Name: Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a caracterizar la línea celular C1498 y el modelo de leucemia mielomonocítica aguda en ratones mediante citometría de flujo y tinción de May-Grünwald Giemsa. Este protocolo facilita el estudio de mecanismos leucémicos y la evaluación de nuevos agentes terapéuticos en hematología.

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Los autores desean agradecer a la "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comité du Septentrion), al SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) y al Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) por apoyar este trabajo. Les gustaría agradecer a Delphine Taillieu y al personal del parque de animales por albergar a los ratones y mantener su bienestar. También agradecemos a Raphaëlle Caillerez y Nathalie Jouy por su respectiva ayuda en microscopía y citometría de flujo.

<ol><li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li>
<li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+free+C1498+%28granulocytic+leukemia%29+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li>
<li>Tanaka, K. K., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+E.L.4+lymphoma+and+C+Leukemia+in+susceptible+%28C57BL%29+and+resistant+%28B10.D2%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice.</a> Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).</li>
<li>Law, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+influence+affecting+growth+of+transplantable+leukemias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice.</a> Cancer Res. 4, 257-260 (1944).</li>
<li>Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+an+implanted+murine+myelogenous+leukemia+C1498%5BTitle%5D)+AND+%22Ohio+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498.</a> Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).</li>
<li>Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+intercellular+adhesion+molecule+recognition+and+local+interleukin-2+provision+in+generation+of+an+in+vivo+CD8%2B+T-cell+immune+response+to+murine+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia.</a> Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).</li>
<li>Labelle, J. L., Truitt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+NKT+cell+tumor+previously+described+as+an+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia.</a> Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).</li>
<li>Bradner, W. T., Pindell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukemia+as+a+screen+for+cancer+chemotherapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents.</a> Cancer Res. 26 (4), Pt 2 375-390 (1966).</li>
<li>Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+anti-tumor+efficacy+of+a+GM-CSF-secreting+tumor+cell+immunotherapy+in+preclinical+models+by+cytosine+arabinoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside.</a> Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+JP+%22Handbook+of+Flow+Cytometry+Methods%22">Handbook of Flow Cytometry Methods</a>. , Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).</li>
<li>Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+identification+of+acute+myeloid+leukemia+with+monocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation.</a> Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).</li>
<li>Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia-FAB+classification+and+its+correlation+with+clinico-haematological+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pak.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features.</a> J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).</li>
<li>Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuesenberry%2C+PJ+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 299 (2), 71-75 (1978).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).</li>
<li>Loder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+development+in+the+spleen+takes+place+in+discrete+steps+and+is+determined+by+the+quality+of+B+cell+receptor-derived+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals.</a> J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).</li>
<li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C%28high%29+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En estudios anteriores, la línea de células C1498 fue descrito como un inductor de la granulocítica aguda 5, 6 o mielomonocítica NKT 7 leucemia de células. Sin embargo, los datos demostrativos en la literatura eran ausentes o incompletos. El protocolo presentado aquí utiliza diferentes técnicas, tales como citometría de flujo, inmunofluorescencia, la tinción de MGG y ensayos citoquímicas, para caracterizar las células C1498 cultivadas y para determinar la naturaleza de la leucemia que se induce en ratones después de que se inyectan. Cuando phenotyped en las células C1498 vitro cultivadas después de inmunotinción y citometría de flujo se realizaron análisis, se observó algunas limitaciones debido a que estas células expresan pocos marcadores hematopoyéticos de la superficie celular que se han descrito previamente en la literatura 6,7. De acuerdo con nuestros resultados, Labelle et al. No observó la expresión de la superficie celular de las células maduras TCR en C1498 usando cytomet flujotinción ry. Sin embargo, ellos consideran como una línea de células NKT después de que se detectaron CD3ε y TCRVβ8.2 ARNm 7. También se observó la expresión intracelular de cadenas TCRVβ y moléculas CD3ε en la mayoría de las células (&gt; 70%), pero sus linajes hematopoyéticos no se pudo determinar debido a que también era la expresión intracelular concomitante de la molécula de Mac-3. Mieloperoxidasa, las manchas y las evaluaciones para analizar esterasas funcionales utilizando citoquímica MGG demostrado que la línea celular C1498 tuvo un origen mieloide y se compone de Monoblastos y mieloblastos. Estos resultados fueron concordantes con el porcentaje de células Mac-3 + que se obtuvieron en citometría de flujo análisis de tinción. Aunque no es cuantitativa, estos pasos representan experimentos clave a realizar. De hecho, siguen siendo, hasta ahora, los mejores métodos existentes para la caracterización de la etapa de linaje y diferenciación de las células hematopoyéticas que expresan no o few marcadores fenotípicos específicos. La citometría de flujo de tinción era útil para demostrar el desarrollo de la leucemia aguda en ratones congenic después C1498 células se inyectaron por vía intravenosa. Los + C1498 células CD45.2 que se infiltraron en la sangre periférica y varios órganos se aislaron, y se determinaron sus frecuencias. También se realizó la cuantificación de analizar medular inherente y células esplénicas después de inmunofenotipo. Limitaciones se encontraron cuando el fenotipo de las células C1498 se examinó en los órganos, ya que expresan pocos marcadores hematopoyéticos (sólo unos pocos de ellos eran B220 +). Para definir la naturaleza de la leucemia aguda observada, la tinción de May-Grünwald Giemsa y un análisis de las actividades de esterasas monocítica y granulocítica se realizaron utilizando la médula ósea. Los resultados mostraron que las células C1498 conservan su morfología y función mieloblástica y monoblástica, revelando la aparición de la leucemia mielomonocítica. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En consideración de los pasos críticos descritos en este protocolo, se debe prestar especial atención a pH al realizar reacciones histoquímicas y tinción MGG debido a errores en el pH pueden dar lugar a interpretaciones erróneas de los resultados. Por ejemplo, la actividad esterasa butirato de α-naftil es específico para células monocíticas solamente a un pH de 6,0 ya que los granulocitos y linfocitos también pueden manchar positivo para esta prueba a valores de pH más altos. La fijación de las células no se recomienda antes de realizar la tinción de MGG, y nos mostró que sólo la fijación CAF proporciona resultados satisfactorios cuando se realizan las esterasas reacciones citoquímicas usando células C1498. Para preservar la expresión de la molécula CD115 y su detección mediante citometría de flujo, todas las muestras (por ejemplo, células, sangre, médula ósea y bazo) se debe mantener en hielo durante el procedimiento. Si no se observa tinción en citometría de flujo y / o experimentos de inmunofluorescencia, la referencia de los anticuerpos, su almacenamiento reelogios y sus diluciones deben ser controlados. Las referencias especificadas en la tabla de materiales / equipos se han seleccionado para aplicaciones de citometría de flujo o inmunofluorescencia. Los anticuerpos primarios / secundarios o sus fluoróforos conjugados podrían haber perdido su actividad debido a un almacenamiento inadecuado (por ejemplo, la exposición a la luz o el calor), la dilución inadecuada, extensa de congelación / descongelación o el uso de tampones contaminados. Ejecutar controles positivos para asegurarse de que están funcionando correctamente. Utilice el ratón de médula ósea o células de bazo derivadas de que se sabe que expresan las proteínas de interés. Para evitar el alto fondo y la tinción no específica, asegúrese de que las células se lavan adecuadamente y se mantienen a una alta humedad (por inmunofluorescencia) y que los anticuerpos se diluyen con las instrucciones. Usar la misma concentración y dilución para el anticuerpo de control de isotipo y el anticuerpo primario para determinar con precisión el nivel de fondo en la muestra. Para los experimentos de esterasa de citoquímica, laLos reactivos pueden ser probados mediante el uso de portaobjetos de control positivo y negativo contienen ratón purificada granulocítica esplénica (Ly6G +) y células de monocitos (CD115 +). El procedimiento descrito en este estudio mostró que muchas de las características leucémicas observados en ratones después de la inyección de las células C1498 compartían características comunes con leucemia mielomonocítica aguda humana 11,12. Las células leucémicas invadido resultaron en una reducción de maduros e inmaduros (progenitores y precursores de células hematopoyéticas) medulares. células C1498 están presentes en alta frecuencia (&gt; 20%) en la sangre periférica, como lo son las células monocíticas. Hepatomegalia y esplenomegalia se observó que el resultado de la infiltración de células leucémicas, y también se observaron incrementos significativos en los linfocitos B y las células mieloides para acompañar esplenomegalia. Trombopenia también se observó cuando los números de plaquetas de la sangre se estimaron usando un analizador de hematología. Fue espectáculon, usando experimentos in vitro, que C1498 células inhiben la hematopoyesis murina normal, mediante la secreción de factores solubles 13. En varios modelos de ratón tumor, las células mieloides inmaduras (incluyendo monocitos y células granulocíticas) también se ha demostrado que migrar de la médula ósea para el bazo, donde inhiben la activación de células T específicas anti-tumor y la proliferación 14. Por lo tanto, la reducción de las células hematopoyéticas que se observó en la médula ósea puede ser el resultado de una deficiencia en la hematopoyesis y / o de su emigración. Este último mecanismo podría explicar la presencia de monocitosis en la sangre periférica o la observación de las fracciones mieloides agrandados en el bazo. También es concebible que estas células podrían haber sido derivados de la mejora de la hematopoyesis esplénica. De hecho, bajo condiciones de estado estable, se identificaron algunos subconjuntos de células B esplénicas como precursores de linfocitos B maduros 15. Por otra parte, en condiciones inflamatorias, medcélulas madre y progenitores ullary se ha demostrado que trasladarse a la bazo para inducir la producción de monocitos maduros 16. Este protocolo no permite sacar conclusiones con respecto a los mecanismos que están implicados en el desarrollo de la leucemia, y ensayos funcionales, así como moleculares adicionales deben ser empleados para hacerlo. Sin embargo, estos datos incluyen información detallada sobre las características clínicas de la leucemia mielomonocítica aguda y ayudarán a los investigadores a evaluar y comprender los efectos de nuevos agentes terapéuticos.

leucemia mieloide aguda (AML) se caracteriza por la proliferación incontrolada de células mieloides hematopoyéticas que están bloqueados en las diferentes etapas de maduración. Esta desregulación puede afectar a la granulocítica, monocítica, eritrocítica o vías de diferenciación megaryocytic 1. células de AML se acumulan en la médula ósea, que conduce a la hematopoyesis alterada, lo que resulta en trombopenia, linfopenia y anemia. Las células leucémicas también invaden la sangre y los órganos no linfoides. El modelo C1498 ratón ha sido utilizado durante décadas como un modelo para la leucemia aguda puesto que las células cancerosas se aislaron a partir de un 10 meses de edad, hembra de ratón leucémica C57BL / 6 (H-2 b) en 1941. La literatura describe la invasión en la sangre , órganos hematopoyéticos (por ejemplo, el bazo y los ganglios linfáticos) y los órganos no hematopoyéticas (por ejemplo, el hígado, los pulmones, los ovarios y riñones) por las células C1498 altamente proliferativas después de que fueron inyectados a través de una deintravenosa, subcutánea o vía intra-peritoneal en ratones susceptibles 2-4. Sin embargo, se informó este modelo de ratón para inducir o bien granulocítica 2,5 o 6 mielomonocítica leucemia. Más recientemente, un estudio publicado en 2002 describe este tipo de cáncer como la leucemia de células NKT murino 7. De este modo, la literatura difiere respecto a la naturaleza de esta línea celular C1498 y la leucemia asociada induce en ratones. Estas discrepancias se deben principalmente a la falta de información detallada y actualizada publicada sobre las células leucémicas y la enfermedad, en general, debido a que muchos estudios se realizaron en los años 1950 - 70. Aquí se proporciona un protocolo detallado para describir cómo caracterizar células C1498 y analizar la naturaleza de la enfermedad leucémica que es inducido por su inyección intravenosa en ratones. La primera sección de este protocolo se dedica a una descripción de las células C1498 que han sido cultivadas in vitro. contra fluorescentecuerpos dirigidos contra la superficie y marcadores hematopoyéticos intracelulares se utilizaron para determinar su fenotipo mediante citometría de flujo. La presencia de mieloperoxidasa se evaluó mediante microscopía de inmunofluorescencia, su etapa de linaje y diferenciación hematopoyética se evaluaron usando citoquímica para evaluar la actividad de las esterasas, y se realizó la tinción de May-Grünwald Giemsa. Las células C1498 se inyectan en ratones, y la enfermedad de leucemia aguda que fue inducida se describe en la segunda sección de este manuscrito. Se utilizaron las mismas técnicas para determinar las frecuencias y los fenotipos de las células leucémicas y inherentes en la médula ósea, la sangre periférica, el bazo y los órganos no hematopoyéticas (el hígado y los pulmones). Este protocolo es altamente reproducible, y los datos presentados aquí ayudará a los investigadores a evaluar los efectos de nuevas estrategias terapéuticas. Este modelo de leucemia de ratón ya se ha utilizado para probar la inmunoterapia se acerca a unand diferentes fármacos quimioterapéuticos del cáncer 8,9. Su eficacia se evaluó mediante la determinación de la evolución de la carga tumoral y las tasas de supervivencia. Este protocolo se puede utilizar para proporcionar información adicional acerca de la distribución y la subsistencia de las poblaciones de células hematopoyéticas leucémicas y otros durante el tratamiento.

<table><tbody><tr><td>C1498 línea celular</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos de cultivo de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solución de aminoácidos no esenciales, Gibco&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina, Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio (Gibco, suplemento GlutaMAX)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td><reactivos de tinción > citoye flujo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>clon RA3-6B2, dilución final 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón B220 biotina (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>clon RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>anti-ratón CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>clon 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>clon 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>clon 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>clon GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anti-ratón CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>clon GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-ratón CD8 biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>clon 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>clon 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>anti-ratón CD11a biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>clon M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>clon M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>anti-ratón CD16/32 biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>clon 93, 1/400</td></tr><tr><td>purificado anti-ratón CD16/32 (bloqueo de FcR)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>clon 2.4G2</td></tr><tr><td>anti-ratón CD18 biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>clon M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>clon M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>anti-ratón CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>clon 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>anti-ratón CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>clon 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>anti-ratón CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>clon 390, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>clon RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>anti-ratón CD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>553134 clon IM7, 1/50</td></tr><tr><td>anti-ratón CD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>clon 104, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD49b/Pan NK PE</td><td>&nbsp; BD biosciences</td><td>553858</td><td>clon DX5, 1/50</td></tr><tr><td>anti-ratón CD80</td><td>biotina ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>clon 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-ratón CD86</td><td>biotina ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>clon GL1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-ratón CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>clon M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>anti-ratón CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>clon AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>clon 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>clon A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>clon 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>anti-ratón CD274 (PD-L1) biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>clon MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>clon D7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-ratón Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>clon HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>anti-ratón Ly-6G&nbsp; (Gr-1) biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>clon RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>anti-ratón Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>clon 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-ratón MHC clase I (H-2Db) biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>clon 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-ratón MHC clase II (I-A/I-E) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>clon M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>anti-ratón NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>clon PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anti-ratón TCRVb FITC</td><td>BD biosciences</td><td>553170</td><td>clon H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>estreptavidina PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/200</td></tr><tr>Reactivos <td></td><td></td><td></td><td>de tinción de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Anti-mieloperoxidasa de ratón (anticuerpo de cadena pesada)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp; IgG anti-cabra (anticuerpo acoplado Texas Red)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Hoechst</td><td>BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Medio de montaje 1 (Fluoromount)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr> Solución de metanol <tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr> <tr><td>reactivos < tinción citoquímicos >esterasa</solución ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cloroacetato AS-D de Naftol AS-D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>(solución base rápida de rojo, violeta y LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>concentrado tampón pH6.3 (TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>Solución de nitrito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Solución de citrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-solución de butirato de naftil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Tableta de nitrito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>Solución de pararosanilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>medio de montaje 2 (Clearmount)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010<</td><td></td></tr><tr><td>strong>May-Gr&uuml; reactivos de tinción nwald Giemsa</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; solución</td><td>nwald RAL Diagnostics</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa R solución&nbsp;</td><td>Diagnóstico RAL</td><td>320310</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/20</td></tr><tr><td>pH 6.8 solución tampón</td><td>RAL Diagnostics</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Otros materiales, reactivos y equipos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 1000 (100 mg/ml)</td><td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina SEDAXYLAN (20 mg/ml)</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin suero de albúmina (BSA) en polvo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>Solución de PBS (1x concentrado)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saponina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Solución ultrapura de EDTA de 0,5 M, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Solución de separación (Pancoll Mouse)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis (tampón de lisado de glóbulos rojos) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano (0,4 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>tubo de 50 ml (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de células (Halcón)&nbsp;</td><td>Ciencias de la vida de Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cámara & tarjeta de filtro (EZ Cytofunnel Shandon)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Cubreobjetos, 24 x 24 mm</td><td>Knittel Glass</td><td>VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Starfrost - bordes rectificados 90)</td><td>Knittel Glass</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>Tubo EDTA</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipeta 150 mm (tubo capilar)</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 26 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; jeringa y aguja de insulina 29 G</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 30 G&nbsp;</td><td>Becton & Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de citometría de flujo (azul)</td><td>Beckman Coulter</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>Pluma hidrófuga (Dakopen)</td><td></td><td></td>Tijeras estériles Dako S200230 <td></td></tr><tr><td>afiladas&nbsp;</td><td>Pinza estéril Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Thoma Cámara de recuento de células VWR</td><td></td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (Fisherbrand Plastic)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Restricción cilíndrica 15 - 30 g</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 Citocentrífugas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gasa estériles</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina c1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

La inyección intravenosa de C1498 células en ratones singénicos o congenic se ha realizado desde 1941. Estas inyecciones resultar en el desarrollo de la leucemia aguda. Sin embargo, la naturaleza de esta enfermedad no ha sido bien documentado en la literatura. Aquí, proporcionamos un protocolo técnico para la caracterización de las células C1498 in vitro y para determinar la naturaleza de la leucemia inducida in vivo. La primera parte de este procedimiento se centra en la determinación del linaje hematopoyético y la etapa de diferenciación de las células C1498 cultivadas. Para lograr esto, multi-paramétrico tinción de citometría de flujo se utiliza para detectar los marcadores de células hematopoyéticas. La inmunofluorescencia, citoquímica y una tinción de May-Grünwald Giemsa se realizan a continuación, para evaluar la expresión de la mieloperoxidasa, la actividad de esterasas y morfología celular, respectivamente. La segunda parte de este protocolo está dedicado a la descripción de la enfermedad de la leucemia que se induce envivo. Este último se puede lograr mediante la determinación de las frecuencias de células leucémicas e inherentes en la sangre, los órganos hematopoyéticos (por ejemplo, médula ósea y bazo) y tejidos no linfoides (por ejemplo, el hígado y los pulmones) mediante tinción específica y citometría de flujo análisis. La naturaleza de la leucemia luego se confirmó mediante la tinción de May-Grünwald Giemsa y tinción para esterasas específicas en la médula ósea. A continuación, presentamos los resultados que se obtuvieron usando este protocolo en ratones inyectados con PBS C1498- y de la misma edad.

Para caracterizar el modelo C1498 ratón, se procedió con dos pasos principales. En primer lugar, se caracterizaron las células C1498 para determinar su etapa de linaje hematopoyético y la maduración in vitro (Figura 1). Estas células se inyectan en ratones congenic, y la naturaleza de la enfermedad leucémica inducida se evaluó para determinar diferentes características: la infiltración de células leucémicas, su fenotipo, una cuantificación de las células hematopoyéticas (maduros y progenitores / precursores) en la médula ósea, las frecuencias C1498 de células y células hematopoyéticas maduras en la sangre y una evaluación de la hinchazón de órganos (en el bazo, el hígado y los pulmones) y la composición celular. Para caracterizar los fenotipos de células C1498 en vitro, las células se marcaron con anticuerpos dirigidos contra moléculas que se expresan por los precursores hematopoyéticos y células maduras (Tabla 1), y los resultados se analizaron mediante cytomet flujory. Las células C1498 fueron positivos para la expresión de la superficie celular de Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (&gt; 25%), y que muestran la expresión intracelular de CD3ε, receptor de T-Cell cadenas (TCR) Vβ y Mac -3 (Figuras 2A y B). Las células fueron negativos para los marcadores de superficie celular Ly6G, Ly6c, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, y pan-NK moléculas y para la expresión intracelular de CD4 y CD8 (datos no mostrados) . Ellos fueron examinados a continuación, para los marcadores de células madre hematopoyéticas y progenitores (Tabla 1). También fueron negativos para la expresión de la superficie celular de CD117, CD34, Sca-1, CD150 y CD16 / 32 (datos no presentados). a continuación, se ensayaron Estas células leucémicas para determinar la expresión de la adhesión, la presentación de antígenos y moléculas co-estimuladoras. Las células expresan los marcadores de superficie LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), y H-2D b y fueron negativas para MHC de clase II, CD80, CD86 y CD274 (datos no mostrados). C1498 células Therefore expresado tanto mieloide (Mac-1, Mac-3) y marcadores linfoides (B220, CD3, TCR). Para caracterizar mejor su linaje hematopoyético, la expresión de mieloperoxidasa se evaluó mediante microscopía de inmunofluorescencia. Todas las células fueron positivas para la mieloperoxidasa, que verifica su origen mieloide (Figura 3A). La mayoría de las células también tiñe positivo para esterasas α-naftil butirato (Figura 3B, panel izquierdo), y algunos de ellos se tiñe para los naftol AS-D cloroacetato de esterasas (flechas negras) (Figura 3B, panel derecho). Los resultados indican que las células contenían las mezclas de células monocíticas y granulocítica. Después se realizó la tinción de May-Grünwald Giemsa, se observaron las células C1498 para mostrar una morfología explosión-como con una elevada relación núcleo-citoplasma, de 3 a 5 nucléolos en el núcleo, un halo perinuclear, numerosas vacuolas y citoplasma basófilo (Figura 3C ). Thnosotros, la línea de células C1498 se compone de Monoblastos y mieloblastos. Las células C1498 (CD45.2 +), entonces se inyectaron por vía intravenosa en CD45.1 + ratones. Los ratones sucumbieron 17 a 19 días después se inyectaron las células. Estos ratones fueron sacrificados a fin de que su tipo de leucemia puede ser analizado antes de morir de la enfermedad. Los ratones de control, que fueron inyectados con PBS, se analizaron en los mismos puntos de tiempo para la comparación. Los ratones inyectados con células C1498 muestra la infiltración masiva de células C1498 en su médula ósea, como se demuestra por la aparición de altos como de las células después de May-Grünwald Giemsa tinción se realizó (Figura 4A). También conservan su monocítica y granulocítica fenotipos (Figura 4B y C), lo que demuestra una acumulación de células monoblásticos y mieloblástica que es característico de leucemia mielomonocítica aguda. para determine si los números de células hematopoyéticas medulares fueron menores después de la invasión células leucémicas, células CD45.2 + C1498, B linfocítica, monocítica y granulocítica poblaciones (incluidos los progenitores, los precursores y las células maduras), se cuantificaron utilizando la tinción de inmunofluorescencia y el flujo multiparamétrica análisis de citometría. Las células leucémicas representados 16 a 36% de las células hematopoyéticas (datos no mostrados). Los otros tipos de células se encuentran presentes en un número significativamente más bajos en los ratones inyectados con C1498 que en los ratones inyectados con PBS (por 5 veces en promedio para los subconjuntos de células B, 4 veces en promedio para las células granulocíticas y 3 veces en promedio para subconjuntos monocíticas) (Figura 5A a C). Una investigación de las frecuencias de células mononucleares en muestras de sangre leucémicas y de ratón de control mostró que contenían un porcentaje comparable de linfocitos (Figura 6A) pero una mayor frecuencia de monocíticay células leucémicas. Estas características son representativas de la leucemia mielomonocítica aguda 11 (Figura 6B). Entre las otras características de la leucemia mielomonocítica aguda 12, los ratones inyectados-C1498 presentados con hígados hinchados (hepatomegalia), los pulmones y el bazo (esplenomegalia) (Figura 7A). Se detectaron varias frecuencias de células CD45.2 + C1498 en estos órganos usando la tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo análisis (Figura 7B). Como esplenomegalia puede ser resultado de un alto número de monocitos infiltrados, también estima que las proporciones de las poblaciones de bazo. Los números de células en el linfocítica B, monocítica y fracciones de células granulocíticas fueron significativamente más grandes, en un promedio de 2 veces, 2,5 veces y 3 veces, respectivamente, en el bazo leucémicas que en los bazos de control (Figura 7C). delgada-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> Se determina en primer lugar la Figura 1. Representación esquemática del Protocolo de Configuración para la caracterización in vitro de líneas celulares cultivadas C1498 y en descripciones vivo de leucemia aguda. El linaje hematopoyético y la etapa de diferenciación de las células C1498 cultivadas de tejido. células C1498 se inyectaron en ratones congenic para inducir el desarrollo de la leucemia aguda. Se realizó el aislamiento de la médula ósea, la sangre periférica, el bazo, el hígado y tejidos del pulmón para determinar las frecuencias, fenotipos y cambios morfológicos después de la infiltración de células C1498. IV: MGG intravenosa:. May-Grünwald Giemsa <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> ad / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Análisis fenotípico de C1498 células después de cultivo in vitro. Representante flujo citometría de gráficos de puntos y los histogramas de superficie de la célula (A) e intracelular (B) C1498-expresa moléculas que se asociaron con la diferenciación de células hematopoyéticas maduras se muestran. C1498 células fueron cosechadas a partir de cultivos, lavados y etiquetados con anticuerpos fluorescentes que eran específicas para la superficie de células CD11b, CD18 y marcadores B220 o sus controles de isotipo. Para la tinción intracelular, las células se fijaron, permeabilizaron y etiquetados con anticuerpos dirigidos contra Mac-3, CD3ε, y un epítopo común de TCR (T-Cell Receptor) cadena Vβ o sus controles de isotipo. Los análisis se realizaron con gating con células vivas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterización morfológica y funcional de las células cultivadas C1498. Se recogieron las células C1498 a partir de cultivos y se centrifugaron sobre portaobjetos de microscopía. (A) La tinción para la expresión de mieloperoxidasa se realizó mediante inmunofluorescencia. (B) reacciones citoquímicas se utilizaron para analizar la esterasa α-naftil butirato (NBE) y naftol AS-D cloroacetato esterasa (CAE) las actividades en las células C1498. Las células se consideran positivos para cada etiqueta cuando, respectivamente, se observaron grandes gránulos citoplasmáticos, marrón y rojo-púrpura. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) tinción de las células C1498. Para cada experimento de tinción, el aumento del objetivo de microscopía se indica. Cada imagen es representativa de tres experimentos separados.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> Figura 4. Los ratones de médula ósea Morfologías en PBS y C1498-inyecta. Se aislaron células de médula ósea de PBS y ratones inyectados con células C1498 y se centrifugaron sobre portaobjetos de microscopía. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) tinción. (B ) esterasa α-naftil butirato (NBE) y naftol (C) AS-D se evaluaron funciones cloroacetato esterasa (CAE) usando citoquímica. En el panel A, la banda (inmaduros) o neutrófilos segmentados (maduras) son menos visibles en la médula ósea de los ratones inyectados-C1498 que los ratones inyectados con PBS. Panel B y C indican que no hubo una acumulación de células monocíticas y granulocítica en la médula ósea leucémica en comparación con los números observados en la médula ósea de control. TodasLos análisis microscópicos se realizaron utilizando un objetivo de aumento de 100X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> Figura 5. Análisis cuantitativo de ratones medulares Las poblaciones en PBS y C1498-inyectada. Se aislaron células de médula ósea de ratones inyectados con PBS y las células-C1498 y estimaron después se realizó el recuento de células. Las frecuencias de las diferentes poblaciones de células se determinaron después de inmunotinción y el flujo de células cerrada en vivo análisis de citometría. (A) los subconjuntos de células B incluyen las células CD19 + B220 + en etapas a partir de células pro-B para madurar los linfocitos B (B) células granulocíticas en el CD3 - CD11b + y + Ly6G linajes, que incluía una precursoresnd. granulocitos inmaduros y maduros (C) Los subconjuntos monocitos se definieron como CD3 - CD115 + y células incluidas en el progenitor de madurar etapas de monocitos. n = 7 ratones / grupo, y los datos se presentan como histogramas que muestran las medias ± SEM. ***, P &lt;0,0001 y **, p &lt;0,01, prueba de la t de Student para datos independientes comparando con PBS y ratones inyectados-C1498. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> Figura 6. Análisis de Sangre de subconjuntos de células mononucleares en PBS y ratones C1498-inyectado. Un resultado representativo citometría de gráficos de puntos de porcentajes de linfocitos (A) T y B, que se definieron, respectivamente, como CD3 + y células B220 + en PBS y C1498 células con inyección de. ratones (B) frecuencias celular de monocitos en leucémica y el control C1498 ratones (PBS) se determinó mediante el análisis de CD115 + Ly6C - y CD115 + Ly6C pilas de gran. El análisis se realizó por gating células vivas. Para comparar los ratones leucémicos y control, CD45.2 + Se excluyeron las células C1498. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> Figura 7. Estimación de esplénicos Poblaciones en leucémicas y los ratones de control. (A) fotografías representativas de hígado, pulmón y bazo de hinchamiento en ratones leucémica comparación con ratones control. Se extrajeron los bazos y se pesaron y se contaron esplenocitos tras la interrupción del tejido. (B) Histograma que representa las frecuencias de células leucémicas en diffErent órganos después de la inmunotinción se realizó para las células CD45.2 + y los resultados se analizaron mediante citometría de flujo. (C) Las estimaciones de B esplénica, el número de células granulocíticas y monocitos después de inmunotinción y análisis de citometría de flujo compuerta se realizaron para identificar vivo CD19 + B220 + , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - y CD3 - CD11b + pilas de gran Ly6c. Las barras de escala que se muestran para los pulmones, el bazo y el hígado indican a 1 cm. .. n = 5 - 8 ratones / grupo, y los datos están representados en los histogramas como los medios ± SEM *, p &lt;0,05; **, p = 0,0033 ratones, prueba de la t de Student para datos independientes comparando con PBS y C1498 con inyección de <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">favor clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody&gt; <tr><td> Tipo de célula </td><td> Membrana o intracelulares moléculas </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Precursores y células maduras </td><td></td></tr><tr><td> células NK </td><td> NK1.1 +, pan-NK + </td></tr><tr><td> las células NKT </td><td> NK1.1 +, pan-NK +, TCR Vbeta + (8,2), CD3 + </td></tr><tr><td> linfocitos T </td><td> TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> células B y los linfocitos B precursores </td><td> B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + </td></tr><tr><td> precursores de granulocitos y granulocitos </td><td> Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + </td></tr><tr><td> precursores monocitos y monocitos / macrófagos </td><td> CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> progenitores </td><td></td></tr><tr><td> progenitoras multipotentes </td><td> CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin-CD150-) </td></tr><tr><td> progenitores multipotentes linfoides cebado </td><td> CD117hi Sca-1ALT CD127 + (Lin) </td></tr><tr><td> progenitores linfoides comunes </td><td> CD117lo Sca-1Lo CD127 + (Lin) </td></tr><tr><td> progenitores mieloides comunes </td><td> CD16 / CD117 + 32lo CD34int (Lin-Sca-1) </td></tr><tr><td> progenitores de granulocitos-macrófagos </td><td> CD16 / CD117 + 32hi CD34hi (Lin-Sca-1) </td></tr><tr><td> progenitores de megacariocitos-eritroide </td><td> CD16 / CD117 + 32lo CD34lo (Lin-Sca-1) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Las células madre hematopoyéticas </td><td> CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin-CD34) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los marcadores de linajes de células hematopoyéticas y la diferenciación. CD: grupo de diferenciación; Lin: marcadores de células maduras; Mín:baja expresión; hola: alta expresión; Int: expresión intermedia; NK: las células asesinas naturales; TCR: receptor de células T.

Este manuscrito proporciona un procedimiento técnico que puede ser utilizado para caracterizar los cultivos de células C1498 in vitro y la leucemia aguda inducida en ratones después de su inyección. Los análisis fenotípicos y funcionales se realizan mediante citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia, y la tinción citoquímica de May-Grünwald Giemsa.

Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar las células murinas C1498 y la leucemia aguda que inducen tras la inyección intravenosa en ratones. La principal ventaja de este procedimiento es que la leucemia mielomonocítica murina inducida tras la inyección de células C1498 presenta muchas características de la enfermedad humana. Este modelo animal puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Hematología, como cuáles son los mecanismos que conducen al desarrollo de la leucemia y la deficiencia inmunitaria.La implicación de este modelo animal se extiende hacia el tratamiento de la leucemia, ya que facilita la prueba de nuevos agentes quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos. Comience transfiriendo un ratón hembra consanguíneo C57 negro 6 de cinco a seis semanas de edad a una cabina de flujo laminar estéril. Luego, coloque al animal en un sujetador.A continuación, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de 29 gauge con 100 microlitros de células. Sujete la cola en el extremo distal y desinfecte la piel de la cola con una gasa empapada en etanol al 70%. Proceda a inyectar lentamente una vez 10 a la sexta células en una vena lateral de la cola.Una vez que se hayan administrado todas las células, retire la aguja y aplique presión suave en el sitio de inyección con gasa estéril. A continuación, devuelva el animal a su jaula y realice un monitoreo cuidadoso durante las siguientes semanas. 17 a 19 días después, inserte un tubo capilar en el ángulo interno del ojo del animal leucémico anestesiado.Se extraerán de 100 a 200 microlitros de sangre del seno orbitario hacia el tubo capilar. Retire el tubo y controle la hemorragia aplicando suavemente una gasa estéril sobre el ojo. Luego, transfiera la sangre a un tubo con EDTA y almacene el tubo sobre hielo hasta el aislamiento de células mononucleares.Para aislar las células mononucleares de la sangre, primero agregue PBS suplementado con un milimolar de EDTA hasta un volumen final de 500 microlitros. Luego, transfiera la muestra a un tubo de microcentrifugadora. A continuación, use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 para colocar cuidadosamente 500 microlitros de solución separadora debajo de la sangre, teniendo cuidado de no mezclar las capas.Se pare las células mediante centrifugación y utilice una pipeta para transferir la capa blanca opaca de células mononucleares a un nuevo tubo de microcentrifugación. Luego, lave las células inmunitarias con un mililitro de PBS. Céntrifuguelas y re-suspenda el precipitado en 600 microlitros de tampón FACS para tinción y análisis mediante citometría de flujo.Para aislar la médula ósea, coloque al ratón sobre su espalda en una tabla de plástico y asegure las extremidades del animal. Desinfecte al animal con etanol al 70 %. A continuación, corte cada pata en la parte superior del fémur por encima de la articulación y tire suavemente de las tibias para separarlas de los fémures.Utilice pinzas y tijeras para retirar la piel y los músculos de los huesos, y transfiera los huesos a una placa de Petri sobre hielo. Use tijeras para eliminar las extremidades. Luego inserte una aguja de calibre 26 conectada a una jeringa de 10 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS frío, en el extremo de un hueso a la vez y lave la médula ósea dentro de la placa.Pase la suspensión celular a través de la punta de la aguja varias veces para romper las células de la médula ósea. Luego, filtre las células a través de un nuevo filtro de 70 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros para obtener una suspensión de células individuales. Centrifugue las células y re-suspenda el precipitado en dos mililitros de tampón de lisis.Llene inmediatamente el tubo con hasta 50 mililitros de PBS frío y centrifugue las células. Luego, re-suspenda el sedimento de médula ósea a una concentración de un por diez a la sexta células por mililitro en tampón FACS frío. Para preparar las células de la médula ósea para la tinción, primero coloque las laminillas en cámaras desechables con tarjetas de filtro previamente adheridas y coloque las cámaras en un citocentrífugo.Añada 100 microlitros de tampón FACS a cada cámara de la tarjeta de filtro y centrifugue brevemente las laminillas. Al final de la centrifugación, añada 100 microlitros de células a cada cámara y centrifugue las células. Luego, retire cuidadosamente las laminillas de las cámaras para secarlas al aire.Para teñir las células de médula ósea, sumerja los portaobjetos en un frasco Coplin que contenga solución de May-Grunwald durante cinco minutos. A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco con solución tampón de pH 6,8 durante un minuto. Luego, transfiera los portaobjetos a la solución de Giemsa R durante 10 minutos.Posteriormente, realice un lavado de 10 segundos con agua neutra (pH 7). Después del lavado, deje secar las laminillas al aire y añada una gota de medio de montaje a cada muestra. A continuación, coloque un borde de la cubreobjetos sobre la laminilla y bájela cuidadosamente sobre las células, presionando suavemente para eliminar cualquier burbuja de aire.En comparación con los animales de control, los animales inyectados con células C1498 presentan una infiltración masiva de células C1498 en su médula ósea, tal como se observa por el aspecto similar a blastos de las células. Las células C1498 que infiltran la médula ósea muestran fenotipos monocíticos y granulocíticos, indicativos de células monoblásticas y mieloblásticas, respectivamente, características de la leucemia mielomonocítica aguda. El análisis citométrico de flujo de las frecuencias de células mononucleares en muestras de sangre de los ratones inyectados con C1498 indica que aproximadamente una cuarta parte de toda la población de glóbulos blancos está compuesta por células leucémicas.Las frecuencias de linfocitos T y B son similares entre los animales de control y los inyectados con C1498. Sin embargo, las frecuencias de monocitos se observan en niveles más altos en los ratones inyectados con C1498, una característica de la leucemia mielomonocítica aguda. Al realizar los procedimientos de citoquímica y de May-Grunwald Giemsa, es importante recordar mantener los valores de pH, temperaturas y tiempos de incubación adecuados.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar la leucemia mielomonocítica aguda. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la Hematología exploraran la naturaleza de la leucemia aguda espontánea e inducida en otros modelos animales.

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Investigación

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Investigación del cáncer

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Las células tumorales circulantes (CTC) son pronóstico en varios tipos de cáncer metastásico. Este manuscrito describe el sistema de patrón oro CellSearch (CSS) plataforma enumeración CTC y destaca los errores de clasificación errónea comunes. Además, dos protocolos adaptados se describen, por definido por el usuario caracterización marcador de CTCs y CTC enumeración en modelos de ratones preclínicos de metástasis que utilizan esta tecnología.

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Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

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La transferencia de linfocitos bm12 a un receptor C57BL/6 es un modelo establecido de lupus eritematoso sistémico. Aquí describimos cómo iniciar la enfermedad utilizando este modelo y cómo caracterizar las células T foliculares auxiliares, las células B del centro germinal y las células plasmáticas mediante citometría de flujo.

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Este manuscrito proporciona una descripción de la metodología utilizada para establecer modelos de ratón de transducción-trasplante. Se da cuenta detallada de los errores técnicos que se deben evitar al realizar trasplantes de médula ósea. Se debe obtener una comprensión clara de la importancia del título viral alto, la transfección/transducción y la irradiación.

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Aquí, la inyección intraperitoneal de células leucémicas se utiliza para establecer y propagar la leucemia mieloide aguda (LMA) en ratones. Este nuevo método es eficaz en el trasplante seriado de células de LMA y puede servir como una alternativa para aquellos que pueden experimentar dificultades e inconsistencias con la inyección intravenosa en ratones.

Trasplante intraperitoneal para la generación de leucemia mieloide aguda en ratones

Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

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Aprende a caracterizar la línea celular C1498 y el modelo de leucemia mielomonocítica aguda en ratones mediante citometría de flujo y tinción de May-Grünwald Giemsa. Este protocolo facilita el estudio de mecanismos leucémicos y la evaluación de nuevos agentes terapéuticos en hematología.

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