Name: Los enfoques genéticos y bioquímicos para En Vivo y In Vitro Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprende técnicas de yeast two-hybrid, co-inmunoprecipitación y reticulación química para evaluar oligomerización del receptor de rianodina. Estos métodos avanzan la investigación en arritmias cardíacas.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Británica del Corazón a SZ (FS / 08/063 y FS / 15/30/31494).

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Los autores no tienen nada que declarar.

La formación de proteínas homo-oligómeros es un proceso biológico fundamental que regula la actividad de factores de transcripción, enzimas, canales iónicos y los receptores 25,26. Es importante destacar que, oligomerización proteína tiene también implicaciones patológicas incluyendo la neurodegeneración y la enfermedad cardiaca arritmogénica 4,27. Las metodologías descritas en este artículo se utilizan para identificar dominio de dominio interacciones proteína que median la auto-asociación y oligomerización. A continuación, señalamos en las etapas decisivas dentro de cada protocolo, y se discute consideraciones importantes, limitaciones y solución de problemas. El sistema Y2H puede ser empleado por primera vez para la detección de potenciales socios de interacción de proteínas, debido a su relativamente cribado de alto rendimiento, facilidad de uso y resultados altamente reproducibles. Y2H procedimientos se llevan a cabo en un laboratorio de microbiología con incubadoras estándar (placa o agitador) y las instalaciones de contención habitación. El uso de frLas células competentes preparadas eshly (paso 1.1.8) es fundamental para la transformación de levadura de alta eficiencia, mientras que para obtener los mejores resultados en los ensayos de β-Gal, colonias de levadura recién crecido (hasta 5 días de edad) se debe utilizar (paso 1.2.3). Los sistemas basados ​​en factores de transcripción distintos de GAL4 y / o genes indicadores adicionales / alternativas están disponibles, y por lo tanto plásmidos cebo y presa deben corresponderse con la cepa Y2H apropiado. Algunas cepas deben ser cultivadas en presencia de 3-amino-1,2,4-triazol, un inhibidor competitivo de la proteína HIS3, con el fin de apagar cualquier expresión constitutiva del gen indicador HIS3 7,8. La expresión de proteínas de fusión de cebo y de destino debe ser verificada mediante inmunotransferencia 17. En caso de cebo / proteínas de fusión de presa son tóxicos para la levadura, los niveles de proteína inferior tolerables podrían alcanzarse mediante la clonación de vectores en diferentes donde cebo / presa expresión es conducida por un promotor diferente. Además, es esencial para asegurar tLas proteínas de fusión de cebo / presa sombrero no muestran la actividad del gen reportero autónomo. la activación del gen indicador autónoma puede ser rescatado mediante la modificación de la construcción para eliminar la región responsable, o mediante el canje de la GAL4 DNA-BD y AD fusiones de las dos proteínas de la prueba. Por otra parte, los dominios transmembrana están mejor omiten de construcciones cebo / presa, ya que pueden inducir o mal plegamiento de proteínas de fusión mislocalization en compartimentos intracelulares de membrana. De hecho, la principal desventaja del sistema de Y2H es que las proteínas de cebo y de destino se localizan en el núcleo de levadura lejos de su localización subcelular fisiológica y, potencialmente, que carecen de modificaciones post-traduccionales específicas, lo que resulta en las interacciones falsos positivos o falsos negativos 6-9 . De mamíferos Los sistemas de expresión heterólogos son más adecuados para el estudio de proteínas integrales de membrana de mamíferos en los términos de conformación, modificaciones post-traduccionales y la localización subcelular.Uno de los métodos de transfección celular más ampliamente utilizada es la precipitación con fosfato cálcico, principalmente debido a los equipos mínimos y reactivos requeridos 11,15. Los métodos alternativos, a saber, la electroporación, liposomas, lípidos catiónicos y polímeros, pueden ofrecer una mayor eficiencia de la transfección dependiendo de la línea celular y construcción utilizada. En general, los factores principales que afectan la eficiencia de transfección son la calidad del ADN de plásmido y células de la salud / viabilidad. Los mejores resultados se obtienen cuando se utilizan ADN de plásmido de la más alta pureza (relación de absorbancia 260 nm / 280 nm de ~ 1,8) y las células que se dividen activamente. Por lo tanto, las células deben ser transfectadas a no más de 60-70% de confluencia (etapa 2.1.2), debido a que la capacidad de absorción de ADN extraño se relaciona con el área de superficie de la célula expuesta al medio 11. Además, la inclusión de antibióticos en el medio de cultivo durante la transfección (etapa 2.1.3) no se recomienda debido al aumento de la muerte celular 15. Fo precipitación de fosfato de calcio, en particular, una cuidadosa preparación y ajuste del pH (a 7,05 precisamente) de la solución de 2x HBS (etapa 2.1.1) y la formación adecuada de plásmido de ADN / calcio / complejos de fosfato por mezcla vigorosa (etapa 2.1.5) son pasos críticos para la transfección de alta eficiencia. Por lo general, la expresión de proteínas por picos de transfección transitoria dentro de 24 - 72 h. Una vez que se recogieron las células, los procedimientos subsiguientes deben llevarse a cabo a 4 ° C para minimizar la actividad de proteasa, y se recomienda la adición de inhibidores de la proteasa. la homogeneización de la célula debe ser seguido por una etapa de centrifugación para eliminar los núcleos porque el ADN cromosómico puede aumentar la viscosidad de solución y mejorar la unión no específica. Por lo tanto, se prefiere la homogeneización por medios mecánicos en un tampón iso-osmótica, por lo general en sacarosa (0,3 M) o (150 mM) NaCl. En general, se conocen tampones a base de sacarosa para mejorar la estabilidad de proteínas y reducir el potencial de agregación de proteínas no nativas, pero debido a phidratación de referencia en la superficie de la proteína, interacciones proteína-proteína electrostáticos son favorecidos. Por el contrario, los tampones a base de sal influyen en la carga neta de los grupos laterales de aminoácidos cargados en la superficie de la proteína, por lo tanto tener un sesgo hacia las interacciones más basado en hidrófobas 28. Co-IP es el ensayo bioquímico más comúnmente empleado para evaluar las interacciones proteína-proteína especialmente de tejido nativo. Su principal inconveniente es la necesidad de anticuerpos altamente específicos validados para su uso en IP e inmunotransferencia 10,16,18. Así, las proteínas recombinantes a menudo son etiquetados con un epítopo de péptido, por ejemplo., Hemaglutinina de la gripe (YPYDVPDYA) o cMyc humana (EQKLISEEDL), para los que de alta afinidad anticuerpos específicos están disponibles comercialmente. Si se desea, el anticuerpo inmunoprecipitación puede conjugarse químicamente a la Proteína-A de resina para evitar su elución y la detección durante la etapa de inmunotransferencia que pueden oscurecer el co-precipitado prOtein 16; Para lograr esto, hemos utilizado con éxito el reticulador químico 3,3&#39;-ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) 24. Es imperativo que un detergente apropiado se incluye en el tampón de IP y el material insoluble de las células homogeneizadas se retira por centrifugación para minimizar la unión no específica (etapa 3.1.3). La elección y la concentración de detergente son consideraciones importantes: los detergentes fuertes y / o concentraciones más altas reducirán sustancialmente la unión no específica, pero también pueden abolir X: la interacción proteína Y, mientras que las concentraciones más bajas o detergentes más suaves puede permitir una interacción débil para ser observado, pero puede resultar en exceso de la unión no específica. Se prefieren los detergentes de fuerza intermedios, por ejemplo, Triton X-100 al 0,5 -. Concentración 1%. Para reducir aún más la unión no específica, una proteína neutro (por ejemplo, albúmina de suero bovino en 100 g / ml) puede ser incluido en el tampón de IP, y / o el lisado celular se puede-cleare pred con la incubación previa con resina de Proteína-A sola. El número de lavados se debe optimizar para la X: Y ensayó par, por lo general tres lavados de 10 min con tampón IP (paso 3.1.9). En cualquier caso, una muestra co-IP con IgG no inmune como el anticuerpo de inmunoprecipitación siempre debe ser procesado en paralelo para servir como control negativo (etapa 3.1.6). La principal ventaja de la reticulación química es que informa sobre la composición estequiométrica de la proteína homo-oligómero. El glutaraldehído es un reticulante de uso común, ya que no requiere equipo especializado y que genera térmica y químicamente estables enlaces cruzados entre las proteínas que interactúan 19,20. Los compuestos con grupos amino libres pueden faltar en tampones de ensayo (paso 3.2.1) porque van a enfriar la reacción química. concentración de glutaraldehído y el tiempo de reacción (paso 3.2.4) deben ser optimizados para el complejo de la proteína oligomérica de interés. El principal inconveniente de esta técnica, especialiado cuando se realiza en preparaciones de células enteras, es la no especificidad de la reacción química que podría producir agregados de proteínas artificiales que carecen de importancia biológica. Alternativa en vivo (por ejemplo., Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, fluorescencia bi-molecular o complementación de luminiscencia) y las técnicas in vitro (por ejemplo., Cromatografía de exclusión por tamaño, ultracentrifugación analítica, titulación isotérmica calorimetría) están disponibles para la caracterización de la proteína libre asociación y la evaluación estequiometría de oligomerización 29,30. Cada método tiene sus propias ventajas y desventajas, y puede ser más adecuado para el estudio de una proteína específica en función de la proteína de purificación / estabilidad y disponibilidad de los equipos / reactivo. Los tres métodos complementarios que se describen aquí en detalle, a saber Y2H, co-IP y la reticulación, se han utilizado en combinación para proporcionar evidencia convincente de RyR2 homo-oligomeformación de r en el aislamiento y dentro de una célula viva.

La contracción del músculo esquelético y cardíaco se activa por retículo sarcoplásmico Ca 2 + liberación mediada por RyR. Hay tres isoformas RyR de mamífero con el canal de función compuesta de cuatro subunidades idénticas. Cada subunidad RyR consiste en una porción de regulación citoplásmica gran N-terminal y una pequeña parte C-terminal que contiene los dominios transmembrana que forman una alta conductancia Ca 2 + poro. Intra anormal y entre la subunidad interacciones subyacen a la disfunción de canales RyR y dan lugar a trastornos neuromusculares y cardíacos 1. La identificación y caracterización de los dominios específicos implicados en la estructura de RyR: función de relación es por lo tanto crucial para la comprensión de la fisiopatología RyR. técnicas de interacción proteína-proteína bioquímicos tradicionales requieren cantidades sustanciales de proteína purificada, a menudo se producen en bacterias. Esto no es factible en el caso de la RyR, una membrana muy grande protein compone de ~ 5000 aminoácidos, mientras que sus fragmentos recombinantes no son fácilmente susceptibles a la expresión bacteriana y purificación. Por lo tanto, se requieren sistemas de expresión alternativos que implican células huésped eucariotas para las proteínas integrales de membrana de mamíferos. Hemos empleado previamente Y2H, co-IP y los ensayos de reticulación para demostrar colectivamente que tetramerización N-terminal es una característica estructural que se conserva en todos los tres mamíferos RyR isoformas 2,3. Es importante destacar que se ha encontrado que un único punto de mutación asociada con la enfermedad cardíaca arritmogénica interrumpe N-terminal de auto-asociación y los resultados en un canal de RyR disfuncional 4. También hemos aplicado estas técnicas para estudios de oligomerización de la RyR citoplásmica cola C-terminal 5, así como el N-terminal de la Ca canal de liberación homóloga intracelular 2 +, el inositol 1,4,5 trifosfato receptor 2. En el ensayo de Y2H, la interactien entre dos proteínas (X e Y) se mide por la reconstitución de un factor de transcripción funcional (GAL4) y la activación subsiguiente de los genes indicadores de 6-9. Dos vectores de clonación diferentes se utilizan para generar fusiones de las dos proteínas probadas con los dos dominios físicamente separables, independientes de GAL4: DNA-Binding Domain (DNA-BD) / proteína de fusión X (cebo) y activación de dominio (AD) / proteína Y fusión (objetivo). El Y2H puede ser utilizado para probar si una proteína interactúa con sí mismo mediante la generación de GAL4 DNA-BD y fusiones AD de la misma proteína. Modificados genéticamente cepas Y2H se GAL4 y GAL80 deficiente (la proteína GAL80 es un represor de GAL4), así como TRP1 y LEU2 deficiente (para proporcionar la selección nutricional para el cebo y presa plásmidos, respectivamente). En el núcleo de levadura, los péptidos DNA-BD y AD recombinantes se ponen en estrecha proximidad física para producir un factor híbrido de transcripción GAL4 sólo a través de X sus fusiones &#39;: int Yeraction. Este enfoque permite la detección genética rápida para detectar interacciones proteína-proteína a través de la activación de la transcripción en paralelo de prototrophic (codificación HIS3 para una enzima necesaria para la biosíntesis de histidina) y cromógeno (codificación LacZ de β-galactosidasa (β-Gal)) genes informadores. La ventaja principal de la Y2H es que es un ensayo in vivo que detecta interacciones proteína-proteína, incluso débiles o transitorios. Además, la detección implica el uso sencillo de selección de crecimiento (en medios que carecen de histidina) o de una colorimétrico de ensayo (β-Gal) sin necesidad de purificación de las proteínas de cebo y de destino o la generación de anticuerpos específicos. Además, el Y2H se puede utilizar para escrutar una colección de clones desconocidos aleatorios (clones biblioteca de ADNc fusionado a GAL4 AD) para nuevas parejas de unión de una proteína cebo, también dan acceso directo al ADNc de la proteína de la biblioteca. Para extender las observaciones Y2H, indeent técnicas bioquímicas se pueden emplear. Ensayos de reticulación en combinación con inmunotransferencia Co-IP y son métodos utilizados para detectar asociaciones de proteínas en mezclas de muestras complejas, por ejemplo., Lisados ​​de células enteras 10. Su principal ventaja es que se informan en las interacciones proteína-proteína a partir de tejido nativo, a diferencia de otros métodos que requieren el uso de proteínas recombinantes. Las proteínas recombinantes también se pueden utilizar, por lo general se expresa en una línea celular de mamífero, en el que es probable que tengan sus correcta conformación y modificaciones post-traduccionales, así como la localización subcelular. Sin embargo, desde co-IP y reticulación están en ensayos in vitro haciendo uso de células homogeneizadas, es necesario confirmar si los dos socios de proteína se co-localizan en la célula intacta 11. Utilizamos rutinariamente transfección de células HEK293 de mamífero para expresar transitoriamente integral de membrana de mamíferos y proteínas citosólicas usando el método de precipitación de fosfato de calcio 2-4,12-14, Descrito aquí en detalle. Esta es una manera económica de entregar eficientemente el plásmido de ADN dentro de las células, pero depende de la línea particular de células usada y la confluencia celular, así como la pureza del ADN plasmídico 11,15. El ensayo de co-IP implica el aislamiento de la proteína nativa o recombinante de interés a partir de lisados ​​de células en condiciones no desnaturalizantes que permiten la co-purificación de parejas de interacción putativo 10,16. Se requiere el uso de dos anticuerpos independientes, el anticuerpo inmunoprecipitación para el aislamiento de la proteína X, y el anticuerpo inmunotransferencia para la detección de Y. acompañante de la proteína Se puede utilizar para probar si una proteína interactúa con sí mismo mediante la generación de dos fusiones diferentes con dos epítopo diferente etiquetas (por ejemplo., HA y cMyc). El anticuerpo inmunoprecipitación se une a través de su región Fc de la proteína-A (o proteína-G, en función de la especie animal en la que se planteen la de anticuerpos), queestá conjugado a agarosa (o sefarosa) de resina. Protein X es precipitado por el anticuerpo: Proteína-A de resina después de la incubación con el lisado de células, a saber, la fracción soluble en detergente de células homogeneizadas. Proteínas inmuno-complejos se eluyen con tampón que contiene SDS y posteriormente se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia usando un anticuerpo para detectar la presencia de la proteína Y 17. Co-IP debe llevarse a cabo con proteínas detergente soluble para evitar excesiva unión no específica. La elección del detergente y su concentración, así como el número de lavados, deben optimizarse para cada X: Y par 10,16,18. se emplea reticulación para determinar la estequiometría del complejo de proteína oligomérica. Se basa en una reacción química para crear enlaces covalentes entre protómeros que interactúan adyacentes, y por lo tanto, permite la conservación del estado oligomérico de la proteína durante la separación SDS-PAGE. Hay numerosos reage entrecruzamientonts de diferentes longitudes y química dirigidos a diferentes grupos reactivos en las proteínas, aminas primarias, típicamente carboxílico o grupos tiol. A continuación, describimos el uso de glutaraldehído (OHC (CH 2) 3 CHO), un agente de reticulación homo-bi-funcional con dos grupos aldehído en ambos extremos que reaccionan con los grupos amino libres presentes en los residuos de lisina 19,20. La reticulación es seguido de una manera de la concentración o dependiente del tiempo que resulta en la formación de aductos. Reacción glutaraldehído se detiene con hidrazina (H 2 NNH 2) y muestras de proteínas son luego analizados por SDS-PAGE e inmunotransferencia 17 para evaluar su estado de oligomerización. Debemos tener en cuenta que la reticulación no induce oligomerización, sino que simplemente crea puentes estables entre complejos de proteínas preexistentes. Consideraciones importantes cuando se llevan a cabo experimentos de entrecruzamiento incluyen la elección del agente de reticulación, su concentración y tiempo de reacción 19,20.

<table><tbody><tr><td><fuerte>PARTE 1 levadura de dos híbridos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>placa incubadora</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Usado a 30 &0 &00; C</td></tr><tr><td>Incubadora agitadora orbital</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Usado a 30 &deg; C con agitación a 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>Para medir OD600 de cultivo de levadura; para medir la absorbancia a 420 nm en líquido Ensayo b-Gal</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contiene vector de cebo pGBKT7, vector de presa pACT2&nbsp; y cepa de levadura Y190&nbsp;</td></tr><tr><td>Levadura Base Nitrogenada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Para preparar un medio de crecimiento SD mínimo&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento de abandono sin leucina y triptófano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>Para preparar un medio de crecimiento SD mínimo&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento de abandono sin leucina, triptófano, histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>Para preparar un medio de crecimiento SD mínimo&nbsp;</td></tr><tr><td>Testículos de arenque portadores de ADN&nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>Para la transformación de levaduras</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman Grado 5&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>para su uso en el ensayo de b-Gal de papel de filtro de elevación de colonias</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranósido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>para su uso en el ensayo de b-Gal de papel de filtro de elevación de colonias</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenil-&beta;-D-galactopiranósido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>para uso en el ensayo</td></tr> <tr><td>de b-Gal líquido<FUERTE>PARTE 2. Expresión de proteínas en una línea celular de mamífero</línea celular fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; &nbsp; CRL-1573 y comercio;</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora humidificada (5% CO2, 37 &° C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>Para cultivar células de mamíferos</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>Para preparar el medio de crecimiento para células de mamíferos</td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>Para preparar el medio de crecimiento para células de mamíferos</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Para homogeneizar células</td></tr><tr><td>Aguja 23 G (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>Para homogeneizar células</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa (Completo)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>Para prevenir la proteólisis</td></tr><tr><td><fuerte>PARTE 3. Métodos bioquímicos in vitro&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (sistema SDS-PAGE)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>Para electroforesis en gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Sistema de transferencia semiseco)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Para la transferencia electroforética</td></tr><tr><td>Procesador compacto de película de rayos X</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>Para uso en inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>Para uso en reticulación química</td></tr><tr><td>Perlas de sefarosa de proteína-A&nbsp;</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>Para su uso en ensayos co-IP</td></tr><tr><td>Anti-HA (IgG policlonal de conejo Y-11)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>Para uso en ensayo co-IP</td></tr><tr><td>IgG de conejo no inmune</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Para uso en ensayo co-IP</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (IgG monoclonal de ratón 9E10)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>Para uso en inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 IgG monoclonal de ratón)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Para uso en inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Anti-ratón IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>Para uso en inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>Para uso en inmunotransferencia</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting</td><td>Substrate Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>Para uso en inmunotransferencia</td></tr></tbody></table>

los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; en vivo</em&gt; y<em&gt; in vitro</em&gt; evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina estudio de caso

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

La oligomerización es a menudo un requisito estructural para que las proteínas cumplan su función celular específica. Por ejemplo, la tetramerización del receptor de rianodina (RyR) es necesaria para la formación de un poro funcional del canal de liberación de Ca2+. Aquí, describimos protocolos detallados para la evaluación de la autoasociación de proteínas, incluidos los ensayos de doble híbrido de levadura (Y2H), coinmunoprecipitación (co-IP) y reticulación química. En el sistema Y2H, la autointeracción de las proteínas se detecta mediante el ensayo de β-galactosidasa en el cebo GAL4 que coexpresa levadura y fusiones diana de la proteína de ensayo. La autointeracción de las proteínas se evalúa además mediante co-IP utilizando fusiones marcadas con HA y cMyc de la proteína de prueba coexpresada en células HEK293 de mamíferos. La estequiometría precisa de la proteína homooligómero se examina mediante reticulación y análisis SDS-PAGE después de la expresión en células HEK293. Utilizando estas técnicas diferentes pero complementarias, hemos observado consistentemente la autoasociación del dominio N-terminal de RyR y hemos demostrado su capacidad intrínseca para formar tetrámeros. Estos métodos se pueden aplicar a la interacción proteína-proteína y a los estudios de homooligomerización de otras proteínas integrales de membrana de mamíferos.

En el sistema de Y2H, el cebo: presa interacción se prueba inicialmente por la selección de levadura que carece de crecimiento en medio (triptófano, leucina e) histidina y posteriormente evaluada por β-Gal ensayos de actividad enzimática (Figura 1). La levadura se cultivaron en medio que carece de histidina tiene tasa de crecimiento lento, que depende de la fuerza del cebo: la interacción de proteínas presa. El ensayo de β-Gal se lleva a cabo en la levadura (cultivaron en medio que carece de triptófano y leucina solamente) o bien crece en soporte sólido (placas de agar) o en cultivo líquido, con los últimos resultados cuantitativos rendimiento. Hemos utilizado con éxito la Y2H para identificar las interacciones de dominio de dominio dentro del RyR2, así como nuevos socios de proteínas 2-4,12,21,22. Por ejemplo, hemos examinado una serie de construcciones que abarcan toda la longitud de la secuencia del péptido RyR2 para la interacción con un fragmento N-terminal de solapamiento (AD4L: residuos RyR2 1-906 fusionada con GAL4 AD). 3 ensayos de filtros de colonias de elevación del papel β-Gal producen colonias vivas de color azul levadura única para el BT4L: par AD4L (Figura 2), lo que demuestra que AD4L interactúa consigo misma, a saber, la BT4L construir (residuos RyR2 1-906 fusionado con GAL4 DNA-BD). Se detectaron colonias de color azul claro para el BT8: par AD4L lo que sugiere una asociación más débil secundaria con el dominio C-terminal extrema (BT8), mientras que la levadura co-transformada con cualquier otro constructo permanecieron blancas y por lo tanto negativo como cebo: la interacción de proteínas presa. Los resultados cuantitativos, obtenidos mediante ensayos de β-Gal líquidos (Figura 2B), indicaron BT4L robusto: equivalente interacción AD4L en fuerza a la conocida asociación entre la proteína p53 (pVA3) y grande de SV40 T antígeno (pTD1), mientras que el BT8: interacción AD4L fue considerablemente más débil (&lt;10% en comparación con el control). Rutinariamente realizamos experimentos de co-IP (Figura 3) fespués de expresión transitoria en una línea de células de mamífero (HEK293), como un ensayo bioquímico independiente para reforzar los hallazgos Y2H 2-4,12-14,21-24. Para verificar RyR2 N-terminal libre interacción, dos plásmidos separados que codifican para los residuos de RyR2 1-906 etiquetados, ya sea con el péptido cMyc o epítopo HA (BT4L y AD4L, respectivamente), se co-transfectaron en células HEK293 utilizando el método de precipitación con fosfato cálcico 3. La fracción post-nuclear de las células homogeneizadas se solubilizó con los CHAPS detergente, y el material insoluble se separó por centrifugación para producir el lisado celular. El lisado celular, tratados con el agente reductor ditiotreitol, se incubó con Ab HA y cuentas de Proteína-A Sepharose para inmunoprecipitar AD4L marcada con HA. Muestras de Co-IP, eluidas con tampón que contenía SDS, se cargaron en dos geles de SDS-PAGE separados (1/10 y 9/10 TH divididas) y se analizaron por inmunotransferencia con Ab HA y Ab cMyc, respectively. El éxito directo IP de AD4L (~ 100 kDa) por Ab HA fue verificada mediante inmunotransferencia, pero no en el control negativo utilizando IgG de conejo no inmune (Figura 4A). Es importante destacar que, de etiquetado cMyc BT4L (~ 100 kDa) se recuperó sólo en el HA IP Ab, y no en el control negativo en ausencia de AD4L inmunoprecipitada (Figura 4B). Y2H ensayos y co-IP proporcionan evidencia consistente para RyR2 N-terminal libre interacción, pero no informan sobre el estado de oligomerización del dominio N-terminal, es decir si se forma solamente dímeros o complejos mayores. Cabe señalar que los complejos se disocian y solamente las subunidades que comprenden será detectada por SDS-PAGE a causa de SDS y desnaturalización de la proteína inducida por calor se suprime las interacciones proteína-proteína. Para superar esto, utilizamos el entrecruzamiento (Figura 5) que se conjuga químicamente y de manera estable preexistente protein oligómeros, cuya masa molecular puede entonces ser examinado por SDS-PAGE separación por tamaños 2-5. Por ejemplo, HEK293 homogenado celular que expresa cMyc-BT4L, se trata con el agente reductor ditiotreitol, se hizo reaccionar con glutaraldehído y se analizó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia usando Ab cMyc (Figura 6). Además del monómero (~ 100 kDa), una banda de proteína de alta masa molecular de ~ 400 kDa se detectó en una manera dependiente del tiempo, lo que indica RyR2 N-terminal formación tetrámero 3. En particular, tetrámero fue la especie predominante oligómeros, con dímero mínima y bandas trimer observados. Para determinar su masa molecular aparente, el oligómero BT4L se separó al 4 - 15% de geles de gradiente de SDS-PAGE 3. Hemos producido la curva estándar retraso masa / gel molecular usando patrones de proteína con un rango de 30 - 460 kDa, y se calculó el oligómero ser 358 kDa 15 (n = 4). Esta masa molecular aparente es consistente con un tetrámero BT4L dispuestos en unade forma circular cerrada en lugar de en forma lineal, como se espera de la disposición de las cuatro subunidades dentro del canal RyR2 nativo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo Y2H. La levadura, co-transformada con cebo y de destino plásmidos, se selecciona para el crecimiento en un medio que carece de histidina y / o ensayó la actividad enzimática β-Gal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Figura 2. Y2H Sugiere RyR2 N-terminal de dominio de la libre interacción. (A) Esquema que representa la serie (cebo) de RyR2 fragmentos de proteínas superposición humanos probados en el sistema de Y2H<html> interacción con el constructo AD4L RyR2 N-terminal (presa). Los resultados cualitativos obtenidos mediante ensayos de papel β-Gal filtros de lavado de colonia se indican en múltiplos &quot;+&quot; o &quot;-&quot; para la interacción negativa ensayos (B) de líquido cuantitativa β-Gal se normalizaron con el control positivo (pVA3 codifica para GAL4 DNA-BD. fusión con la proteína p53; pTD1 codifica para la fusión GAL4 AD con el antígeno T grande de SV40). Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Figura 3. Co-IP Diagrama de flujo. Las células de mamífero, co-transfectadas con plásmidos que X e Y, se homogeneizan y detergente solubilizadas para producir el lisado celular utilizada en el ensayo de co-IP, seguido de SDS-PAGE e inmunotransferencia.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Figura 4. Co-IP indica RyR2 N-terminal de dominio libre interacción en células de mamífero. HEK293 células se co-transfectaron durante transitoria co-expresión de cMyc-tagged (BT4L) y HA-tagged dominio (AD4L) RyR2 N-terminal ( los residuos 1 a 906). AD4L se inmunoprecipitó con Ab HA de solubilizadas en CHAPS y lisado HEK293 ditiotreitol tratados, mientras que los ensayos de control, co-IP como negativos se realizaron con IgG de conejo no inmune. Las proteínas inmunoprecipitadas se calentaron a 85 ° C durante 5 min y se resolvieron en 20 mA durante 3 horas a través de 6% en geles de SDS-PAGE separados cargados de 1/10 o 9/10 de las muestras de IP. Después de la transferencia de proteínas a 80 V durante 2 horas a polyvinylidene membrana de difluoruro, análisis de inmunotransferencia se llevó a cabo usando (1: 1000 dilución) Ab HA (A) o Ab cMyc (B), respectivamente, seguido de peroxidasa de rábano conjugada anti-IgG de ratón (dilución 1: 10.000) y el aumento de la detección de quimioluminiscencia (1 min de exposición). Una alícuota del lisado celular, 1/50 del volumen procesado en muestras de IP, también se incluyó para servir como patrón de masa molecular. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Figura 5. Diagrama de flujo de reticulación. Las células de mamífero transfectadas con el plásmido X, se homogeneizan y se somete a reacción con glutaraldehído en el ensayo de reticulación, seguido de SDS-PAGE e inmunotransferencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Figura 6. La reticulación Indica RyR2 N-terminal de dominio de tetrámeros Formación Se transfectaron células HEK293 para la expresión transitoria de dominio (BT4L) RyR2 N-terminal marcada con cMyc (residuos 1 - 906).. homogeneizado celular, se trata con el agente reductor ditiotreitol, se incubó con glutaraldehído para los puntos de tiempo indicados. Las muestras se calentaron a 85 ° C durante 5 min y se resolvieron por SDS-PAGE (6% de gel) a 20 mA durante 3 horas. Después de la transferencia de proteínas a 80 V durante 2 horas a una membrana de difluoruro de polivinilideno, el análisis de inmunotransferencia se llevó a cabo usando (1: 1000 dilución) Ab cMyc, seguido de peroxidasa de rábano picante conjugada con IgG anti-ratón (1:10.000 dilución) y la detección de quimioluminiscencia (1 min de exposición). Monomérico (M: ~ 100 kDa) y las formas tetrámera (T) se indican por las flechas. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La oligomerización del receptor de rianodina, un canal iónico homotetrámero que media la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, es fundamental para la contracción del músculo esquelético y cardíaco. Aquí, presentamos métodos complementarios in vivo e in vitro para detectar la autoasociación de proteínas y determinar la estequiometría de homooligómeros.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

El objetivo general de estas tres técnicas experimentales complementarias, a saber, el sistema de dos híbridos en levadura, la co-inmunoprecipitación y el entrecruzamiento químico, consiste en evaluar las interacciones proteína-proteína y, en particular, la autoasociación, así como determinar la composición estequiométrica de los homo-olímeros proteicos. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de las cardiopatías, como la oligomerización de receptores ultrasecados, asociada a arritmias cardíacas y muerte súbita. Las principales ventajas de estas técnicas son su cribado relativamente de alto rendimiento, facilidad de uso y resultados altamente reproducibles, mientras que requieren un equipo y reactivos mínimos.Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia la terapia de enfermedades cardíacas arritmogénicas, ya que ayudan a establecer el mecanismo molecular de acción de los fármacos antiarrítmicos. Por lo general, las personas nuevas en la co-inmunoprecipitación tendrán dificultades debido a la posibilidad de descartar las perlas de agarosa con proteína, que son muy pequeñas, al aspirar el sobrenadante durante los pasos de centrifugación. En este ensayo de doble híbrido en levadura, se utilizan células de levadura en fase logarítmica media para la transformación.Recoger las células por centrifugación, resuspender cada pellet en cinco mililitros de agua estéril y reunir las suspensiones celulares. Centrifugar la suspensión celular. Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet de levadura en un mililitro de acetato de litio estéril al uno por ciento y TE, recién preparado. Las células de levadura competentes deben usarse dentro de una hora a partir de su preparación.Prepare muestras de plásmido mezclando ADN plasmídico cebo y ADN plasmídico diana con 100 microgramos de ADN de testículo de arenque como ADN portador. A cada tubo de 1,5 mililitros, añada 100 microlitros de la suspensión de levadura competente y 600 microlitros de solución de acetato de litio al uno por ciento y PEG, y vortexee durante aproximadamente 30 segundos. Incube a 30 grados Celsius durante 30 minutos, con agitación.Añada 80 microlitros de dimetilsulfóxido y mezcle bien mediante inversión suave. Someta a choque térmico durante 15 minutos en un baño de agua a 42 grados Celsius, agitando cada dos o tres minutos. Enfríe la suspensión celular en hielo durante dos minutos y luego centrifugue para recuperar la levadura.Re-suspenda cada pellet celular en 100 microlitros de tampón TE 1X. Plaque las células en placas de medio mínimo SD apropiado para mantener la presión selectiva sobre ambos plásmidos, el cebo y el diana. Incube las placas boca abajo a 30 grados Celsius durante cuatro a cinco días. Las colonias de levadura están listas para este ensayo cuando tengan aproximadamente dos milímetros de diámetro.Pipetee 2,5 mililitros de solución de tampón Z y X-gal recién preparada en una placa limpia de 100 milímetros y coloque un papel de filtro de celulosa en la placa. Coloque un papel de filtro nuevo sobre la superficie de la placa con las colonias de levadura que se van a analizar. Utilice pinzas para frotar suavemente el papel de filtro sobre la placa y deje durante aproximadamente cinco minutos para que las colonias se adhieran.Mientras utiliza equipo de protección personal adecuado, levante cuidadosamente el papel de filtro y sumérjalo en una cubeta de nitrógeno líquido durante 30 segundos. Deje que el papel de filtro congele se descongele a temperatura ambiente durante dos minutos. Coloque el papel de filtro con el lado de las colonias hacia arriba sobre el papel de filtro previamente humedecido dentro de la placa de 100 milímetros e incube a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias azules.Un día antes de la transfección, alimente las células HEK293 en una placa de Petri de 100 milímetros, para que las células alcancen una confluencia del 60 al 70 por ciento al día siguiente. Incube durante 16 a 18 horas en un incubador humedecido. El día de la transfección, diluya 24 microgramos de ADN plasmídico con 60 microlitros de cloruro de calcio 2,5 molar y agua estéril desionizada para obtener un volumen total de 600 microlitros.Agite en vórtex para mezclar. Añada gota a gota la solución de ADN plasmídico más calcio a un tubo de 50 mililitros que contiene 600 microlitros de solución salina tamponada con HEPES 2X, agitando constantemente y con vigor mediante vórtex. Incube durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de ADN plasmídico con fosfato de calcio.Después de la incubación de 20 minutos, agite brevemente por vórtex y agregue la solución gota a gota sobre las células HEK293 para cubrir toda la superficie de la placa de Petri. Incube las células a 37 grados Celsius en un 5 % de dióxido de carbono. Después de aproximadamente seis horas, cambie el medio de crecimiento y coloque las células nuevamente en el incubador.24 horas después de la transfección, recolecte las células según se describe en el texto del protocolo. Re_suspenda el pellet celular en 500 microlitros de tampón de homogenización frío con hielo y transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros que contenga perlas de vidrio. Utilice una aguja fina acoplada a una jeringa de un mililitro para homogenizar las células sobre hielo.Con la tapa del tubo cerrada, atraviese la tapa con la aguja y disperse vigorosamente la suspensión celular a través de las perlas de vidrio. Centrifugue a 1500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar núcleos y células no rotas. Guarde el sobrenadante, que representa la fracción posnuclear, para su uso en experimentos de co-inmunoprecipitación o reticulación.Para iniciar este procedimiento, solubilice la fracción subcelular posnuclear con chaps al 0,5 por ciento e incube durante al menos dos horas a cuatro grados Celsius con mezcla constante. Centrifugue a 20.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para obtener un sedimento del material insoluble. Guarde el sobrenadante.Esto se denomina el lisado celular. Prepare perlas de agarosa con proteína A en tampón de inmunoprecipitación según se describe en el texto del protocolo. Añada un microgramo del anticuerpo inmunoprecipitante a un tubo que contenga proteína A.Como control negativo, agregue un microgramo de IGG no inmune al otro tubo que contiene proteína A. Incube durante al menos dos horas a cuatro grados Celsius, con mezcla constante. Recupere las perlas por centrifugación y deseche cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo.Transfiera 200 microlitros del lisado celular a cada uno de los dos tubos que contienen el anticuerpo y las perlas de proteína A. Incube durante al menos dos horas a cuatro grados Celsius con mezcla constante para permitir la unión antígeno-anticuerpo. Recupere las perlas y lávelas con 200 microlitros de tampón de inmunoprecipitación.Incube durante 10 minutos a cuatro grados Celsius con agitación. Después de tres lavados, deseche cuidadosamente el sobrenadante por pipeteo. Añada 30 microlitros de tampón de carga para proteínas a las perlas y centrifugue a 1500 ×g durante dos minutos a cuatro grados Celsius.Guarde el sobrenadante que contiene la muestra de co-IP aludida para la posterior electroforesis SDS y inmunotransferencia. Para realizar el entrecruzamiento químico, centrifugue la fracción subcelular posnuclear para sedimentar los agregados proteicos. Guarde el sobrenadante y divídalo en ocho alícuotas de 20 microlitros cada una.Añada glutaraldehído al 0,0025 por ciento en volumen por volumen a solo una muestra. Inicie el temporizador y deje que el glutaraldehído reaccione a temperatura ambiente durante el tiempo indicado. Detenga la reacción del glutaraldehído en el momento especificado con hidrazina al dos por ciento en volumen por volumen y agregue cinco microlitros de tampón de carga proteica 5X para desnaturalizar las proteínas.Se utilizó el sistema de dos híbridos en levadura para analizar constructos superpuestos que abarcan toda la longitud de la secuencia peptídica del receptor de rianodina, en busca de interacciones con AD4L y el fragmento terminal. Los ensayos de beta-galactosidasa en papel filtro por levantamiento de colonias produjeron colonias de color azul intenso únicamente para el par BT4L/AD4L, lo que indica que AD4L interactúa consigo mismo. Se detectaron colonias de color azul pálido para el par BT8/AD4L, lo que sugiere una asociación secundaria y más débil con el dominio C-terminal extremo.Los resultados cuantitativos de los ensayos líquidos de beta-gal indicaron una interacción BT4L/AD4L robusta, equivalente en intensidad a la asociación conocida entre la proteína P53, pVA3 y el antígeno grande T del SV40, pTD1. La interacción BT8/AD4L fue considerablemente más débil. Los hallazgos del sistema de dos híbridos en levadura se ven reforzados por experimentos de co-inmunoprecipitación tras la expresión transitoria de AD4L marcado con HA y BT4L marcado con cMyc en una línea celular de mamífero.Se observó la inmunoprecipitación directa de AD4L marcado con HA mediante un anticuerpo 2 HA, y BT4L marcado con cMyc se recuperó únicamente en la inmunoprecipitación anti-HA. Se realizó un entrecruzamiento químico en homogenato celular que expresa cMyc BT4L, seguido de electroforesis SDS-PAGE e inmunotransferencia, utilizando un anticuerpo contra cMyc. Además del monómero de 100 kilodalton, se detectó de manera dependiente del tiempo una banda proteica de alta masa molecular de aproximadamente 400 kilodalton, lo que indica la formación de un tetrámero del receptor de rianodina y del extremo terminal.Al intentar la transfección de células de mamífero mediante precipitación de fosfato cálcico, es importante recordar agitar constantemente y con vigor el tampón fosfato en un tubo grande para lograr una aireación eficiente, mientras se añade muy lentamente la solución de ADN plasmídico. Tras seguir estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como la microscopía confocal en imágenes de calcio. Estas técnicas deberían ayudar a responder preguntas adicionales, como la localización y las propiedades de liberación de calcio de los canales receptores de rianodina en células vivas.Tras su desarrollo, estas técnicas allanaron el camino para que investigadores de diversos campos de la señalización celular evaluaran la homo-oligomerización de proteínas, un proceso biológico fundamental que regula la actividad de factores de transcripción, enzimas, canales iónicos y receptores.

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Biología

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