrales de MT dinámica de crecimiento utilizando el mecanismo de etiquetado EB3, en una variedad de diferentes tipos de células. Si bien la metodología de etiquetado EB3 creciente MT-plus extremos tiene claras ventajas sobre otros métodos de marcaje fluorescente MT, también tiene desventajas únicas. Por ejemplo, existe una proporción de la matriz de MT que no está creciendo activamente en un momento dado, incluyendo tanto la población de MTs desmontaje y la población de estables, MTS no dinámicos 71-74. EB3 no sería etiquetar estas dos poblaciones de MTS ypor lo tanto, la contribución de estas dos poblaciones no se incluiría en el análisis de datos experimentales. metodologías alternativas para la evaluación de toda la matriz MT se han centrado en la expresión de la tubulina fluorescente marcada, que incorpora en todas las poblaciones de MTS y permite la identificación de crecimiento, la reducción y estable MTs. Sin embargo, debido a la relativamente alta densidad de la matriz de MT cerca del centro de la célula y adyacente a la organización de los microtúbulos centro (COMT), el etiquetado toda la matriz MT crea una desventaja en la realización de análisis de imagen de los extremos de MT que no están cerca de la celda 75-77 periferia. Los experimentos utilizando dos colores co-etiquetado de MTs con la tubulina fluorescente y EB3 fluorescente en células vivas han revelado, cualitativamente, que la gran mayoría de los MTs de tubulina marcada también son EB3 marcado 78. Además, no ha habido un método eficaz de seguimiento automatizado de MTs marcadas con tubulina fluorescente. Esto significa que recolección de datosción y las mediciones de la dinámica de MT en las células que expresan la tubulina fluorescente requieren seguimiento de la mano de los MT individuales, un proceso que es propenso a errores y tedioso. Como resultado, el análisis computacional automatizado de los MTs EB3 marcado se ha convertido en la metodología preferida para la medición de la dinámica de MT, ya que se puede aplicar a MT dinámica de experimentos a través de numerosos tipos de células y dentro de una variedad de regímenes experimentales 35,79. La vinculación de MT dinámica de crecimiento a HUVEC Morfología y Migración. Desde la perspectiva de un investigador del citoesqueleto, una adaptación extremadamente útil del plusTipTracker análisis automatizado de seguimiento es la capacidad de medir y evaluar tanto los cambios en las células enteras y regionales en la dinámica de crecimiento MT. El requisito para que una célula se polarizan es un requisito previo esencial para la migración celular direccional. Como tal, las señales de señalización polarizadas hace tiempo se conocen como factores clave que impulsa la migración celular direccional 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Por ejemplo, moléculas de señalización solubles, tales como VEGF inducen la polimerización de actina y el crecimiento MT hacia la señal VEGF en tipos de células endoteliales 2,82-87. Además, en respuesta a las interacciones físicas con el ECM (por ejemplo, el cumplimiento y mechanosensing dimensionalidad), HUVEC modular la dinámica de MT mediante la regulación localmente mapas para promover el crecimiento MT dentro alargando protuberancias ramificadas, y esto sirve para guiar la migración HUVEC en la dirección de la cue 5,31,88. Por lo tanto, la polarización en respuesta a señales extracelulares de señalización pone de relieve la necesidad de una evaluación experimental de cambios localizados en la dinámica del citoesqueleto. imágenes de células vivas simultánea de la dinámica de MT de crecimiento (utilizando el enfoque EB3) y la migración de células HUVEC es extremadamente difícil de realizar porque MTs crecen en una escala de tiempo de segundos, mientras que los cambios en la morfología celular y la migración direccional se producen en una escala de tiempo de horas. Sin embargo, ambos procesos están íntimamente Linkere. Por otra parte, la rápida formación de imágenes continua, de EB3 con fluorescencia marcado en la segunda escala de tiempo conduce a photobleaching de la señal EB3. Los intentos para superar este problema mediante la realización de series de imágenes de corta EB3 (serie adquisición 1-2 min) cada 30 minutos han sido un éxito, pero sólo podría llevarse a cabo en un pequeño número de EC que tenía una expresión óptima de EB3 y que no mostraba adversa efectos de iluminación láser repetida 5. Un enfoque alternativo que permite interpretaciones de cómo la dinámica de crecimiento MT contribuyen a los cambios en la morfología celular y la migración es la región de interés plusTipTracker herramienta (ROI) 35 (véase el Protocolo 6.6). Esta metodología permite el crecimiento para el conjunto de células MT pistas para ser sub-dividida en regiones definidas por el usuario, a partir del cual las pistas de crecimiento MT pueden ser extraídos y analizados. Por ejemplo, las comparaciones de &quot;ramificada&quot; frente a las regiones &quot;no ramificados&quot; de la célula han revelado que los MT crecen más shumilde y más persistente dentro de las regiones ramificados en comparación con la periferia de la célula no ramificado 5. En polarizada herida de punta HUVECs, las comparaciones de la dinámica de borde de ataque y salida de crecimiento borde MT revelaron que MCAK inducida desmontaje MT se inhibe específicamente dentro del borde de ataque, pero no el borde de salida. Evaluación regional de ataque y de salida dinámica de crecimiento borde MT en HUVEC que expresan Rac1 y / o mutantes fosforilación de MCAK reveló además que la activación inducida por Rac1 de Aurora-A quinasa específica y localmente inhibe la actividad MCAK dentro del borde de ataque para conducir HUVEC polarización y la migración direccional 31. Por lo tanto, la combinación de seguimiento automatizado de la dinámica de crecimiento MT y evaluación regional de la dinámica de crecimiento MT dentro de los salientes ramificados y / o el borde delantero de la herida de punta HUVECs nos ha permitido vincular la dinámica de crecimiento MT a HUVEC morfología y migración. Los protocolos descritos son designed para proporcionar una metodología generalmente inmediata y altamente repetible para el cultivo de HUVEC y la investigación experimental. Sin embargo, muchos de los detalles del protocolo son complejas y requiere mucho tiempo, lo cual, a su vez, proporciona la oportunidad para errores o dificultades en la realización de la metodología experimental. Si bien se trató de abordar problemas potenciales en todo el protocolo, se proporciona aquí sobre solución de problemas, detallado de los problemas potenciales que son menos comunes o abreviado de otra manera como notas dentro de los protocolos de metodología. En relación con cubreobjetos de recubrimiento con sustratos de poliacrilamida (Protocolo de 2,2), un problema común que surge es la compleja naturaleza de la activación de cubreobjetos de vidrio, el acoplamiento de poliacrilamida al vidrio, la activación de poliacrilamida, y luego el acoplamiento de ECM a la poliacrilamida. Un paso particularmente difícil y potencialmente problemático que cultiva HUVEC sobre el gel de fibronectina / poliacrilamida después de la exposición de la polyacubreobjetos recubiertos de crylamide a 2 mM sulfo-SANPAH (paso 2.2.2.6, arriba). Es crítico para el éxito del cultivo de HUVECs en estos sustratos que sulfo-SANPAH ser retirado completamente del sistema experimental después de la conjugación ECM. Esto puede lograrse mejor mediante lavado con ddH2O e incubando los cubreobjetos en ddH2O en un agitador durante la noche. Si las células cultivadas en ECM de poliacrilamida no sobreviven, o si la viabilidad es menos de lo esperado, aumentó y el lavado de sulfo-SANPAH repitió después de la conjugación a la fibronectina (paso 2.2.2.9) se recomienda potencialmente aliviar este problema. Relacionada con el Protocolo nº 3 (cDNA transfección y cultivo de HUVEC en un cubreobjetos), una influencia importante para el éxito del procedimiento de electroporación es el manejo de las HUVEC tanto durante el tratamiento con tripsina de las células para eliminarlos del frasco de plástico, y tras la celebración de la electroporación (pasos 3.3 a 3.4, más arriba). Es crítico para el cuidadopor completo el monitor HUVECs mientras que en la tripsina, y que no exceda el tiempo necesario para que las células &quot;round-up&quot; en la superficie del matraz (típicamente 1-2 min). El tiempo excesivo en tripsina es una causa importante de muerte HUVEC, que normalmente no se realiza hasta que las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos de fibronectina (paso 3.4) y luego no para unir al sustrato. De similar importancia, HUVEC (y la mayoría de los tipos de células primarias) no les va bien cuando se suspendió por mucho tiempo en el tampón de electroporación. Durante los experimentos de mayor escala, por ejemplo, donde el usuario tiene cinco o más condiciones que requieren la electroporación, es mejor mantener las células sedimentadas en tubos individuales (1 tubo por transfección) y mezclar ellos, uno-a-un-tiempo , en el tampón de electroporación inmediatamente antes de la electroporación. Este enfoque minimiza el tiempo de incubación en tampón de electroporación y la supervivencia de HUVEC maximizada. Además, el rescate inmediato en medio de cultivo completo también está critical después de la electroporación. retrasos de rescate de un minuto o más después de la electroporación pueden resultar en la muerte de su concreción HUVEC y por lo tanto deben ser evitados. ensayo de migración de células relacionadas (Protocolo 9), la técnica de cultivo de HUVECs a muy alta densidad depende de una modificación crítico (descrito en el paso 9.2) de la metodología de cultivo de células HUVEC tradicional (que se describe en el Protocolo 3) que requiere el secado del cubreobjetos recubiertos de fibronectina con el fin de hacer posible la cultura HUVEC en un área muy pequeña del cubreobjetos. Muchas veces, si el cubreobjetos no está completamente seca o si el revestimiento antes del cubreobjetos con fibronectina (pasos 2.1 o 2.2) no fue eficiente, las células que contienen los medios de comunicación que se coloca sobre el cubreobjetos perderán su tensión superficial y expandir a la bordes del cubreobjetos, reduciendo así la densidad de células en el cubreobjetos. Un método para solucionar este problema potencial es para aspirar los medios de comunicación desde el cubreobjetos y luegocolocar el cubreobjetos (todavía en su plato de 35 mm) en la parte posterior de la cabina de bioseguridad durante 5-10 minutos. Esta adaptación puede ayudar a permitir el flujo de aire dentro de la caja para ayudar a secar el plato. Si algún líquido visible permanece en el portaobjetos después de secado al aire, aspirar las manchas de líquidos y de nuevo deje secar al aire durante 5-10 minutos adicionales en la cabina de bioseguridad. Es importante tener en cuenta que no hay manera de evitar por completo este problema potencial, pero se convierte en un problema menor con la práctica repetida del protocolo. También es una recomendación de solución de problemas que cuando se prepara cubreobjetos para el ensayo de migración celular (o cualquier ensayo, en general), para preparar cubreobjetos adicionales y tienen HUVECs adicionales listos para ir en caso de problemas en el camino. Con estas consideraciones en mente la solución de problemas, también es importante destacar la utilidad de los protocolos de tratados y de sus implicaciones en el futuro la investigación en biología celular. La aplicabilidad de la polyacrcarboxílico enfoque es muy amplio, e incluye no sólo los estudios bidimensionales de compromiso de células-ECM (descrito anteriormente), sino también las investigaciones tridimensionales 5. Esta aplicación es fundamental para aumentar nuestra comprensión de cómo las HUVEC regulan la forma celular y la migración en entornos fisiológicos y debe proporcionar a los investigadores una comprensión básica de cómo los cambios morfológicos son coordinados con los cambios del citoesqueleto. Si bien los protocolos descritos aquí se centran en las mediciones de la dinámica de crecimiento MT, la mayoría de los protocolos puede y debe ser adaptado para medir cualquier número de otros aspectos medibles al microscopio de las interacciones célula-ECM. En lo que respecta a la dinámica de MT, hay numerosos mapas, incluyendo al menos 14 familias de Kinesins 89, cada uno con un papel potencial para contribuir a HUVEC polaridad y migración dirigida, y todos los cuales pueden ser investigados utilizando los protocolos presentados. Las investigaciones futuras deberían unalso estar dirigidas a la participación de células-ECM en normales frente a estados de enfermedad. protocolos de HUVEC se presentan aquí son aplicables a las investigaciones de los procesos homeostáticos vasculares normales, así como a estados de enfermedad incluyendo enfermedades del corazón, la retinopatía, el crecimiento tumoral y la metástasis, para nombrar unos pocos. Conjugando visiblemente transparentes sustratos ECMs y poliacrilamida de cumplimiento susceptibles con estudios microscópicos permitirá célula-ECM estudios de acoplamiento de tal manera que la angiogénesis vascular de las células endoteliales se puede controlar con alta resolución espacial y temporal. Estos tipos de enfoques experimentales ya han comenzado a revelar diferencias importantes en la forma de la célula endotelial, la polaridad, la migración, y los efectos de las proteínas que regulan estos procesos 5,31,90. Los esfuerzos futuros deben tratar de determinar cómo la combinación de ECM cumplimiento y mechanosensing dimensionalidad puede servir para proteínas de control a nivel local que se dirigen y regulan la dinámica del citoesqueleto.

La angiogénesis es disparado por señales extracelulares de señalización que promueven las células endoteliales (ECS) para polarizar, migrar con especificidad direccional, y formar nuevos vasos en los tejidos que requieren suministro de sangre. Los factores que contribuyen pensado para impulsar la angiogénesis son señales de la matriz extracelular (ECM). En respuesta a las señales físicas, EC extender nuevas ramas con especificidad de dirección para guiar el movimiento direccional en la formación de la red vascular 1,2. La arquitectura de la morfología CE y ramificación se define por la regulación localizada de los microtúbulos del citoesqueleto (MT), de manera que se coordina con la regulación de la contractilidad acto-miosina 3. A fin de que las ramas de la CE para formar, miosina-II debe ser regulado por disminución a nivel local, lo que resulta en protuberancias localizadas membrana 4. Al mismo tiempo y en la misma ubicación dentro de la célula, la dinámica de crecimiento MT quedar modificado resultante en el crecimiento MT lenta y persistente para promover Elon ramagación y la estabilidad 5. Esta regulación del citoesqueleto coordinado permite EC polarizar su morfología para facilitar la migración direccional. El desarrollo de una morfología celular polarizada requiere montaje MT 6 polarizada. En la migración de las células epiteliales, MT crecen lentamente y persistentemente específicamente en el borde delantero de la célula 7-9; mientras que en las neuronas, la iniciación y la elongación de los axones o dendritas requiere que los MTs son no sólo está presente, pero que están sufriendo de forma dinámica los procesos de montaje y desmontaje 10-15. De esta manera, el control localizado de la dinámica de crecimiento MT determina la arquitectura de la célula y permite una rápida remodelación de la morfología celular como ECs navegar a través de su ECM. MT dinámica de crecimiento están regulados por las familias de proteínas motoras moleculares y las proteínas no motores, denominados microtúbulos proteínas asociadas a los microtúbulos o Interactuando Proteínas (de ahora en adelante referred como MAP). Los mapas pueden ser activados o inactivados localmente, normalmente a través de cascadas iniciadas en la interfase célula-ECM 16,17 señalización. Una vez activa la función, mapas por la unión a la MT y la alteración de la cinética de montaje y desmontaje MT; que funciona de esta manera para regular la dinámica de MT local con el fin de promover la forma de la célula y la polaridad 18-20. Mitótico Centrómero Asociada Kinesin (MCAK) es un mapa de la familia Kinesin-13 que se une a los extremos y las parejas de hidrólisis de ATP para el desmontaje MT MT 21-23. Este papel funcional de MCAK es conocido por ser crítico dentro de la mitótico husillo 24 a 28, así como durante la interfase 29,30. Dentro de interfase EC, desmontaje MT MCAK mediada está regulada por Aurora-A fosforilación inducida localizada de MCAK en respuesta a la herida de punta inducida por la activación de la pequeña GTPasa Rac1. El resultado de esta cascada de señalización es la inhibición de MCAK en el borde delantero de la EC, lo que resulta en el crecimiento polarizado hacia el MT leading borde y desmontaje MT MCAK inducida en el borde de salida de la migración de las CE 31. Las metodologías tradicionales para medir la dinámica del crecimiento MT han usado típicamente seguimiento mano de cualquiera de tubulina marcado con fluorescencia o, más recientemente, con la etiqueta fluorescente de unión a proteínas MT End 1 o 3 (EB 1 o EB3, respectivamente). El enfoque de la tubulina fluorescente tiene la ventaja de etiquetado de toda la matriz MT. Sin embargo, debido a que la mayoría de los tipos de células mitóticas mantener una matriz radial de MTs durante la interfase 8,32,33, MTs cerca del centrosoma son muy densos, y como resultado, el seguimiento del crecimiento MT y desmontaje con la tubulina fluorescente se limita generalmente a la periférica regiones de la célula. Debido a estas limitaciones, la utilización de proteínas de EB fluorescentemente marcado (EB1 o EB3) ha sido el enfoque más común para medir la dinámica de MT. Debido a que los EB única etiqueta que crecen más los fines de MTs, aparecen como pequeños (1-3 micras), con fluorescencia brillante vienents, proporcionando así un marcador fácilmente discernible de la polimerización MT con muy limitada fluorescencia de fondo 34-37. Si bien el hecho de que EBs etiqueta sólo un subconjunto de la matriz MT representa una fuerza importante del enfoque de EB, también destaca una limitación importante, que los MTs de no crecimiento no están etiquetados por el enfoque de EB3. Sin embargo, la capacidad de medir y realizar un seguimiento de los cometas EB3 en el tiempo y para visualizar el crecimiento MT dentro de las regiones subcelulares que este enfoque sea ideal para aplicaciones que requieren una evaluación regional de la organización MT. Otra limitación crítica de las metodologías tradicionales para la medición dinámica de crecimiento MT ha sido muy grandes conjuntos de datos y el tiempo requerido para el análisis de datos. Esta limitación se debe a la necesidad de mano de seguimiento de cientos de cometas EB en alta resolución en el tiempo. Por otra parte, estas mediciones deben realizarse en un número estadísticamente significativo de células y también realizada bajo una variedad de control y EXPERIMENTAL condiciones. Recientemente, estas limitaciones han sido superadas a través de técnicas computacionales de análisis dirigidos específicamente a los cometas de seguimiento EB3 usando microscopía de lapso de tiempo en las células vivas 35. Cuando se usa apropiadamente, este enfoque computacional sirve tanto para restringir el potencial de error humano asociado con la mano de seguimiento, además de proporcionar un método de alto rendimiento de la medición de la polimerización MT. Análisis computacional de dinámica de MT utilizando el paquete de software basado en MatLab, plusTipTracker, permite mediciones de crecimiento MT mediante el seguimiento de los cometas fluorescente marcada EB3 5,31,35,38. Además, el software plusTipTracker permite cálculos de eventos catastróficos MT (aka desmontaje) en base a la desaparición de los cometas EB3 dentro de una pista TA cada vez mayor, y permite el análisis subcelular (también conocido como regional) de la dinámica de crecimiento MT dentro de las regiones definidas por el usuario de interés . Para nuestros estudios, la dinámica de crecimiento MT se compararon dentroregiones ramificados contra regiones no ramificados, o dentro de líder frente a los bordes de salida celulares. La salida de datos de software plusTipTracker también se puede utilizar para generar superposiciones de pista con código de color para las células individuales y regiones sub-celulares. A continuación se describe la metodología utilizada para investigar el papel de MCAK en la modulación de la dinámica de crecimiento MT y la contribución de este despolimerasa MT a la regulación de la CE, la morfología y la migración direccional de ramificación. Nuestro enfoque utiliza una línea primaria humana celular, las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que son fácilmente cultivadas y altamente susceptible a la electroporación inducida, la transfección transitoria de ADNc de plásmido. A continuación, utiliza de alta resolución, lapso de tiempo microscopía de fluorescencia de HUVEC transfectadas con MT Fin de unión a proteínas 3 (EB3) y cDNA específico de mitótico Centrómero Asociada Kinesin (MCAK) construye para evaluar los efectos sobre la dinámica de MT transfectaron células HUVEC. análisis de imagen computacional basado en PlusTipTracker de EB3MT marcado con más extremos era para medir las velocidades de crecimiento MT y MT tiempos de vida de crecimiento en imágenes con lapso de tiempo, para medir y comparar los efectos de las manipulaciones experimentales sobre la dinámica de crecimiento MT. Esta metodología permite el estudio de la dinámica de MT y la identificación de cómo la regulación localizada de la dinámica de MT dentro de las regiones sub-celulares contribuye a los procesos angiogénicos de CE de ramificación y la migración. Estas técnicas son aplicables a las investigaciones de cualquier mapa que puede ser marcado con fluorescencia y se expresó en células vivas.

<table><tbody><tr><td>Inhibidor de Aurora A I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>Solución al 2% Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrimetiloxisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida al 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm módulo combinador láser MLC400 de alta potencia</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; perlas de inmunoprecipitación IgG de ratón</td><td>Reactivos TrueBlot; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; perlas de inmunoprecipitación IgG de conejo</td><td>Reactivos TrueBlot; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, Filtro de emisión DAPI-ET</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Filtro de emisión Chroma</td><td>Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Filtro de emisión</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Filtro de emisión</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino Albúmina Fracción V Productos</td><td>RPI</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerada Clara</td><td>Tecnología Andor 77026010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3 anti-conejo para burro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 anti-ratas</td> <td>de cabraJackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply & Factores de crecimiento (el contenido se muestra a continuación)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracto de cerebro bovino 2,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (10,000 UI Pen/ml, 10,000 &#181; g Estreptococos/ml)&nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Obturador electrónico</td><td>Instrumento Sutter</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Inhibidor de la proteasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP anti-ratón</td><td>de cabra Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP anti-conejo</td><td>de cabra Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot Membrana de PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesio sulfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Platina motorizada</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-tubulina (DM1A)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3873S</td> Esmalte de <td></td></tr><tr><td>uñas</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Software NIS Elements Nikon</td><td></td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contiene el tampón de electroporación</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 UI de pluma/ml, 10.000 &#181; g Estreptococo/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti&ndash; pT288&ndash; Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti&ndash; &alpha;-tubulina</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Disco giratorio&nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

-alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana las células endoteliales de vena

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

El proceso fisiológico por el cual se forma una nueva vasculatura a partir de la vasculatura existente requiere eventos de señalización específicos que desencadenan cambios morfológicos dentro de las células endoteliales (EC) individuales. Estos procesos son críticos para el mantenimiento homeostático, como la cicatrización de heridas, y también son cruciales para promover el crecimiento tumoral y la metástasis. La morfología de la CE se define por la organización del citoesqueleto, un sistema estrechamente regulado de dinámica de actina y microtúbulos (MT) que se sabe que controla la ramificación, la polaridad y la migración direccional de la CE, componentes esenciales de la angiogénesis. Para estudiar la dinámica de la MT, utilizamos microscopía de fluorescencia de alta resolución junto con el análisis computacional de imágenes de los extremos positivos de la MT marcados con fluorescencia para investigar la dinámica de crecimiento de la MT y la regulación de la morfología de la ramificación de la CE y la migración direccional. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo de células endoteliales de vena umbilical humana vivas (HUVEC) después de la transfección con construcciones de ADNc específicas de la proteína de unión al extremo MT (EB3) y la cinesina asociada al centrómero mitótico (MCAK) marcadas con fluorescencia para evaluar los efectos sobre la dinámica de la MT. Se utilizó el software PlusTipTracker para realizar un seguimiento de los extremos positivos de la TA marcados con EB3 con el fin de medir las velocidades de crecimiento de la TA y la vida útil del crecimiento de la TA en imágenes de lapso de tiempo. Esta metodología permite el estudio de la dinámica de la MT y la identificación de cómo la regulación localizada de la dinámica de la MT dentro de las regiones subcelulares contribuye a los procesos angiogénicos de ramificación y migración de la EC.

Se detallan los protocolos para el cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), la transfección transitoria de marcadores de crecimiento de microtúbulos marcados con fluorescencia, la obtención de imágenes de células vivas y el análisis automatizado de la dinámica de crecimiento de microtúbulos en interfase.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células endoteliales de vena umbilical humana y analizar la dinámica del citoesqueleto y la migración celular mediante imágenes de lapso de tiempo en células vivas. Los métodos descritos en este video pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, molecular y mecanobiología. Por ejemplo, este protocolo puede utilizarse para identificar cómo la forma celular y la motilidad son moduladas por la interacción con diferentes matrices extracelulares (ECM).La demostración visual es fundamental porque los pasos de preparación de la muestra son difíciles de realizar. Requieren un manejo preciso de las células de manera oportuna durante todo el proceso. Aunque este método puede proporcionar información sobre la motilidad de las células endoteliales durante la angiogénesis, también puede aplicarse a investigaciones microscópicas de prácticamente cualquier sistema modelo de células adherentes.Usando pinzas, tome una laminilla de un frasco de almacenamiento con etanol al 100 % y pásela a través de la llama de un mechero Bunsen para esterilizarla. Luego colóquela en una placa de Petri de 35 milímetros. Prepare una laminilla para cada muestra.A un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, añada 10 microlitros de una solución stock de fibronectina de 1 miligramo por mililitro y 990 microlitros de PBS. Luego, pipetee 250 microlitros de la solución sobre cada cubreobjetos. Distribuya la solución uniformemente para cubrir toda la superficie.Incube los cubreobjetos durante un mínimo de tres horas a 37 grados Celsius. Antes de usarlos, enjuague cada cubreobjeto tres veces con dos mililitros de PBS. Mediante un hemocitómetro, determine el número de HUVECs cultivadas y transfiera un volumen que contenga 100.000 células por cubreobjeto para experimentos de no migración, o 500.000 células por cubreobjeto para experimentos de migración, a un tubo de microcentrifugado.Centrifugar las células a 1.400 × g durante cuatro minutos para formar el pellet. Después de la centrifugación, para cada condición que se va a probar, resuspender hasta un millón de células en 100 microlitros de tampón de electrotransferencia y combinarlas con un microgramo de ADNc. Transferir las células a una cubeta de electrotransferencia.Transfecte las células y la mezcla de ADN utilizando el programa designado para la electroforesis de HUVEC. A continuación, recupere las células transfectadas añadiendo 500 microlitros de medio basal endotelial completo. Luego, siembre el volumen celular apropiado sobre cubreobjetos recubiertos con fibronectina.Incube las células a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas para permitir tiempo para la expresión de los constructos de ADNc. En preparación para la obtención de imágenes, tome dos tiras de cinta adhesiva doble cara de 2,5 centímetros por 0,65 centímetros y fíjelas horizontalmente a lo largo de los bordes superior e inferior de un portaobjetos limpio. Tenga en cuenta que es importante dejar un pequeño espacio entre la cinta y el borde del portaobjetos para sellar la cámara.Coloque el cubreobjetos con el lado de las células hacia abajo de modo que los dos bordes del cubreobjetos reposen sobre la cinta. Utilice pinzas para presionar suavemente y fijar el cubreobjetos. Con una micropipeta, agregue 40 microlitros de medio de imagen entre el cubreobjetos y la placa.Asegúrese de que el espacio entre la lámina cubreobjetos y la portaobjetos esté completamente lleno con el medio de imagen. Elimine cualquier exceso de medio con una toalla de papel si es necesario. Selle todos los bordes del portaobjetos con VALAP caliente.Verifique las fugas presionando suavemente la cubreobjetos de vidrio. Coloque la cubreobjetos montada y sellada sobre la platina de un microscopio precalentada a 37 grados Celsius. Utilizando un microscopio confocal de disco giratorio, capture secuencias de imágenes de lapso de tiempo, imágenes de proteína verde fluorescente y imágenes de contraste de interferencia diferencial.Analice la dinámica de los microtúbulos y la co-localización según se describe en el documento adjunto. Para realizar un ensayo de migración celular, después del paso de electroforesis, recupere las células transfectadas añadiendo 80 microlitros de medio basal endotelial completo. Luego, pipete toda la muestra de 80 microlitros como una sola gota en el centro de una laminilla recubierta con fibronectina seca.No extienda la gota. Es necesario secar la laminilla para evitar que la gota de 80 microlitros se separe al entrar en contacto con la laminilla. Este enfoque permite concentrar las HUVECs en un área pequeña de la laminilla y, por lo tanto, promueve la formación rápida de una monocapa celular confluente.Incube el cubreobjetos a 37 grados Celsius durante tres o cuatro horas para permitir que las células se adhieran y formen una monocapa confluente. Luego, enjuague los portaobjetos dos veces con medio basal endotelial completo para eliminar cualquier célula que no se haya adherido. Para crear un borde de herida en la monocapa de HUVEC, use pinzas para sostener suavemente el cubreobjetos en su lugar y arrastre firmemente una cuchilla de afeitar a través del centro de la monocapa celular.Deje que las células se recuperen en un incubador a 37 grados Celsius durante tres horas. Luego, ensamble y monte las laminillas para la adquisición de imágenes como antes. Adquiera imágenes de contraste de fase a intervalos de 10 minutos durante 12 horas utilizando un objetivo de fase de 10X y apertura numérica 0,45 y un condensador de larga distancia de trabajo con apertura numérica 0,52.Utilice el panel de Adquisición ND del programa de software para la adquisición de imágenes. Finalmente, cuantifique la ramificación y la migración de las HUVEC según se describe en el documento adjunto. Las HUVEC fueron transfectadas para expresar EB3 marcado con mApple, una proteína de unión al extremo de los microtúbulos, y se capturaron imágenes de lapso de tiempo.Las imágenes originales de EB3 se muestran a la izquierda. Los cometas azules de EB3 rastreados por el software plusTipTracker se muestran a la derecha. Los cometas detectados dentro de cada cuadro se vincularon según su cambio de posición de un cuadro a otro para generar trayectorias de EB3 y una superposición visual de las trayectorias de EB3, como se muestra aquí.El crecimiento lento y de corta duración de los microtúbulos se muestra en rojo, el crecimiento lento y de larga duración de los microtúbulos se muestra en verde, el crecimiento rápido y de corta duración de los microtúbulos se muestra en amarillo, y el crecimiento rápido y de larga duración de los microtúbulos se muestra en azul. Para analizar la ramificación de las células endoteliales, se capturó una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) y una imagen fluorescente de una célula HUVEC individual con un aumento de 60 veces. Se trazó manualmente un límite alrededor del borde celular en la imagen fluorescente.Los orígenes de las ramas se definieron trazando una línea recta a través de la rama y pasando por el ángulo de mayor curvatura en cualquiera de sus lados. Se contaron las ramas que eran más largas que anchas y que tenían al menos 10 micrones de longitud, y se midió su longitud desde el origen de la rama hasta el extremo distal de la misma. Para evaluar la migración de las células endoteliales hacia el borde de la herida, las HUVEC se cultivaron a alta densidad y se realizó imágenes de lapso de tiempo con células vivas tras la inducción de la herida, como se describe en este video.Como se muestra aquí, las células endoteliales del borde de la herida migraron direccionalmente hacia el área de la herida. Este movimiento se analizó utilizando el nucléolo como marcador de referencia para rastrear la velocidad, la persistencia y la distancia de migración. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar, transfectar y preparar las HUVECs para experimentos de imagen de la forma celular y de la dinámica del citoesqueleto, o para estudios de migración celular en el borde de la herida.Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la poliacrilamida o la conjugación de colágeno para responder preguntas adicionales relacionadas con la interacción celular con MEC modificadas. Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

Este protocolo de vídeo ilustra el aislamiento y cultivo de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) de cordón umbilical humano. Una vez aisladas estas células se pueden utilizar en los ensayos de la angiogénesis in vitro, como el gel de fibrina Optimizado ensayo de bolas también se demuestra por el laboratorio de Hughes.

El aislamiento de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC)

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Aquí una novela región de interés protocolo de análisis basado en la clasificación de las elipses de mejor ajuste asignados a las regiones de la señal positiva dentro de secuencias de imágenes lapso de tiempo de dos dimensiones se demuestra. Este algoritmo puede permitir a los investigadores a analizar exhaustivamente las señales + Ca 2 fisiológicas con intervención mínima del usuario y el sesgo.

Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

Las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron hasta la confluencia dentro de un dispositivo de red microfluídica. Se ilustró la unión de las células endoteliales y las distribuciones de F-actina, y se cuantificaron en tiempo real los cambios en la concentración de calcio intracelular y la producción de óxido nítrico en respuesta al trifosfato de adenosina (ATP) a nivel de células individuales.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Para cuantificar el flujo microvascular a partir de secuencias de imágenes de flujo capilar de alta velocidad, desarrollamos el software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). A lo largo del campo de imagen completo y a lo largo del tiempo, STAFF evalúa las velocidades de flujo y genera una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos.

Análisis temporal espacial del flujo de campo en la microvasculatura

Este protocolo describe los procedimientos quirúrgicos y técnicos que permiten imágenes de fluorescencia multifotónica in vivo en tiempo real del cerebro del roedor durante los tratamientos de ultrasonido enfocado y microburbujas para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica.

Microscopía multifotónica intravital en tiempo real para visualizar ultrasonido enfocado y tratamientos de microburbujas para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica

Este protocolo está dedicado a la visualización de microtúbulos plus-end mediante transfección de proteínas EB3 para estudiar sus propiedades dinámicas en cultivo celular primario. El protocolo se implementó en fibroblastos primarios de piel humana obtenidos de pacientes con enfermedad de Huntington.

Visualización dinámica de microtúbulos plus-end en el modelo de la enfermedad de Huntington basado en fibroblastos primarios de piel humana

El presente estudio describe un protocolo para monitorizar los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) durante la infección viral utilizando un sistema de análisis celular en tiempo real (RTCA).

Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia

Aprende a analizar la dinámica de microtúbulos y migración celular en células endoteliales de vena umbilical humana mediante imagen de lapso de tiempo. Este protocolo permite estudiar la motilidad y el citoesqueleto en tiempo real.

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