Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar las células murinas C1498 y la leucemia aguda que inducen tras la inyección intravenosa en ratones. La principal ventaja de este procedimiento es que la leucemia mielomonocítica murina inducida tras la inyección de células C1498 presenta muchas características de la enfermedad humana. Este modelo animal puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Hematología, como cuáles son los mecanismos que conducen al desarrollo de la leucemia y la deficiencia inmunitaria.

La implicación de este modelo animal se extiende hacia el tratamiento de la leucemia, ya que facilita la prueba de nuevos agentes quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos. Comience transfiriendo un ratón hembra consanguíneo C57 negro 6 de cinco a seis semanas de edad a una cabina de flujo laminar estéril. Luego, coloque al animal en un sujetador.

A continuación, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de 29 gauge con 100 microlitros de células. Sujete la cola en el extremo distal y desinfecte la piel de la cola con una gasa empapada en etanol al 70%. Proceda a inyectar lentamente una vez 10 a la sexta células en una vena lateral de la cola.

Una vez que se hayan administrado todas las células, retire la aguja y aplique presión suave en el sitio de inyección con gasa estéril. A continuación, devuelva el animal a su jaula y realice un monitoreo cuidadoso durante las siguientes semanas. 17 a 19 días después, inserte un tubo capilar en el ángulo interno del ojo del animal leucémico anestesiado.

Se extraerán de 100 a 200 microlitros de sangre del seno orbitario hacia el tubo capilar. Retire el tubo y controle la hemorragia aplicando suavemente una gasa estéril sobre el ojo. Luego, transfiera la sangre a un tubo con EDTA y almacene el tubo sobre hielo hasta el aislamiento de células mononucleares.

Para aislar las células mononucleares de la sangre, primero agregue PBS suplementado con un milimolar de EDTA hasta un volumen final de 500 microlitros. Luego, transfiera la muestra a un tubo de microcentrifugadora. A continuación, use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 para colocar cuidadosamente 500 microlitros de solución separadora debajo de la sangre, teniendo cuidado de no mezclar las capas.

Se pare las células mediante centrifugación y utilice una pipeta para transferir la capa blanca opaca de células mononucleares a un nuevo tubo de microcentrifugación. Luego, lave las células inmunitarias con un mililitro de PBS. Céntrifuguelas y re-suspenda el precipitado en 600 microlitros de tampón FACS para tinción y análisis mediante citometría de flujo.

Para aislar la médula ósea, coloque al ratón sobre su espalda en una tabla de plástico y asegure las extremidades del animal. Desinfecte al animal con etanol al 70 %. A continuación, corte cada pata en la parte superior del fémur por encima de la articulación y tire suavemente de las tibias para separarlas de los fémures.

Utilice pinzas y tijeras para retirar la piel y los músculos de los huesos, y transfiera los huesos a una placa de Petri sobre hielo. Use tijeras para eliminar las extremidades. Luego inserte una aguja de calibre 26 conectada a una jeringa de 10 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS frío, en el extremo de un hueso a la vez y lave la médula ósea dentro de la placa.

Pase la suspensión celular a través de la punta de la aguja varias veces para romper las células de la médula ósea. Luego, filtre las células a través de un nuevo filtro de 70 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros para obtener una suspensión de células individuales. Centrifugue las células y re-suspenda el precipitado en dos mililitros de tampón de lisis.

Llene inmediatamente el tubo con hasta 50 mililitros de PBS frío y centrifugue las células. Luego, re-suspenda el sedimento de médula ósea a una concentración de un por diez a la sexta células por mililitro en tampón FACS frío. Para preparar las células de la médula ósea para la tinción, primero coloque las laminillas en cámaras desechables con tarjetas de filtro previamente adheridas y coloque las cámaras en un citocentrífugo.

Añada 100 microlitros de tampón FACS a cada cámara de la tarjeta de filtro y centrifugue brevemente las laminillas. Al final de la centrifugación, añada 100 microlitros de células a cada cámara y centrifugue las células. Luego, retire cuidadosamente las laminillas de las cámaras para secarlas al aire.

Para teñir las células de médula ósea, sumerja los portaobjetos en un frasco Coplin que contenga solución de May-Grunwald durante cinco minutos. A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco con solución tampón de pH 6,8 durante un minuto. Luego, transfiera los portaobjetos a la solución de Giemsa R durante 10 minutos.

Posteriormente, realice un lavado de 10 segundos con agua neutra (pH 7). Después del lavado, deje secar las laminillas al aire y añada una gota de medio de montaje a cada muestra. A continuación, coloque un borde de la cubreobjetos sobre la laminilla y bájela cuidadosamente sobre las células, presionando suavemente para eliminar cualquier burbuja de aire.

En comparación con los animales de control, los animales inyectados con células C1498 presentan una infiltración masiva de células C1498 en su médula ósea, tal como se observa por el aspecto similar a blastos de las células. Las células C1498 que infiltran la médula ósea muestran fenotipos monocíticos y granulocíticos, indicativos de células monoblásticas y mieloblásticas, respectivamente, características de la leucemia mielomonocítica aguda. El análisis citométrico de flujo de las frecuencias de células mononucleares en muestras de sangre de los ratones inyectados con C1498 indica que aproximadamente una cuarta parte de toda la población de glóbulos blancos está compuesta por células leucémicas.

Las frecuencias de linfocitos T y B son similares entre los animales de control y los inyectados con C1498. Sin embargo, las frecuencias de monocitos se observan en niveles más altos en los ratones inyectados con C1498, una característica de la leucemia mielomonocítica aguda. Al realizar los procedimientos de citoquímica y de May-Grunwald Giemsa, es importante recordar mantener los valores de pH, temperaturas y tiempos de incubación adecuados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar la leucemia mielomonocítica aguda. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Hematología exploraran la naturaleza de la leucemia aguda espontánea e inducida en otros modelos animales.