Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar las células murino C1498 y la leucemia aguda que inducen después de la inyección intravenosa en ratones. La principal ventaja de este procedimiento es que la leucemia mielomonocítica murina inducida después de una inyección de células C1498 presenta muchas características de la enfermedad humana. Este modelo animal puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hematología, como cuáles son los mecanismos que conducen al desarrollo de la leucemia y la inmunodeficiencia.

Las implicaciones de este modelo animal se extienden hacia el tratamiento de la leucemia, ya que facilita la prueba de nuevos agentes quimio e inmunorepresivos. Comience transfiriendo un ratón hembra congénito C57 negro 6 de cinco a seis semanas de edad a una campana de flujo laminar estéril. Luego, coloque al animal en un sujetador.

A continuación, cargue una jeringa de un milímetro equipada con una aguja de calibre 29 con 100 microlitros de células. Sujete la cola del extremo distal y desinfecte la piel de la cola con una gasa empapada en etanol al 70%. Proceda a inyectar lentamente una vez 10 a la sexta célula en una vena lateral de la cola.

Cuando se hayan expulsado todas las células, retire la aguja y aplique una presión suave a la vista de la inyección con una gasa estéril. Luego, regrese al animal a su jaula con un monitoreo cuidadoso durante las próximas semanas. De 17 a 19 días después, se inserta un tubo capilar en el canto medial del ojo del animal leucémico anestesiado.

Se extraerán de 100 a 200 microlitros de sangre del seno orribtal hacia el tubo capilar. Retire el tubo y controle el sangrado con la aplicación suave de una esponja de gasa estéril en el ojo. Luego, transfiera la sangre a un tubo de EDTA y almacene el tubo en hielo hasta el aislamiento de la célula mononuclear.

Para aislar las células mononucleares de la sangre, primero agregue PBS suplementado con un milimolar de EDTA hasta un volumen final de 500 microlitros. A continuación, transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga. A continuación, use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 para colocar cuidadosamente 500 microlitros de solución de separación debajo de la sangre, teniendo cuidado de no mezclar las capas.

Separe las células por centrifugación y utilice una pipeta para transferir la capa de células mononucleares blancas opacas a un nuevo tubo de microcentrífuga. Luego, lave las células inmunitarias en un mililitro de PBS. Centrifugarlos y volver a suspender el pellet en 600 microlitros de tampón FACS para su tinción y análisis por citometría de flujo.

Para aislar la médula ósea, coloque al ratón boca arriba sobre una tabla de plástico y asegure las extremidades del animal. Desinfectar el animal con etanol al 70%. Luego, corta cada pierna en la parte superior del fémur por encima de la articulación y tira suavemente de las tibias para desconectarlas de los fémures.

Use fórceps y tijeras para quitar la piel y los músculos de los huesos, y transfiera los huesos a una placa de Petri con hielo. Usa unas tijeras para quitar las extremidades. A continuación, inserte una aguja de calibre 26 conectada a una jeringa de 10 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS frío en el extremo de un hueso a la vez y enjuague las médulas óseas en el plato.

Pase la suspensión celular a través de la punta de la aguja varias veces para alterar las células de la médula ósea. Luego, filtre las células a través de un nuevo filtro de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros para obtener una suspensión de una sola célula. Centrifugar las células y volver a suspender el pellet en dos mililitros de tampón de lisis.

Llene inmediatamente el tubo con hasta 50 mililitros de PBS frío y centrifugue las celdas. A continuación, vuelva a suspender el pellet de médula ósea a una vez de 10 a la sexta celda por mililitro en tampón FACS frío. Para preparar primero las células de la médula ósea para la tinción, coloque los portaobjetos en cámaras desechables con tarjetas de filtro preconectadas y coloque las cámaras en una citocentrífuga.

Agregue 100 microlitros de tampón FACS a cada cámara de tarjeta de filtro y centrifugue brevemente los portaobjetos. Al final del centrifugado, agregue 100 microlitros de células a cada cámara y centrifugue las células. Luego, retire con cuidado los portaobjetos de las cámaras para que se sequen al aire.

Para teñir las células de la médula ósea, sumerja los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga la solución de May-Grunwald durante cinco minutos. A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco de solución tampón con un pH de 6,8 durante un minuto. A continuación, transfiera los portaobjetos a la solución Giemsa R durante 10 minutos.

Seguido de un lavado de 10 segundos con agua de pH neutro. Después del lavado, deje que los portaobjetos se sequen al aire y aplique una gota de medio de montaje a cada muestra. Luego, coloque un borde de un cubreobjetos en el portaobjetos y baje con cuidado el cubreobjetos sobre las celdas, presionando suavemente para eliminar las burbujas de aire.

En comparación con los animales de control, los animales inyectados con células C1498 muestran una infiltración masiva de células C1498 en su médula ósea, como se observa por la apariencia de las células en forma de explosión. Las células C1498 infiltrantes de la médula ósea muestran fenotipos monocíticos y granulocíticos indicativos de células monoblásticas y mieloblásticas respectivamente, características de la leucemia mielomonocítica aguda. El análisis de citometría de flujo de las frecuencias de células mononucleares en muestras de sangre de los ratones inyectados con C1498 indica que aproximadamente una cuarta parte de toda la población de glóbulos blancos está formada por células leucémicas.

Las frecuencias de linfocitos T y B son similares entre los animales control y los inyectados con C1498. Sin embargo, las frecuencias de monocitos se observan en niveles más altos en ratones inyectados con C1498, una característica de la leucemia mielomonocítica aguda. Al realizar los procedimientos de citoquímica y Giemsa de May-Grunwald, es importante recordar mantener los valores de pH, temperaturas y tiempos de incubación adecuados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar la leucemia mielomonocítica aguda. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hematología exploraran la naturaleza de la leucemia aguda espontánea e inducida en otros modelos animales.