Name: La incorporación de residuos específicos de no canónicos aminoácidos en las proteínas modelo usando una Escherichia coli Sistema de transcripción-traducción libre de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprende a incorporar aminoácidos no canónicos en proteínas modelo usando un sistema de expresión libre de células de Escherichia coli. Este método permite estudios estructurales y funcionales sin hospedadores vivos.

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E.G. Worst y A. Ott agradecen el apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro del centro de investigación colaborativo SFB 1027, así como de la Universidad del Sarre. E.G. Worst, A. Ott y V. Noireaux reconocen además la ayuda financiera de la Organización del Programa de Ciencia de las Fronteras Humanas (HFSPO). Los autores agradecen a Tobias Baumann y Stefan Oehm (Instituto de Química, Technische Universität Berlin) por la lectura crítica.

Los autores no tienen nada que revelar.

Una herramienta fácil de usar sistema de expresión libre de células como una estrategia viable hasta el residuo específicamente incorporar NCAA en proteínas, se presentó. Con este fin, el extracto crudo se complementa con la codificación de ADN del vector para la proteína de interés, la memoria intermedia de energía y los aminoácidos correspondientes. Tenga en cuenta que el volumen de la alícuota extracto crudo depende de la concentración de proteína de extracto bruto 34. La eficacia de la expresión libre de células se optimiza en función de la concentración de la construcción de ADN vector. Los volúmenes de los componentes del tampón de energía varían en función de la optimizado Mg y las concentraciones de K-glutamato con el fin de permitir a altos rendimientos de la proteína expresada modelo libre de células. Una evaluación preliminar del experimento incorporación se puede obtener mediante la realización de SDS-PAGE del medio de reacción libre de células no purificado. Para un análisis más detallado, espectroscopia de masas HPLC-ESI se propone como un medio para comprobar si hay incor completa, en residuos específicosporación de la NCAA. Como preparación para este último, los sistemas de columnas de centrifugado se utilizan para permitir la purificación His-tag y el intercambio de tampón con los pequeños volúmenes que utilizamos en este protocolo. Incluyendo espectroscopia de masas HPLC-ESI, todo el protocolo se puede realizar dentro de los 2 días. No incluye ninguna medida particularmente críticas. Sin embargo, las optimizaciones de concentración de Mg y K-glutamato, así como de vector de ADN son cruciales para expresar altos rendimientos de la proteína modelo. El uso del vector de expresión altamente eficiente gene_of_model_protein-pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-T500 es muy recomendable. La elución de Su-etiquetados proteínas es por lo general debido a la alta concentración de imidazol (&gt; 150 mM) y otras sales tales como NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mm) o NaCl (&gt; 50 mM) que generan mucho ruido de fondo en análisis de espectroscopia de masas 49 . Intercambio de dichos tampones de elución con un tampón de almacenamiento adecuado proteína estabiliza el modelo protey reduce drásticamente el ruido de fondo durante el análisis espectroscópico de masas. Como resultado, se puede sustituye Arg en las seis posiciones dentro de la proteína modelo. En el sistema de expresión, no hay residuos de Arg puede ser detectado. Esto simplifica la incorporación de residuos específicos de análogos de Arg en comparación con otros sistemas de expresión que requieren nuevas estrategias de agotamiento 29,30. El enfoque libre de células presentado elude las limitaciones inherentes de los métodos in vivo que se deben a la toxicidad puede, o la fuerte dependencia de la secuencia de ARNm en las estrategias de producción única de proteínas 24,31. Contrariamente a la empleada en el sistema in vitro, la escisión in vivo de Can a homoserina y hidroxiguanidina se produce 31. Sin embargo, el sistema libre de células retiene una cantidad suficiente de Lys para competir con análogos tales como Hyl. El análisis HPLC-ESI espectroscópico de masas muestra que la proteína modelo contiene tanto, el Canonical así como el análogo no canónico en diferentes proporciones. La incorporación de residuos específica de Lys es posible en general, pero para la sustitución completa, más estrategias de agotamiento, o aaRs especialmente diseñados y optimizados ARNt para el reconocimiento de la NCAA necesita ser desarrollado. Hemos logrado excelentes rendimientos de las proteínas expresadas, modelo modificados libres de células mediante la adición de la NCAA en la misma concentración que los canónicos. La eficacia de incorporación depende de la naturaleza de la NCAA a ser incorporados. Incluso los mayores rendimientos todavía podrían ser realizable mediante la optimización de la concentración de la NCAA. Los resultados presentados demuestran la aplicabilidad del sistema empleado para la incorporación de residuos específicos de la NCAA, siempre que sean aceptados por el sistema de traslación endógena canónica. Para la incorporación de residuos específicos de la NCAA específicos, uno más tiene que comprobar si los residuos de la distur CAA análogaB, el sistema de expresión. Sistemas de transcripción-traducción libres de células se pueden diseñar de diferentes organismos para responder a diferentes demandas 54. El totalmente E. coli mecanismos de transcripción-traducción del sistema libre de células que aquí se presenta active el uso de bacteriófago y E. promotores de E. coli, y pueden actuar en paralelo o de forma consecutiva en cascadas 55. La aplicabilidad general y la facilidad de uso hacen que el método de una herramienta potente para la investigación adicional en la toxicidad de aminoácidos y la aplicación terapéutica.

El código genético es universal a la biosfera. Codifica para un conjunto de 20 aminoácidos canónicos, que a veces se extiende por seleniocisteína 1 o 2 pyrrolysine. Es el ribosoma que traduce el código genético con la ayuda de tRNAs en cadenas de aminoácidos que se pliegan en proteínas. Los grupos funcionales de los aminoácidos canónicos, en combinación con modificaciones postraduccionales, contribuyen a una gama excepcionalmente amplia de la función de proteínas 3,4. En principio, las limitaciones funcionales debido a la limitada serie de aminoácidos canónicos se pueden superar mediante la incorporación de más, aminoácidos canónicos (NCAA) que permiten nuevas químicas y nuevas funcionalidades 3,4. Hay dos enfoques complementarios para la incorporación de la NCAA: sitio- o la incorporación de residuos específicos. El primer método implica considerables dificultades técnicas, ya que el conjunto canónico de aminoacil-ARNt-sintetizadoretases (aaRS) y ARNt deben ampliarse por un par ortogonal aaRs-ARNt que no debe interactuar con la maquinaria de traducción endógena. Sobre la base de la ingeniería cuidadosa, este enfoque incorpora las NCAA como mutaciones puntuales en los sitios de proteínas deseadas. La incorporación específica de sitio de NCAA está genéticamente codificado por un codón que no está asignado a un ácido amino canónica (CAA), por lo general un codón de 5-9. Este método implica cambios en la función en un centro determinado en lugar de a través de toda la proteína 10-13. En contraste, la incorporación de residuos específica se basa en el reconocimiento erróneo del aminoácido no canónico por la maquinaria de traducción canónica. La incorporación se produce debido a la falta de especificidad de sustrato de los IAA. La incorporación de residuos específicos de la NCAA, basada en la obra de Cohen y compañeros de trabajo 14, ha dado lugar a importantes aplicaciones 3,10, entre ellos etiquetado bioortogonal 15-17 de proteínaso elucidación de la estructura de las proteínas en cristalografía de rayos X 18. Como aaRs naturales generalmente prefieren su aminoácido relacionado sobre un NCAA isoestructural, eficiente en la incorporación vivo en residuos específicos por lo general requiere un huésped de expresión auxotrófico no es capaz de sintetizar el análogo canónica de la NCAA. Las células huésped se cultivan en medio de crecimiento que sólo entrega una baja concentración del CAA análoga. Su agotamiento en combinación con la administración de suplementos consecutiva con la NCAA obliga al huésped de expresión para incorporar la NCAA en la proteína modelo en múltiples sitios, canónicamente prescritos. En contraste con el enfoque específico del sitio, esto generalmente tiene un profundo impacto en toda la estructura de la proteína, lo que lleva a modificar considerablemente las propiedades físicas y químicas de las proteínas 19,20. Sin embargo, la mayoría de la NCAA son inhibidores de crecimiento para el huésped de expresión 3, ya que se incorporan en muchos otros proteins, además de los de interés durante la expresión de genes recombinantes. Esto limita claramente el enfoque in vivo. La incorporación in vivo de los aminoácidos que son tóxicos o que tienen fuerte influencia en la estructura de la proteína sigue siendo particularmente difícil. Sin embargo, estas moléculas se encuentran entre los más prometedores para diseñar proteínas con funciones extraordinarias. Un ejemplo es el,, de origen natural L-canavanina noncanonical tóxico (Can), un análogo de la L-arginina (Arg). Afecta y bloques Arg caminos de reacción reguladoras y catalíticas, y su presencia en la célula viva puede conducir a la muerte inmediata 3,21-23. Su incorporación en proteínas en las posiciones de arginina puede reducir la estabilidad de la proteína 21-23. Debido a la toxicidad resultante, la expresión de canavanina que contiene proteínas en Escherichia coli (E. coli) y otros huéspedes de expresión común sigue siendo un reto. Por estas razones, completa in vivo iNCORPORACIÓN de Can en todas las posiciones Arg apropiadamente se ha confirmado una sola vez 24, utilizando un sistema de producción de una sola proteína elaborada. Sin embargo, Can ha sido propuesta como un agente anti-cáncer de 25 a 27, y como un estimulador para las enfermedades autoinmunes en humanos 28. Además, es objeto de diversos estudios sobre su anti-metabólico, antibacterianos, antifúngicos y antivirales 25. Estas propiedades plantean una demanda de eficiente y fácil de llevar a cabo los métodos de expresar Puede que contiene proteínas de farmacéuticos, médicos y estudios funcionales. Aunque muchos de los problemas que están conectados a la producción in vivo pueden ser eludidas mediante sistemas de expresión de células libres, en los enfoques in vitro para residuos específicos solamente han sido poco explorado. Se ha informado de la incorporación de residuos específicos libre de células de un análogo de L-triptófano 29 y 30 NCAA múltiple. Estos métodos se basan en la altamente efficient T7 RNA polimerasa. La ARN polimerasa de T7 implica la transcripción del bacteriófago similar, reduciendo así la funcionalidad genética en comparación con la transcripción endógena. La incorporación de residuos específica completa de Can en una proteína modelo en todas las posiciones Arg se informó recientemente de 31, utilizando un sistema de expresión libre de células 32. Una ligera modificación del mismo sistema permitió la incorporación específica de sitio de diferentes análogos de pyrrolysine en un modelo de proteína a través de la supresión codón de parada 33. El sistema 31 de células libres de empleado - 33 se basa en un todo E. sistema de transcripción-traducción coli. Sin embargo, se permite la expresión de proteínas tan eficientemente como en los sistemas de bacteriófagos de corriente (0,5 a 1 mg / ml de proteína recombinante) 32, al tiempo que conserva gran parte de la modularidad de transcripción-traducción original. En este trabajo, un protocolo detallado se proporciona en la forma en la resid-ue la incorporación específica de NCAA se puede realizar, utilizando todo esto E. sistema libre de células coli 32. Además, se proponen nuevas medidas para preparar las proteínas expresadas para una evaluación apropiada a través de espectroscopia de masas HPLC-ESI. Para expandir las propiedades de este sistema libre de células, este trabajo no sólo se refiere a la incorporación de Can publicada el 31 sino que también presenta nuevos datos relacionados con la no canónica de L-lisina análogo L-hidroxi-lisina. El siguiente protocolo para la incorporación de residuos específicos de la NCAA es una adaptación de un protocolo publicado recientemente en JoVe 34. Este último protocolo describe cómo llevar a cabo la expresión libre de células altamente eficiente con aminoácidos estándar. Además, se presenta la preparación del extracto libre de células en bruto, la solución de aminoácidos, la solución de energía stock y la memoria intermedia de energía usada en este enfoque. El siguiente protocolo se centra en pasos modificados en comparación con el anterior protocolo con el fin de permitir la incorporación de residuos específicos de la NCAA. Se recomiendan pipetas calibradas, puntas de pipeta bajo vinculante y tubos de microcentrífuga para la preparación. En lo que sigue, se usan las abreviaturas de la IUPAC para los aminoácidos.

<table><tbody><tr><td>Gafas de protección</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo (talla S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td></td><td>Z768960 Números de catálogo otras tallas: Z768979 para M, Z768987 para L y Z768995 para XL</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Suiza</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>Microespátula (L 6 5/8 pulg., acero inoxidable, diámetro de la varilla 0,09 pulg.)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU</td>. <td>C9758</td><td>Toxicidad aguda: use protectores oculares, máscara contra el polvo, guantes protectores</td></tr><tr><td>Hidroxilisina (mezcla racémica)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Guantes criogénicos (talla S, resistentes al agua)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU</td>. <td>Z183490</td><td>Números de catálogo otros tamaños: Z183512 para M, Z183520 para L y Z183539 para XL</td></tr><tr><td>RTS Muestreador de aminoácidos</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Alemania</td><td>BR1401801</td><td>Para la preparación casera de soluciones madre de aminoácidos, siga este protocolo35 y utilice el kit de aminoácidos sólidos LAA21-1KT, L-prolina (81709-25G), L-cisteína (30089-25G), L-histidina (53319-25G) y L-lisina (L5501-5G)&nbsp; (todos de Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, EE. UU</td>. <td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, EE. UU</td>. <td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, EE. UU.</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>ARNt (de E. coli, tamaño del paquete 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>10109541001</td><td>El número de catálogo para el tamaño del paquete de 500 mg es</td></tr><tr><td>10109550001 CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (de levadura)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, EE. UU</td>. <td>Plásmido #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Geles prefabricados de Tris-Glycine (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 hileras)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemania</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS Tampón de ejecución (10 x concentrado, 5.000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemania</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS tampón de carga (2 x concentrado, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemania</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteínas sin teñir, amplio rango (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, EE. UU.</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1060091011</td><td>Tóxico por inhalación, en contacto con la piel y en caso de ingestión: use guantes protectores y trabaje debajo de la campana extractora</td></tr><tr><td>Ácido acético (99,8%)</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemania</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Protein Miniprep kit</td><td>Zymo Research Europe, Friburgo, Alemania</td><td>P2002</td><td>El producto también distribuido por Zymo Research Corporation, Irvine, EE. UU.</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>glicerol, 99 %</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemania</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>Minicolumnas de centrifugación CentriPure Z25</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Alemania</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador 5301</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, EE. UU.</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, EE. UU</td>. <td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos para batir perlas (microviales de polipropileno)</td><td>Biospec, Bartlesville, EE. UU</td>. <td>522S</td><td></td></tr><tr><td>Perlas, 0.1&nbsp; mm de diámetro.</td><td>Biospec, Bartlesville, EE. UU.</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli cepa</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA protein assay kit</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas, 1.5&nbsp; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de cromatografía Micro Bio-Spin</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Placas inferiores ópticas de 384 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de sellado Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, EE. UU.</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Solución dibásica de fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Solución monobásica de fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Casetes de diálisis Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU</td>. <td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; Botella centrífuga L</td><td>Beckman-Coulter, Brea, EE. UU</td>. <td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; Matraz L Erlenmeyer</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), EE. UU</td>. <td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-26XP</td><td>Beckman-Coulter, Brea, EE. UU</td><td></td><td>. 393127 O centrífuga equivalente capaz de centrifugar botellas de 1 L.</td></tr><tr><td>Agitador orbital Forma 480</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>480</td><td>O equivalente agitador capaz de agitar el tamaño del pecho de 6 x 4 L .</td></tr><tr><td>Rotor JLA-8.1000</td><td>Beckman-Coulter, Brea, EE. UU</td>. <td>363688</td><td>O rotor equivalente de 5.000 x g para la centrífuga de arriba, capaz de centrifugar botellas de 1 L.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, EE. UU.</td><td>Microcentrífuga refrigerada 3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R</td><td>Beckman-Coulter, Brea, EE. UU.</td><td>368831</td><td>O centrífuga equivalente capaz de centrifugar tubos de reacción de 2 ml.</td></tr><tr><td>Bloque calefactor HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Alemania</td><td>24465</td><td>O bloque calefactor equivalente capaz de calentar muestras en tubos de reacción hasta 100 °C.</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf MiniSpin</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>5452000018</td><td>O centrífuga equivalente capaz de centrifugar tubos de reacción de 2 ml.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (diámetro del vibrador orbital de 4 mm, 0 - 2.500 rpm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>Z654760</td><td>O vórtice equivalente.</td></tr><tr><td>Máquina de copos de hielo Scotsman AF103</td><td>K&auml; lte-Berlin, Berlín, Alemania</td><td>AF103</td><td>O máquina de copos de hielo equivalente.</td></tr><tr><td>Mini incubadora digital MyTemp</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>Z763314</td><td>O incubadora equivalente capaz de calentar muestras a 29 & C.</td></tr><tr><td>Célula / cámara de electroforesis EcoCell</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemania</td><td>AN12005</td><td>O cámara de electroforesis equivalente capaz de realizar electroforesis en gel vertical con los geles prefabricados anteriores u otros geles utilizados.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación Power-phor para célula / cámara de electroforesis</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemania</td><td>AN12001</td><td>O una fuente de alimentación equivalente capaz de suministrar la celda/cámara de electroforesis por encima de la usada con potencia</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic de alto rendimiento Pipetas de volumen variable de un solo canal 1</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemania</td><td>613-5278</td><td>O micropipetas equivalentes que permiten pipetear volúmenes similares con la misma precisión</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemania</td><td>613-5279</td><td>O micropipetas equivalentes que permiten pipetear volúmenes similares con la misma precisión</td></tr><tr><td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, EE. UU.</td><td>F171101</td><td>O puntas de pipeta equivalentes de baja ligereza que permiten pipetear volúmenes similares con la misma precisión</td></tr><tr><td>Puntas Pipetman Diamond D200ST (2 - 200 &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, EE. UU.</td><td>F171301</td><td>O puntas de pipeta equivalentes de baja ligereza que permiten pipetear volúmenes similares con la misma precisión</td></tr><tr><td>Puntas Pipetman Diamond D1000ST (100 - 1.000&nbsp; y micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, EE. UU.</td><td>F171501</td><td>O puntas de pipeta equivalentes de baja ligereza que permiten pipetear volúmenes similares con la misma precisión</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml con tapones de rosca (estériles)</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemania</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml con tapones de rosca (estériles)</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemania</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 14 ml (fondo redondo, tapón de ventilación de dos posiciones, estéril)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Columna de HPLC Discovery BIO Wide Pore C5 (3 &micro; m tamaño de partícula, L x D.I. 10 cm x 2,1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de HPLC Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU</td>. <td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Serie 6500 Tiempo de vuelo de cuadrupolo de masa precisa (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU</td>. <td></td> G6530BA <td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Alemania</td><td>415-101</td><td>O un lector de microplacas equivalente capaz de medir la fluorescencia de la proteína modelo expresada</td></tr><tr><td>Medidor de pH Hanna Checker</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. Z351091</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aditivo eluyente de ácido fórmico para LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

la incorporación de residuos específicos de no canónicos aminoácidos en las proteínas modelo usando una<em&gt; escherichia coli</em&gt; sistema de transcripción-traducción libre de células

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

El conjunto canónico de aminoácidos da lugar a una gama excepcionalmente amplia de la funcionalidad de la proteína. Sin embargo, el conjunto de residuos sigue imponiendo limitaciones a las aplicaciones potenciales de proteína. La incorporación de aminoácidos no canónicos puede ampliar este ámbito. Hay dos enfoques complementarios para la incorporación de aminoácidos no canónicos. Para la incorporación específica de sitio, además de los mecanismos de traslación canónicas endógenos, un par ortogonal aminoacil-tRNA-sintetasa-ARNt debe ser siempre que no interactúa con los canónicos. En consecuencia, un codón que no está asignado a un ácido amino canónica, por lo general un codón de parada, también se requiere. Esta expansión código genético permite la incorporación de un aminoácido no canónico en un único, sitio dado dentro de la proteína. El trabajo aquí presentado describe la incorporación de residuos específico en el que el código genético es reasignado dentro del sistema de traslación endógeno. La maquinaria de traducción de unaccepts el aminoácido no canónica como un sustituto para incorporarlo en lugares prescritos canónicamente, es decir, todas las ocurrencias de un aminoácido en la proteína canónica se sustituyen por la no canónica. La incorporación de aminoácidos no canónicos puede cambiar la estructura de la proteína, haciendo que las propiedades físicas y químicas modificadas considerablemente. Análogos de aminoácidos no canónicos a menudo actúan como inhibidores del crecimiento celular para huéspedes de expresión, ya que modifican las proteínas endógenas, lo que limita en la producción de proteínas in vivo. In vivo la incorporación de aminoácidos no canónicos tóxicos en proteínas sigue siendo particularmente difícil. A continuación, se presenta un enfoque libre de células para un reemplazo completo de la L-arginina por la no canónica aminoácido L-canavanina. Elude las dificultades inherentes a la expresión in vivo. Además, se incluye un protocolo para preparar proteínas diana para el análisis espectral de masas. Se muestra que la L-lisina se puede sustituir por hidroxi-L-lisina,aunque con menor eficiencia. En principio, cualquier análogo de aminoácido no canónica puede incorporarse utilizando el método presentado, siempre y cuando el sistema de traducción in vitro endógena reconoce.

Este protocolo de guía a través de la incorporación de residuos específicos de células libres de la NCAA en proteínas modelo. Propone SDS-PAGE para una evaluación preliminar del experimento incorporación y nuevas medidas para preparar las proteínas modelo para un análisis espectroscópico de masas HPLC-ESI apropiado. Aquí, se presentan resultados representativos de la incorporación de residuos específica libre de células del análogo Arg Puede, así como la Lys analógico L-hidroxi-lisina (Hyl). Las soluciones de aminoácidos diferentes, la memoria intermedia de energía, el ADN que codifica para la proteína de vector modelo y las reacciones libres de células se preparan como se ha descrito anteriormente. La reacción libre de células de referencia está provisto de la solución de aminoácidos que consiste en los 20 Caas. Para cada experimento, una reacción libre de células de control negativo se suministra con la solución de aminoácidos que carece de la analógica canónica de la NCAA en cuestión. Para cada aproach, una reacción libre de células expresa la proteína modelo en presencia de la solución de aminoácidos, en el que el CAA se sustituye por el análogo no canónica. Su-etiqueta de purificación, intercambio de tampón y el análisis de espectrometría de masas HPLC-ESI se ejecutan de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. La proteína es el modelo C-terminal marcado con His deGFP 32, una versión truncada de EGFP 53. Su secuencia de aminoácidos de una letra se puede encontrar en (material suplementario 2). Esta proteína modelo contiene 6 Arg y Lys 18 posiciones, respectivamente. El vector de expresión es pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. En el caso de la incorporación completa de la NCAA, se puede suponer que la reacción del control negativo no expresa deGFP, ya que uno de los 20 Caas no se encuentra. Contrariamente, deGFP debe ser detectable en los otros dos reacciones: la nativa en el referencia de reacción libre de células y la proteína modificada en la reacción libre de células que se proporciona con la NCAA. La Figura 1A muestra la evaluación preliminar SDS-PAGE del experimento incorporación Can. La reacción libre de células de referencia tiene el nivel más alto de expresión deGFP. En la reacción libre de células que se proporciona con Can, deGFP se expresa a una concentración ligeramente inferior. No expresión deGFP puede ser detectado en el control negativo. Este resultado SDS-PAGE es una buena indicación para una incorporación exitosa de Can en el deGFP proteína diana. Para probar la hipótesis de la incorporación completa de Can en deGFP, ambas proteínas purificadas modelo, visualizadas en la Figura 1B, se analizó a través de espectroscopía de masas HPLC-ESI. La Figura 1C muestra el espectro de masas de las moléculas deconvoluted deGFP purificados. La masa de deconvoluted DEGF<html> P que se expresa en la reacción libre de células de referencia es 26,192.8 Da. Para deGFP expresado en el que puede contener reacción libre de células aparece una masa de 26.202,5 ​​Da. Las masas esperadas para la deGFP6Arg nativa y la deGFP6Can modificado con Arg ser totalmente reemplazados por Can son 26.193 Da y 26.204 Da, respectivamente. La diferencia de masa de 1,5 Da para deGFP6Can está dentro del error de la deconvolución del espectro. Por lo tanto, se confirma la plena incorporación de lata en deGFP en todas las posiciones 6 Arg. Los dos picos de intensidad reducida corresponden a la deGFP6Arg nativos y modificados deGFP6Can que no alcanzan su madurez fluoróforo. El fluoróforo se genera autocatalíticamente por la eliminación de una molécula de H 2 O, seguido de oxidación. Esto conduce a un aumento de la masa de 20 Da si este proceso no continúa. pg &quot;/&gt; Figura 1. Evaluación de SDS-PAGE del experimento puede incorporación y espectroscopia de masas HPLC-ESI de las moléculas deGFP expresadas y purificadas libres de células. (A) Evaluación preliminar del experimento puede incorporación utilizando SDS-PAGE. De izquierda a derecha: estándar de proteínas, reacción libre de células de referencia, control negativo y la reacción libre de células proporcionando puede en lugar de Arg. (B) SDS-PAGE después de Su-etiqueta de purificación y de intercambio de tampón de las moléculas expresadas deGFP. De izquierda a derecha: estándar de proteínas, deGFP purificada a partir de la reacción de referencia, purificado deGFP de la reacción que contiene Can. (C) La confirmación de la plena incorporación de Can mediante espectroscopía de masas HPLC-ESI. Las masas esperadas del deGFP nativa y la deGFP modificado con Arg totalmente reemplazados por Can son 26.193 Da y 26.204 Da, respectivamente. Cada espectro se normalizó a su más alta intensidad (recuento). posiciones de los picos se indicanen Da. Para fines de visualización, los carriles de gel se extraen de las imágenes de gel, unidos entre sí, se convierten en formato de escala de grises, el tamaño está optimizado y el contraste, así como el brillo se mejoran. Líneas de gel originales se presentan en el material suplementario 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La Figura 2A muestra la evaluación preliminar SDS-PAGE del experimento incorporación Hyl. En la reacción libre de células que se proporciona con Hyl, deGFP se expresa. Contrariamente a la primera experimento, una banda deGFP débil se puede observar en la reacción de control negativo. Esto podría ser debido a los residuos de Lys en las reacciones libres de células. Esto permite una expresión deGFP débil en la reacción de control negativo, donde se añaden ni Lys ni Hyl. Para H<html> Espectroscopía de masas ESI-PLC, las moléculas deGFP de la reacción libre de células provistas de Hyl se purifican y se intercambia el tampón (Figura 2B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Figura 2. Evaluación de SDS-PAGE del experimento de incorporación Hyl (A) De izquierda a derecha:. Reacción libre de células de control negativo, la reacción libre de células que contiene Hyl y el nivel de proteínas. (B) SDS-PAGE después de Su-etiqueta de purificación y de intercambio de tampón de las moléculas expresadas deGFP. De izquierda a derecha: deGFP purificada de la Hyl reacción y que contiene proteína estándar. Para fines de visualización, los carriles de gel se extraen de las imágenes de gel, unidos entre sí, se convierten en formato de escala de grises, el tamaño está optimizado y el contraste, así como el brillo se mejoran. líneas de gel originales se presentan en el material complementario 3.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La Figura 3 muestra el espectro de masas de moléculas deconvoluted deGFP purificados. Figura 3A confirma la hipótesis de que ya están presentes residuos de Lys en las reacciones libres de células. El pico predominante del espectro corresponde a la nativa (masa esperada: 26193 Da) deGFP. Una vez más, las moléculas de deGFP de un 20 Da mayor masa que no desarrollan su fluoróforo pueden ser detectados. Los residuos de Lys se cargan preferentemente en el tRNA Lys por lisil-tRNA-sintetasa que conduce a un alto nivel de expresión de los deGFP18Lys nativas. La diferencia de masa entre Hyl y Lys es 16 Da. Debido a la presencia de Hyl que está en competencia a los residuos de Lys se generan todas las posibles especies deGFP (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (Figura 3B). Es cierto, el pico de deGFP1Hyl + 17Lys se solapa con el pico de la deGFP nativo que no produjo su fluoróforo (Figura 3A) y la masa de algunos picos difiere más de 2 Da de la masa esperada. Estas diferencias de masa se pueden atribuir a la alta ruido debido a pequeñas cantidades de las especies deGFP. Sin embargo, Hyl generalmente se incorpora en el sistema libre de células. Otras mejoras tienen que hacer para abolir residuos de Lys en las reacciones libres de células. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Figura 3. espectroscopia HPLC-ESI masa de las moléculas deGFP purificadas de la reacción libre de células que contiene Hyl (A) Los deGFP18Lys nativos se detecta predominantemente (masas esperados: con fluoróforo 26.193 Da, sin fluoróforo madura 26.213 Da). (B)Magnificación revela la existencia de todas las posibles especies deGFP (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Sus masas esperados son 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). El espectro se normalizó a su más alta intensidad (recuento). Posiciones de los picos se indican en Da. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> 1. Material de la plantilla suplementaria de cálculo. En la sección 2, la preparación de la mezcla maestra de amortiguación de energía se ejemplifica usando alícuotas de extracto crudo de 30 l y óptimo de Mg y K-concentraciones de glutamato de respectivamente 3 y 30 mm. En este ejemplo se lleva a un volumen de mezcla maestra que produce 3 alícuotas de amortiguamiento de energía. en secla 3, la preparación de la reacción libre de células se ejemplifica el uso de una solución 90 nM de ADN social que lleva a una concentración de ADN del vector óptimo de 10 nM en la reacción libre de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Para una trazabilidad adecuada, el uso de la plantilla de cálculo se ejemplifica mediante la inserción de estos valores típicos que difieren del ejemplo anterior: crudo de volumen de extracto: 28 l, óptima Mg-glutamato: 2 mm, óptimo K-glutamato: 40 mM, número de alícuotas de amortiguación deseadas: 100, concentración óptima de vectores en células libres de reacción: 8 nM, el ADN del vector stock solución: 150 nm. En primer lugar entrar en 28 l de volumen como extracto crudo en el campo de naranja de la primera sección de la plantilla. A continuación, entrar en la segunda sección de la plantilla de 2 mm de unad 40 mM como óptima de Mg y concentraciones de K-glutamato en los campos de color naranja. Teniendo en cuenta el Mg óptima y K-concentraciones, la composición de un tampón de energía 15 l, así como un correspondiente, ampliado alícuota 16 l se calcula. A continuación, en consecuencia introducir 100 como número deseado de alícuotas de amortiguación de energía (16 l). La plantilla se adapta a los volúmenes de los diferentes componentes del tampón para la mezcla maestra 1700 l como sigue: 204 l de solución madre 100 mM Mg-glutamato, 136 l de solución madre 3 M K-glutamato, 728.73 l de solución de energía 14x, 510 l de 40% de PEG-8000 y 121.27 l estéril ddH2O Por último, en la sección tercera plantilla, introduzca 8 nM y 150 nM como concentración óptima vector en la reacción libre de células y, respectivamente, el ADN vector concentración de la solución de stock. La plantilla se adapta a los volúmenes de los diferentes componentes que deben añadirse a los 28 l de extracto crudo para finalizar la preparación de un 90 lreacción libre de células como sigue: 15 l de tampón de energía, 15 l de una de las 3 soluciones de aminoácidos diferente compuestas, 4,80 l de solución de ADN del vector (150 nM) y 27.20 l de ddH estéril 2 O. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> El material suplementario 2. Una carta secuencia de aminoácidos de la proteína modelo deGFP. Esta proteína modelo contiene 6 Arg y Lys 18 posiciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Material suplementario 3. longitud y carriles de gel no modificados que corresponden a las imágenes de gel presentado completa la Figura 1 y 2. Las bandas de gel se presenta en cada uno s individuales<html> ubfigure se extraen de la misma en gel de poliacrilamida SDS. En la figura 1 y 2 estos carriles fueron unidas entre sí a efectos de presentación. Los pesos moleculares de las bandas de proteína estándar se indican al lado de las figuras. (A.1) carriles de gel Uncropped de la Figura 1A. De izquierda a derecha: estándar de proteínas, reacción libre de células de referencia, control negativo y la reacción libre de células proporcionando puede en lugar de Arg. (A.2) Uncropped líneas de gel de la figura 1B. De izquierda a derecha: estándar de proteínas, deGFP purificada a partir de la reacción de referencia, purificado deGFP de la reacción que contiene Can. (B.1) carriles de gel Uncropped de la Figura 2A. De izquierda a derecha: la reacción libre de células de control negativo, la reacción libre de células que contiene Hyl y el nivel de proteínas. (B.2) Uncropped líneas de gel de la Figura 2B. De izquierda a derecha: deGFP purificada de la Hyl reacción y que contiene proteína estándar.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se presenta un protocolo de expresión libre de células fácil de usar para la incorporación específica de residuos de análogos de aminoácidos no canónicos en proteínas, incluido el análisis posterior, para estudios médicos, farmacéuticos, estructurales y funcionales.

La incorporación de residuos específicos de no canónicos aminoácidos en las proteínas modelo usando una<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcripción-traducción libre de células

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

El objetivo general de este procedimiento es incorporar de manera específica por residuo análogos de aminoácidos no canónicos en proteínas modelo utilizando un sistema de expresión libre de células y proporcionar un análisis posterior. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología estructural, farmacéutica y médica, como el papel de los aminoácidos no canónicos en la estructura de las proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que, en ausencia de cualquier huésped vivo, se pueden incorporar aminoácidos tóxicos en proteínas modelo. Para comenzar el experimento, prepare soluciones stock completas de los 20 aminoácidos canónicos, o CAAs, y la solución stock de aminoácido no canónico, o ncAA, previamente preparada, a temperatura ambiente. Una vez que las soluciones se hayan descongelado, agítelas frecuentemente en vórtex para redisolver los aminoácidos precipitados y coloque los aminoácidos en hielo. A continuación, transfiera 1,4 mililitros de agua estéril doblemente destilada a un tubo cónico de 15 mililitros y colóquelo en hielo. Añada 175 microlitros de cada solución stock de aminoácidos, uno tras otro, y agite completamente el tubo en vórtex tras cada adición, volviendo a colocar la solución en hielo. Tras añadir todos los aminoácidos, agite completamente el tubo. Incube el tubo hasta que la solución sea lo más clara posible. Divida la mezcla maestra de aminoácidos en tres volúmenes iguales de 1,35 mililitros en tubos de reacción de 1,5 ml y manténgalos en hielo. Añada 50 microlitros de la solución stock de 168 milimolar del CAA que es análogo al ncAA al primer volumen dividido, para crear la solución de aminoácidos que contiene los 20 CAAs. Agite completamente la solución y luego devuelva el tubo al hielo. Aliquote la solución en tubos de reacción y etiquételos como más CAA. Congele rápidamente los alícuotas en nitrógeno líquido y almacénelos a menos 80 grados Celsius. A continuación, añada 50 microlitros de agua estéril doblemente destilada al segundo volumen dividido de la mezcla maestra de aminoácidos para preparar una mezcla de aminoácidos que contenga 19 CAAs, agite completamente la solución y luego colóquela en hielo. Aliquote la solución y etiquete los tubos como menos CAA. Finalmente, añada 50 microlitros de la solución stock de 168 milimolar del ncAA al último volumen de 1,35 mililitros, para preparar una mezcla de aminoácidos que contenga 19 CAAs y el ncAA. Agite completamente la mezcla y devuélvala al hielo. Aliquote, etiquete y congele los tubos. En hielo, descongele tres alícuotas de 30 microlitros de extracto crudo, una alícuota más CAA, una alícuota menos CAA y una alícuota de ncAA, tres alícuotas de tampón energético y la solución de ADN vectorial. Coloque agua estéril doblemente destilada en hielo. A continuación, añada 15 microlitros de tampón energético y pipetee arriba y abajo, y agite suavemente la solución en vórtex para mezclar. Añada 15 microlitros de la alícuota de solución de aminoácidos más CAA, 10 microlitros de solución de ADN vectorial de 90 nanomolar y 20 microlitros de agua estéril doblemente destilada a los 30 microlitros de extracto crudo. Prepare el control negativo añadiendo 15 microlitros de tampón energético, 15 microlitros de menos CAA, 10 microlitros de solución de ADN vectorial de 90 nanomolar y 20 microlitros de agua estéril doblemente destilada a los 30 microlitros de extracto crudo. Proceda con la reacción de ncAA combinando 15 microlitros de tampón energético, 15 microlitros de más ncAA, 10 microlitros de solución de ADN vectorial de 90 nanomolar y 20 microlitros de agua estéril doblemente destilada con los 30 microlitros de extracto crudo. Luego incube todos los tubos. Diez minutos antes de realizar el SDS-PAGE, diluya un microlitro de cada una de las reacciones viscosas libres de células en cuatro microlitros de agua estéril doblemente destilada en tubos de reacción. Agite completamente en vórtex y centrifugue brevemente los líquidos con una minicentrífuga. Añada cinco microlitros de tampón de carga 2X a los cinco microlitros de reacción libre de células diluida. Agite completamente en vórtex y centrifugue los líquidos con una minicentrífuga. Coloque los tubos de reacción en un bloque térmico y asegúrese de que las tapas estén bien cerradas. Mientras tanto, transfiera el tampón de corrida a la cámara de electroforesis en gel. Tras el calentamiento, centrifugue el líquido con una minicentrífuga. Tras la centrifugación, agite brevemente los tubos en vórtex y repita la centrifugación. Transfiera 15 microlitros de estándar de proteína y 10 microlitros de cada muestra a los pocillos y comience la electroforesis. Extraiga cuidadosamente el gel de la cubeta y fíjelo durante 30 minutos. Luego transfiera el gel a la solución de tinción durante 60 minutos. Tras la tinción, transfiera el gel a la solución de desentintado durante 60 a 120 minutos. Mezcle volúmenes iguales de tampón de unión a His y la reacción libre de células, y pipetee la mezcla arriba y abajo. Luego agite suavemente el tubo en vórtex. A continuación, ensamble el sistema de columna. Agite completamente en vórtex la solución stock del gel de afinidad a His hasta que la resina del gel esté completamente disuelta. Utilizando una punta de pipeta de un mililitro, transfiera 250 microlitros de resina de gel a la columna. Centrifugue la columna durante cinco a 10 segundos a 13 a 15.000 × g. Asegúrese de que la resina del gel se haya drenado completamente, luego transfiera 150 a 300 microlitros de la mezcla de reacción libre de células y tampón de unión a His a la columna. Centrifugue la columna. Descarte el flujo de salida y coloque la columna nuevamente en el tubo de recolección. Añada 250 microlitros de tampón de lavado con His, y golpee y agite suavemente la columna en vórtex para resuspender la resina del gel. Centrifugue el tubo de la columna. Descarte el tubo de recolección y coloque la columna en un nuevo tubo de reacción estándar de 1,5 mililitros. Añada 150 microlitros de tampón de elución y resuspenda la resina del gel mediante golpes y agitación suave en vórtex. Luego centrifugue la columna para diluir la proteína purificada en el tampón de elución. Primero retire la tapa inferior de la columna de filtración en gel y luego retire la tapa superior. Coloque la columna en un tubo de lavado de dos mililitros y centrifugue la columna para eliminar el tampón de almacenamiento del gel. Descarte el flujo de salida, luego añada hasta 400 microlitros del tampón de almacenamiento de proteína y centrifugue la columna. Repita este paso una vez para asegurarse de que todo el tampón de almacenamiento de proteína se cargue en el gel. Coloque la columna en un tubo de recolección nuevo y añada cuidadosamente hasta 100 microlitros de la solución de la proteína modelo purificada directamente al centro del lecho de gel. Centrifugue la columna. Tras el intercambio de tampón, coloque los 100 microlitros completos de la solución de proteína modelo en un tubo abierto dentro del concentrador de vacío giratorio. Cierre la tapa del concentrador e inicie la rotación a 30 grados Celsius. Este SDS-PAGE muestra la incorporación exitosa de L-canavanina, o Can, en la proteína diana deGFP, donde la reacción de referencia libre de células presenta el nivel más alto de expresión de deGFP. La reacción libre de células con Can produce una concentración ligeramente menor de deGFP, mientras que no se detecta expresión de deGFP en el control negativo. Se realizó un SDS-PAGE tras la purificación con etiqueta His y el intercambio de tampón de las moléculas de deGFP expresadas. HPLC

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Investigación

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Biología

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