La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

El objetivo general de este experimento es diferenciar células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos con alta eficiencia y reproducibilidad. Este protocolo puede ampliarse en un biorreactor o modificarse para diferenciar líneas celulares que son sensibles al cultivo de células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la modelización de enfermedades cardíacas utilizando células madre pluripotentes inducidas humanas.

Las principales ventajas de esta técnica son que es rentable y tiene alta eficiencia, reproducibilidad y aplicabilidad tanto para células madre embrionarias humanas como para células pluripotentes inducidas. Nuestra demostradora de hoy es Hananeh Fonoudi, actual estudiante de doctorado en el Instituto de Investigación Cardíaca Victor Chang, quien nos llega desde el Instituto Royan. Antes del recubrimiento, utilice un cepillo de limpieza y agua destilada para eliminar completamente cualquier polvo o residuo de cultivo de un matraz agitador de 100 mililitros con péndulo de vidrio.

A continuación, llene el matraz con etanol al 70%. Después de 30 minutos, enjuague el matraz con agua destilada y llénelo con hidróxido de sodio cinco molar. A la mañana siguiente, enjuague el matraz con agua corriente durante cinco minutos y llénelo con ácido clorhídrico uno molar.

Después de 15 minutos, enjuague el matraz con agua corriente durante otros cinco minutos, seguido de dos enjuagues con agua doblemente destilada. Coloque el matraz en una cabina de seguridad biológica para que se seque. Luego, agregue 1,5 mililitros de solución siliconante al matraz y rote el matraz horizontalmente para cubrir todas las superficies con silicona.

Caliente el matraz recubierto en una estufa seca durante una hora a 100 grados Celsius. Una vez que el matraz se haya enfriado, enjuáguelo tres veces durante 15 minutos con agua desionizada. Luego, esterilice el recipiente en autoclave a 121 grados Celsius durante 20 minutos.

Después de realizar el pase de esferoides no diferenciados mediante el método de pase celular individual al menos tres veces, utilice una pipeta de cinco mililitros para transferir todos los esferoides no diferenciados a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los pocillos con un mililitro de medio de células madre embrionarias humanas para recoger cualquier esferoide restante y combine el lavado con los esferoides recolectados. Deje sedimentar los esferoides durante cinco minutos para formar un sedimento suelto.

A continuación, aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no eliminar ningún esferoide. Luego, lave los esferoides con un mililitro de PBS durante cinco minutos e incúbelos en 5 mililitros de tripsina-EDTA a 37 grados Celsius. Después de cuatro a cinco minutos, detenga la reacción con un mililitro de medio para células madre embrionarias humanas y utilice una pipeta P1000 para disociar los esferoides en una suspensión de células individuales.

Después de contar mediante exclusión con azul de tripano, resuspenda las células a una concentración de 200.000 células por mililitro en medio condicionado suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico e inhibidor de ROCK, y transfiera 100 mililitros de la suspensión celular al matraz biorreactor siliconado. Coloque el matraz en el agitador a 35 RPM. Después de 24 horas, aumente la agitación a 40 RPM.

Después de 48 horas, detenga la agitación durante cinco a diez minutos hasta que todos los esferoides reformados se hayan sedimentado en el fondo del matraz, y reemplace la mitad del medio con medio condicionado suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico. Luego, reinicie el agitador a 40 RPM durante otras 24 horas, reemplazando la mitad del medio mediante el mismo procedimiento cada día durante los tres días siguientes. Al quinto día, detenga el agitador durante cinco a diez minutos.

Luego, transfiera todos los esferoides a un tubo de 50 mililitros con 50 mililitros de medio o menos. Deseche cualquier medio restante en el matraz, teniendo cuidado de que no queden esferoides en el recipiente. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante de los esferoides sedimentados y lave los agregados celulares con 25 mililitros de PBS con calcio y magnesio.

Después de cinco a diez minutos, retire la solución de lavado y resuspenda los esferoides en 40 mililitros de medio RPMI-B27 suplementado con inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3, inhibidor de ROCK y alcohol polivinílico. Transfiera todos los esferoides nuevamente al matraz del biorreactor. Luego, agregue medio RPMI-B27 fresco hasta un volumen total de 100 mililitros y reinicie la agitación a 40 RPM.

Después de 24 horas, siga el mismo procedimiento para cambiar el medio por medio RPMI-B27. Después de otras 24 horas, siga el mismo procedimiento y cambie el medio por RPMI-B27 con IWP2, purmorfanina y SB43. Incube durante 48 horas.

El primer latido generalmente se observa después de siete días. Para la diferenciación rápida de líneas de células madre pluripotentes humanas que no han sido adaptadas al cultivo de células individuales, trate primero un cultivo de células madre pluripotentes humanas con una confluencia del 70 al 80 %, crecido sobre células de fibroblastos embrionarios de ratón, con 5 mililitros de solución de disociación durante 30 a 60 segundos. La solución de disociación debe dejarse únicamente hasta que las MEF se redondeen y los bordes de las colonias de hPSC se vuelvan visibles.

Si las células se dejan demasiado tiempo, no se diferenciarán correctamente. En el momento adecuado, reemplace rápidamente la solución de disociación con 75 mililitros de colagenasa tipo IV y incube las células durante cinco a 15 minutos a 37 grados Celsius, revisando el cultivo bajo el microscopio cada pocos minutos. Cuando comiencen a desprenderse colonias completas, sustituya la colagenasa por 1,5 mililitros de medio para células madre embrionarias humanas y utilice una pipeta P1000 para desprender suavemente colonias completas de células del fondo de la placa.

Las células deben separarse cuidadosamente para que las colonias no se rompan en fragmentos pequeños. Luego, utilice una pipeta de cinco mililitros para transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros y lave los pocillos con un mililitro de medio para células madre embrionarias humanas, recogiendo cualquier célula restante en el tubo de 15 mililitros. Después de cinco minutos de sedimentación, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con dos mililitros de medio fresco para células madre embrionarias humanas suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico.

Utilizando una nueva pipeta de cinco mililitros, transfiera las células a una placa de adherencia ultra baja y incube los colonias durante seis a 12 horas. Al final de la incubación, use una pipeta de cinco mililitros para transferir cuidadosamente los agregados de colonias a un nuevo tubo de 15 mililitros y recolecte cualquier agregado restante con un lavado de medio RPMI-B27. Una vez que las colonias se hayan sedimentado, reemplace el sobrenadante con medio RPMI-B27 fresco suplementado con inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3, y transfiera cuidadosamente las colonias a placas recubiertas con laminina para su adherencia a 37 grados Celsius.

Después de 24 horas, cambie el medio por medio RPMI-B27. Después de otras 24 horas, cambie el medio por RPMI-B27 que contenga IWP2, purmorfanina y SB43. Generalmente, los primeros latidos se observan después de siete días.

Hasta la fecha, el protocolo de diferenciación por suspensión estática se ha probado en cinco líneas de células madre embrionarias humanas y cuatro líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas, obteniéndose más del 90 % de esferoides latientes a partir de cada línea, lo que demuestra la alta reproducibilidad de este protocolo entre diferentes líneas de células madre pluripotentes humanas. Los esferoides en diferenciación muestran un comportamiento similar en un entorno de biorreactor de suspensión agitada que en el sistema estático, observándose que aproximadamente el 100 % de los esferoides laten al día 10. De hecho, secciones de esferoides latientes recolectadas al día 30 revelan la expresión citoplasmática y nuclear de la troponina T cardíaca y del factor de transcripción cardíaco NKX2.5, respectivamente.

Además, cuando los esferoides indiferenciados se reemplazan por agregados celulares indiferenciados, aparecen grupos latientes siete días después de la diferenciación. Con 42 líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas evaluadas, generando en promedio más del 60 % de poblaciones celulares positivas para troponina T cardíaca para el día 15. Los grupos latientes también muestran una expresión citoplasmática similar de troponina T cardíaca y nuclear de NKX2.5, como se observó en los esferoides generados en biorreactores de suspensión agitada.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar el uso de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) que hayan sido adaptadas al cultivo de células individuales durante al menos tres pases previos a la diferenciación en el biorreactor. Este procedimiento puede combinarse con otros métodos para enriquecer cardiomiocitos y obtener una población pura de células. Esta técnica ha allanado el camino para la comercialización de cardiomiocitos derivados de hPSCs.

Tiene potencial para su uso en aplicaciones clínicas, farmacéuticas, de ingeniería de tejidos y de desarrollo de órganos u organoides. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar eficientemente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos y cómo escalar el cultivo en un biorreactor.