La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

El objetivo general de este experimento es diferenciar células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos con alta eficiencia y reproducibilidad. Este protocolo puede ampliarse en un biorreactor o modificarse para diferenciar líneas celulares, que son sensibles al cultivo de una sola célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el modelado de enfermedades cardíacas utilizando células madre pluripotentes inducidas humanas.

Las principales ventajas de esta técnica son que es rentable y tiene una alta eficiencia, reproducibilidad y aplicabilidad tanto para células madre embrionarias humanas como pluripotentes inducidas. Nuestra demostradora de hoy es Hananeh Fonoudi, actualmente estudiante de doctorado en el Instituto de Investigación Cardíaca Victor Chang, procedente del Instituto Royan. Antes de recubrir, use un cepillo de limpieza y agua destilada para eliminar completamente cualquier polvo o residuo de cultivo de un matraz giratorio de 100 mililitros con un péndulo de vidrio.

A continuación, llene el matraz con etanol al 70%. Después de 30 minutos, enjuague el matraz con agua destilada y llénelo con hidróxido de sodio de cinco molares. A la mañana siguiente, enjuague el flash con agua corriente durante cinco minutos y llénelo con un molar de ácido clorhídrico.

Después de 15 minutos, enjuague el matraz con agua corriente durante otros cinco minutos, seguido de dos enjuagues con agua bidestilada. Coloque el matraz en una cabina de bioseguridad para que se seque. A continuación, añada 1,5 mililitros de solución siliconante al matraz y gire el matraz horizontalmente para cubrir todas las superficies con silicona.

Calentar el matraz recubierto en un horno seco durante una hora a 100 grados centígrados. Cuando el matraz se haya enfriado, enjuáguelo tres veces durante 15 minutos con agua desionizada. Luego, esterilize el recipiente en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos.

Después de pasar esferoides indiferenciados, utilizando el método de paso de celda única al menos tres veces, use una pipeta de cinco mililitros para transferir todos los esferoides indiferenciados a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los pocillos con un mililitro de medio de células madre embrionarias humanas para recolectar los esferoides restantes y combine el lavado con los esferoides recolectados. Deje que los esferoides se sedimenten durante cinco minutos para formar una bolita suelta.

A continuación, aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no eliminar ningún esferoide. A continuación, enjuague los esferoides con un mililitro de PBS durante cinco minutos e incube en 5 mililitros de tripsina EDTA a 37 grados centígrados. Después de cuatro o cinco minutos, detenga la reacción con un mililitro de medio de células madre embrionarias humanas y use una pipeta P1000 para disociar los esferoides en una suspensión de una sola célula.

Después del recuento por exclusión de azul de tripano, resuspenda las células a una concentración de 200.000 células por mililitro, en medio acondicionado suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico e inhibidor de ROCK, y transfiera 100 mililitros de la suspensión celular al matraz de biorreactor siliconado. Coloque el matraz en el agitador a 35 RPM. Después de 24 horas, aumente la agitación a 40 RPM.

Después de 48 horas, detenga la agitación durante cinco a diez minutos hasta que todos los esferoides reformados se hayan asentado en el fondo del matraz y reemplace la mitad del medio con medio acondicionado suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico. Luego, reinicie el agitador a 40 RPM durante otras 24 horas, reemplazando la mitad del medio por el mismo proceso todos los días durante los próximos tres días. Al quinto día, detenga el agitador durante cinco a diez minutos.

Luego, transfiera todos los esferoides a un tubo de 50 mililitros en 50 mililitros de medio o menos. Deseche el medio restante en el matraz, teniendo cuidado de que no queden esferoides en el recipiente. Luego, retire con cuidado el sobrenadante de los esferoides sedimentados y lave los grupos de células en 25 mililitros de PBS con calcio y magnesio.

Después de cinco a diez minutos, retire el lavado y vuelva a suspender los esferoides en 40 mililitros de medio RPMI-B27 suplementado con inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3, inhibidor de ROCK y alcohol polivinílico. Transfiera todos los esferoides de nuevo al matraz del biorreactor. Luego, agregue medio RPMI-B27 nuevo hasta un volumen total de 100 mililitros y reinicie la agitación a 40 RPM.

Después de 24 horas, siga el mismo proceso para cambiar el medio del medio RPMI-B27. Después de 24 horas adicionales, siga el mismo proceso y cambie el medio con RPMI-B27 más IWP2, purmorfamina y SB43. Dejar actuar durante 48 horas.

El primer latido suele observarse a los siete días. Para la diferenciación rápida de líneas de células madre pluripotentes humanas que no se han adaptado al cultivo de una sola célula, primero se debe tratar con un 70 a 80% de cultivo de células madre pluripotentes humanas confluentes, cultivadas en células de fibroblastos embrionarios de ratón, con 5 mililitros de solución de disociación durante 30 a 60 segundos. La solución de disociación solo debe dejarse hasta que los MEFs se redondeen y los bordes de las colonias de hPSC se aclaren.

Si las células se dejan demasiado tiempo, no se diferenciarán correctamente. En el momento adecuado, reemplace rápidamente la solución de disociación con 75 mililitros de colagenasa tipo IV e incube las células durante cinco a 15 minutos a 37 grados Celsius, verificando el cultivo bajo el microscopio cada pocos minutos. Cuando las colonias enteras comiencen a desprenderse, reemplace la colagenasa con 1,5 mililitros de medio de células madre embrionarias humanas y use una pipeta P1000 para separar suavemente las colonias de células enteras del fondo de la placa.

Las celdas deben separarse con cuidado para que las colonias no se rompan en pedazos pequeños. Luego, use una pipeta de cinco mililitros para transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros y lave los pocillos con un mililitro de medio de células madre embrionarias humanas, agrupando las células restantes en el tubo de 15 mililitros. Después de cinco minutos de sedimentación, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con dos mililitros de medio de células madre embrionarias humanas frescas suplementadas con factor de crecimiento básico de fibroblastos.

Con una nueva pipeta de cinco mililitros, transfiera las células a una placa de fijación ultra baja e incube las colonias durante seis a 12 horas. Al final de la incubación, use una pipeta de cinco mililitros para transferir cuidadosamente los agregados de la colonia a un nuevo tubo de 15 mililitros y recoja los agregados restantes con un lavado medio RPMI-B27. Cuando las colonias se hayan asentado, reemplace el sobrenadante con medio RPMI-B27 fresco suplementado con el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3 y transfiera cuidadosamente las colonias a placas recubiertas de laminina para su fijación a 37 grados Celsius.

Después de 24 horas, cambie el medio por el medio RPMI-B27. Después de otras 24 horas, cambie el medio con RPMI-B27 que contenga IWP2, purmorfamina y SB43. El primer latido suele observarse a los siete días.

Hasta la fecha, el protocolo de diferenciación de suspensión estática se ha probado en cinco líneas de células madre embrionarias humanas y cuatro líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas, lo que da como resultado más del 90% de los esferoides de cada línea, lo que demuestra la alta reproducibilidad de este protocolo entre diferentes líneas de células madre pluripotentes humanas. Los esferoides diferenciadores exhiben un comportamiento similar en un entorno de biorreactor de suspensión agitado que en el sistema estático, con aproximadamente el 100% de los esferoides observados al batir en el día 10. De hecho, las secciones de esferoides latiendo recogidas en el día 30 revelan la expresión citoplasmática y nuclear de la troponina T cardíaca y del factor de transcripción cardíaco NKX2.5 respectivamente.

Además, cuando los esferoides indiferenciados se reemplazan con agregados celulares indiferenciados, aparecen grupos batientes siete días después de la diferenciación. Con 42 líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas probadas, generando en promedio más del 60% de las poblaciones de células T positivas para la troponina T cardíaca a los 15 días. Los grupos de batido también demuestran una expresión citoplasmática de troponina T cardíaca y NKX2.5 similar a la observada para los esferoides generados por el biorreactor de suspensión agitada.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se deben utilizar hPSC que se hayan adaptado al cultivo de una sola célula durante al menos tres pasos antes de la diferenciación en el biorreactor. Este procedimiento se puede combinar con otros métodos para enriquecer los cardiomiocitos para adquirir una población pura de células. Esta técnica ha allanado el camino para la comercialización de cardiomiocitos derivados de hPSC.

Tiene el potencial de uso en aplicaciones clínicas, farmacéuticas, de ingeniería de tejidos y de desarrollo de órganos u organoides. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar de manera eficiente las células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos y escalar el cultivo en el biorreactor.