Name: In vitro de permeación de ferritinas cargados con FITC través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas Nanoformulated (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a estudiar la permeación de moléculas fluorescentes nanoformuladas a través de la barrera hematoencefálica usando ferritinas cargadas con FITC en un modelo in vitro con células endoteliales y astrocitos de rata.

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Los autores agradecen a Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia y Sacco Hospital (Proyecto NanoMeDia) por la financiación de la investigación.

1. Establecer el modelo de acreditación Nota: Para establecer el modelo de acreditación sugerimos usar RBMECs primarias disponibles comercialmente y ARC. Todos los pasos deben realizarse con reactivos y material desechable estéril, que se manejan en una campana de flujo laminar. <ol><li> Cultivo de células <ol><li> Escudo frascos de cultivo celular con poli-L-lisina 100 mg / ml (1 hora a temperatura ambiente) o fibronectina 50 mg / ml (1 hora a 37 ° C) para promover la unión de las ARC o RBMECs, respectivamente. Entonces, deshielo 1 x 10 6 ARC y 5 x 10 5 RBMECs en medio de células endoteliales, suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de suplemento de crecimiento de células endoteliales y 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCA de semillas en un matraz T175 en 20 ml SecM y RBMECs en un matraz T75 en 10 ml SecM. Nota: La descongelación y pasajes de siembra de ARC y RBMECs deben ajustarse, en términos de densidad de células y el tiempo en cultivo, de acuerdo con el número de condiciones experimentales para ensayar con el modelo de BBB. por inicioing con 1 vial de 1 x 10 6 ARC y 1 vial de 5 x 10 5 RBMECs, es posible obtener hasta 20 insertos BBB-cojinete. </li><li> Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2 en una atmósfera humidificada durante aproximadamente 6 días, hasta alrededor de 80% de confluencia para ARC y más de 90% de confluencia para RBMECs. Separar las células usando solución de tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) durante 5 min (1 ml de tripsina para matraces T75 y 2 ml para matraces T175). Deja de actividad de la tripsina con SECM (2: 1), suspensiones de células de centrifugación a 750 xg durante 5 min y volver a suspender los pelets en 60 ml SECM. </li><li> Dividir los RBMECs en 3 matraces T175 y la cultura en SecM por otros 3 días antes de la siembra en los insertos. Contar el número total de vida ARC, mediante la observación de una suspensión celular diluida 1: 1 con azul de tripano con un microscopio óptico en una cámara Burker. </li></ol></li><li> La siembra de células en insertos <ol><li> Tratar a un lado del tereftalato de polietileno (PET) de la membrana de transpa 6 pocillos múltiplesinserciones ORL con poli-L-lisina 100 mg / ml y el otro lado con fibronectina 50 g / ml, para permitir la fijación de RCA y BMECs. Manejar los insertos con pinzas con el fin de evitar el contacto con la membrana de PET. <ol><li> Coloque los insertos en una placa de 6 pocillos y añadir solución de fibronectina (mínimo 500 l) en la cámara superior. Después de 1 h de incubación a 37 ° C, se retira la solución de fibronectina, tome las inserciones de la placa de múltiples pocillos y ponerlos boca abajo en el fondo de un 150 cm plato 2 Petri, que se utiliza aquí como un soporte estéril para el ya recubiertos insertos. </li><li> Añadir con cuidado 800 l de poli-L-lisina en el lado inferior de la pieza de inserción (como se muestra en la Figura 1A; se hace referencia como la siembra ARC), y mantener la solución en los insertos durante 1 hora a RT. </li><li> Aspirar la solución y dejar que los insertos se secan a temperatura ambiente durante 15-30 min. Los insertos están ahora listos para la siembra de células, pero también se pueden almacenar en la placa de múltiples pocillos para variosdías a 4 ° C, antes de proceder a la construcción de la acreditación. Nota: Recuerde que debe mantener al menos 3 insertos recubiertos libres de células, para ser utilizados como controles para validar la acreditación establecimiento por FD40 mediciones de flujo. </li></ol></li><li> ARC semillas (35.000 / cm 2) en el lado inferior de los insertos de poli-L-lisina, dejando caer 800 l de suspensión de células en el revés de inserción (Figura 1A). Dejar la suspensión RCA en los insertos durante 4 horas a RT, con el fin de permitir la fijación eficiente de las células a la membrana. </li><li> Aspirar la solución residual, colocar los insertos en los pocillos que contenían 2 ml de SECM y mantener la placa de múltiples pocillos a 37 ° C y 5% de CO 2 en una atmósfera humidificada, cambiando el SECM cada 2 días. </li><li> Después de 3 días, cuando las ARC han revestido la cara inferior de la inserción, RBMECs de semillas sobre el lado superior del inserto, siguiendo estos pasos: <ol><li> Separar RBMECs de los matraces T175 y contar ellas células vivas totales, como se informó en los pasos 1.1.2 y 1.1.3. </li><li> RBMECs semillas (60.000 / cm 2) sobre la superficie superior del inserto en SECM (1000 l) (Figura 1B), dejando 3 insertos con sólo los astrocitos, que se utilizarán como fondo TEER. Colocar la placa de múltiples pocillos en condiciones de cultivo estándar. Mantener el sistema de cultivo durante al menos 3 días, cambiando el SecM en la cámara interior e inferior cada 2 días. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Validación de la acreditación <ol><li> Medición TEER <ol><li> En el 3er día de co-cultivo, compruebe la TEER mediante la inserción de los insertos que portan la acreditación en una cámara apropiada (que tiene una tapa y donde tanto la cámara y la tapa contienen un par de detección de voltaje y los electrodos de corriente), lleno de 4 ml de SECM. Conectarse a una epiteliales del tejido voltios / ohmímetro. </li><li> Junto con las mediciones de TEER de las células BBB-sistemas, registrar los valores de TEER de los 3 Casquillos de cojinetes de las ARC thWill restarse de los valores obtenidos con el BBBs. Multiplicar los valores de TEER resultantes por la superficie de la pieza de inserción (4,2 cm 2) a fin de expresar los resultados como Ω x cm 2. </li><li> A partir de los 3 días de co-cultivo, medir la TEER todos los días. Nota: Después de un período inicial en el que el TEER aumenta, los valores registrados deben permanecer estables durante al menos dos días consecutivos (por lo general entre el 5º y el 7º día de co-cultivo). En ese punto la BBB está listo para la segunda etapa de validación (sección 2.2) y / o para los experimentos de trans-BBB. Nota: El procedimiento descrito en la sección 2.1 se puede realizar en las mismas BBB-sistemas dedicados a los siguientes experimentos de permeabilidad (sección 3). Operar bajo condiciones estériles. </li></ol></li><li> Trans-Flux acreditación de FITC-dextrano 40 (FD40) <ol><li> Medir el flujo FD40 desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB en comparación con los que a través de 3 insertos vacíos(Véase la nota de la sección 1.2.1) de acuerdo con los siguientes pasos: <ol><li> Añadir 1 mg / ml FD40 (diluido en SECM) en el compartimiento superior de la BBBs, y después de 1, 2 y 3 hr retirar 200 SECM l de la cámara inferior y medir la intensidad de fluorescencia por espectrofluorímetro (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, de hendidura 5). </li><li> Obtener los valores para el fondo SECM fluorescenceby medición de 500 l de medio de virgen utilizando los mismos parámetros analíticos. Restar la fluorescencia de fondo SecM de todos los valores de fluorescencia FD40. </li><li> Determinar la cantidad de FD40 permeado mediante la comparación de los valores de fluorescencia observados con una curva de calibración producida con concentraciones conocidas (es decir. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 mg / ml) del trazador fluorescente disuelto en 500 l de SECM. </li><li> Calcular el coeficiente de permeabilidad aparente (P app) a partir de los valores de flujo de medios de acuerdo con: P app = J / AC <br/&gt; Donde J es el flujo de la molécula (moles / seg), A es el área de permeación (cm 2) y C es la concentración de la molécula en el compartimiento superior (moles / cm 3). Nota: Tres o más BBB-sistemas que han alcanzado valores de TEER adecuados, deben estar dedicados exclusivamente a este procedimiento de validación, y no deben emplearse para los siguientes experimentos de permeabilidad (sección 3). La esterilidad no es obligatorio. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Trans-acreditación Penetración de la ferritinas cargado con FITC (FNN) Nota: Una variante recombinante de la ferritina humana (Fn), producida en Escherichia coli y se reunieron en nano-cajas (FNN) para la encapsulación de diferentes moléculas fluorescentes, está disponible en el NanoBioLab del Prof. Prosperi (Universidad de Milán-Bicocca, Italia). Fnn se cargan con FITC, de acuerdo con un protocolo previamente descrito 13 y las concentraciones de ambos Fn y las moléculas cargadas se determin precisióned. <ol><li> Trans-Flux acreditación de FITC y FITC-Fnn <ol><li> Medir el flujo de FITC-Fnn desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB validados (por lo general en el 5º - 7º día de co-cultivo), en comparación con la del colorante libre después de las 7 y 24 horas de incubación, según los pasos siguientes: <ol><li> Añadir FITC Fnn (50 mg / ml Fnn, 1,1 M FITC) o una cantidad igual de libre FITC en la cámara superior de al menos 6 sistemas de BBB para cada formulación, con el fin de retirar 2 ml de solución SecM de la cámara inferior de al menos 3 insertos después de las 7 horas, y desde la cámara inferior de otros 3 insertos después de 24 horas. </li><li> Medir la intensidad de fluorescencia de 500 l de las muestras recogidas por espectrofluorímetro (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, hendidura 5). </li><li> Obtener la fluorescencia de fondo SECM mediante la medición de 500 l de medio utilizando los mismos parámetros analíticos. Restar la fluorescencia de fondo SecMde todos los valores de fluorescencia FITC o FITC-Fnn. </li><li> Determinar la concentración de FITC por permeabilidad o FITC-Fnn mediante la comparación de los valores de fluorescencia obtenidos con dos curvas de calibración diferentes producidos con concentraciones conocidas (es decir. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) del colorante libre o nanoformulated disuelto en 500 l SECM. </li></ol></li></ol></li><li> FITC-Fnn Localización en RBMECs <ol><li> Eliminar SECM de la cámara superior de los sistemas de BBB, lavar los insertos con PBS y fijar los RBMECs en al menos dos piezas de inserción para cada grupo experimental mediante la adición de 500 paraformaldehído l (4% en tampón fosfato salino-PBS) en el compartimiento superior para 10 min a TA. </li><li> Lavar los insertos de tres veces con PBS para eliminar el paraformaldehído residual. Nota: A partir de ahora, la esterilidad no es necesario. </li><li> Cortar trozos adecuados de la membrana de PET, y proceder con la immunodecoration de las células según los siguientes pasos: <ol><li> permeabilize RBMECs con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos. Realizar una etapa de bloqueo durante 1 hora a RT con una solución que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA), 2% de suero de cabra en PBS. Se incuban las muestras con un Willebrand Factor anti-Von (VWF) a una dilución de 1:20, durante 2 horas a RT. </li><li> Después de lavar tres veces con PBS, exponer las células durante 2 horas a TA a una BSA 2%, una solución de suero de cabra 2% que contiene un anticuerpo secundario adecuado a una dilución 1: 300 con el fin de revelar la anti-VWR, y DAPI a una dilución 1: 1500 para la detección de núcleos. </li></ol></li><li> Montar las piezas de inserción en portaobjetos de microscopio utilizando una solución de montaje antifade (una gota por fragmento de inserción), a continuación, cierre la muestra con un cubreobjetos. Analizar mediante microscopía confocal usando un lente de inmersión en aceite a 40 aumentos, zoom de 1,5 y 1.024 x 1.024 píxeles de resolución. </li></ol></li></ol>

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<li>Perrière, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+for+molecular+analysis+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters.</a> Brain Res. 1150, 1-13 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El método in vitro descrito aquí representa un enfoque validado útil para estudiar la entrega trans-BBB de moléculas fluorescentes sobre nanoformulation con nanopartículas. Aquí utilizamos Fnn, lo que representa un buen candidato para estudiar la translocación de moléculas de carga a través de la BBB. Fnn se considera el nanovector oro para la entrega trans-BBB de drogas / agentes, ya que está específicamente reconocido por el receptor de TfR1, que se expresa en la membrana luminal de BMECs y media en la captac...

La resistencia del sistema nervioso central (SNC) enfermedades (es decir. El cáncer, la epilepsia, la depresión, la esquizofrenia y el trastorno neurológico asociado con el VIH) a las terapias farmacológicas se debe a varios mecanismos diferentes, incluyendo penetración de fármaco ardua través de la barrera hematoencefálica (BBB) . La BBB es la frontera que aísla los tejidos del cerebro de las sustancias que circulan en la sangre. Dentro de esta barrera, una capa de células microvasculares endoteliales del cerebro (BMECs), apoyado por pericitos y endfeet astrocitos, es responsable de la alta selectividad de la acreditación a esos medicamentos hidrosolubles con un peso molecular superior a 400 Da 1. Otro mecanismo de resistencia relacionada con la droga está vinculada a la presencia en BMECs de transportadores de flujo de salida de fármaco (P-glicoproteína y resistencia a múltiples fármacos, proteínas) que cooperan para reducir la penetración del fármaco en el SNC y facilitar su extrusión desde el cerebro 2. En la ultima década, Un gran número de ámbito de las nanotecnologías se han desarrollado para hacer frente al desafío clínico y biológico de la administración de fármacos a través de la acreditación 3-6. En este contexto, nanoesferas de ferritina (Fnn) representan una solución totalmente innovadora y prometedora. Fnn son esferas 12 nm de 24 ferritina auto-montaje (Fn) monómeros, que están dispuestos en una estructura esférica hueca de 8 nm de diámetro interior. subunidades de ferritina se pueden desmontar a pH ácido y volver a montar de una manera con memoria de forma por lo que el pH a la neutralidad, lo que permite diversas moléculas orgánicas a encapsular. Por lo tanto, Fnn representan un modelo interesante para el desarrollo de múltiples funciones de administración de fármacos sistemas 7,8. Por otra parte, Fnn puede interactuar con BMECs gracias al reconocimiento específico de receptor de transferrina (TfR) 1, que se expresa en la membrana luminal de estas células 9. Hasta el momento, diferentes modelos in vitro de la acreditación han sido desarrolladas en el order para dilucidar trans-BBB permeabilidad a los diversos fármacos, toxicidad hacia la BBB, o la interacción de las moléculas con transportadores de salida. De hecho, estos modelos se consideran válidas en vitro enfoques para un cribado rápido de moléculas activas antes de continuar con estudios in vivo. Estos modelos se componen de una sola capa endotelial de BMECs o BMECs y astrocitos co-cultivadas (más raramente pericitos), obtenido a partir de animales (rata, ratón, cerdo y bovino) o líneas celulares humanas 10,11,12. El transendotelial Resistencia Eléctrica (TEER) y la permeabilidad aparente (P app) de trazadores con un peso molecular definido representan dos parámetros críticos que se utilizan para determinar la calidad del modelo in vitro. Aquí se describe el empleo de un modelo de acreditación in vitro, basado en un co-cultivo de rata BMECs (RBMECs) y la rata astrocitos corticales (ARC) para estudiar la permeabilidad trans-acreditación de nano-cajas de ferritina encapsular isothi fluoresceínaocyanate (FITC).

<table><tbody><tr><td>Células endoteliales microvasculares del cerebro de rata&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10308</td><td>aislado de tejido cerebral de rata Sprague Dawley, criopreservado en el pasaje uno y entregado</td></tr><tr><td>Astrocitos Corticales congelados&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10202</td><td>aislado a partir de 2 días de tejido cerebral de rata, criopreservado en el primer paso y entregado congelado.</td></tr><tr><td>Kit de medio de células endoteliales</td><td>Innoprot</td><td>P60104</td><td>ECM (500 ml) y suero fetal bovin (25 ml), suplemento de crecimiento de células endoteliales (5 ml) y penicilina/estreptomicina (5 ml). Cálido en 37 &deg; C baño de agua antes de usar y proteger de la luz</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA sin Fenol Rojo</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920D</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Fluoresceína isotiocianato-dextrano 40,000</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>proteger de la luz</td></tr><tr><td>paraformaldehído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>dilución en campana química</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato de Dulbecco, solución salina sin Ca y Mg</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>suero de cabra&nbsp;</td><td>EuroClone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal de ratón anti-Von Willebrand Factor</td><td>Dako</td><td>M0616</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 546-conjugado contra IgGs de ratón</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11003</td><td>protege de la luz</td></tr><tr><td>DAPI (4' ,6-diamidino-2-fenilindol)&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>proteger de la luz</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>la misma solución se puede utilizar varias veces</td></tr><tr><td>fibronectina de plasma bovino&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>la misma solución se puede utilizar varias veces</td></tr><tr><td>Insertos de tereftalato de polietileno (PET)</td><td>Falcon</td><td>F3090</td><td>Membranas transparentes de tereftalato de polietileno (PET); superficie: 4,2 cm2; tamaño de poro 0,4 y micro; m/superficie</td></tr><tr><td>T75 Matraz Primo TC</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>T175 Matraz Primo TC</td><td>EuroClone</td><td>ET7181</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Tejido Epitelial Voltio/Ohmímetro&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments Alemania</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Endohm- 24SNAP</td><td>cup World Precision Instruments Alemania</td><td>ENDOHM-24SNAP</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz/fluorescencia con cámara</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module</td><td>&nbsp; Microscopio invertido para células vivas con cámara&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio confocal Espectrofluorímetro</td><td>TCS SPE</td><td></td>de <td>Leica Microsystems</td></tr><tr><td>Jasco</td><td></td><td>FP-8000</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro de permeación de ferritinas cargados con fitc través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas nanoformulated

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Las células endoteliales microvasculares cerebrales, soportadas por pericitos y astrocitos en los extremos, son responsables de la baja permeabilidad de grandes fármacos hidrosolubles a través de la barrera hematoencefálica (BBB), lo que dificulta la eficacia de las terapias farmacológicas. En los últimos años, diferentes estrategias para promover la focalización cerebral han tenido como objetivo mejorar la administración de fármacos y la actividad en este sitio, incluidos nanosistemas innovadores para la administración de fármacos en toda la BBB. En este contexto, un enfoque in vitro basado en un modelo celular simplificado de la BBB proporciona una herramienta útil para investigar el efecto de las nanoformulaciones en la permeabilidad trans-BBB de las moléculas. Este estudio describe el desarrollo de una BBB de doble capa, que consiste en co-cultivo de células endoteliales microvasculares y astrocitos primarios de cerebro de rata disponibles comercialmente. También se describe un enfoque multiparamétrico para la validación del modelo, basado en la medición de la resistencia eléctrica transendotelial y la permeabilidad aparente de un dextrano de alto peso molecular. Como prueba de concepto para el empleo de este modelo BBB para estudiar el efecto de diferentes nanoformulaciones en la translocación de moléculas fluorescentes a través de la barrera, describimos el uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC), cargado en nanopartículas de ferritina. La capacidad de las ferritinas para mejorar la permeabilidad trans-BBB de FITC se demostró mediante mediciones de flujo y análisis de microscopía confocal. Los resultados sugieren que se trata de un sistema útil para validar nanosistemas para la administración de fármacos a través de la BBB.

Durante el establecimiento de la BBB modelo, la unión celular y el crecimiento en las piezas de inserción se puede controlar usando un microscopio de luz gracias a la naturaleza transparente de las membranas de PET. ARC, sembradas a una densidad de 35.000 células / cm 2, conecte de manera eficiente a la parte inferior de la pieza de inserción después de 4 h de incubación a RT (Figura 2A) y crecer para cubrir la superficie de la membrana en 3 días, teniendo una...

Se describe y valida un método para establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica basado en un cocultivo de células endoteliales microvasculares y astrocitos con cerebro de rata. Este sistema demostró ser una herramienta válida para estudiar el efecto de la nanoformulación en la permeabilidad transbarrera de moléculas fluorescentes.

In vitro de permeación de ferritinas cargados con FITC través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas Nanoformulated

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

El objetivo general de este procedimiento es describir un enfoque validado para estudiar la entrega a través de la barrera hematoencefálica de moléculas fluorescentes nanoformuladas, utilizando nanojaulas de ferritina cargadas con FITC como prueba de concepto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la resistencia de las enfermedades del sistema nervioso central a las terapias farmacológicas, debido a la baja permeación de los fármacos a través de la barrera hematoencefálica. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de demostrar la capacidad de la nanoformulación para mejorar la permeación transmitida a través de la BHE de moléculas encapsuladas, utilizando un enfoque en un modelo único de BBB.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de trastornos con efectos neurológicos porque tiende a superar la alta selectividad de la barrera hematoencefálica frente a la mayoría de los fármacos. Este método puede proporcionar información sobre la eficacia de las nanojaulas de ferritina como sistema de entrega de fármacos a través de la BHE. Se ha aplicado con FITC, pero también puede aprovecharse con otras moléculas de carragenina

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Este video describe un ensayo de permeabilidad para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica in vitro utilizando moléculas de fluoresceína de sodio.

Ensayo de permeabilidad de la barrera hematoencefálica: un ensayo in vitro para evaluar la permeabilidad del imitado de la barrera hematoencefálica a las moléculas trazadoras

Este video muestra un método para estudiar la permeabilidad a través de un modelo de barrera hematoencefálica (BBB) in vitro utilizando astrocitos y células endoteliales en un inserto de membrana, con FITC libre y ferritina cargada con FITC. La FITC-ferritina se unió a los receptores de las células endoteliales y cruzó la barrera de la membrana hacia la cámara inferior, mientras que la FITC libre mostró una permeabilidad restringida y permaneció en la cámara superior.

Estudio de la permeabilidad de FITC y FITC-ferritina a través de un modelo de barrera hematoencefálica in vitro

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood - brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

En este estudio, presentamos un procedimiento fácil y eficiente para evaluar la interrupción de la barrera sangre - cerebro en enfermedades neurodegenerativas. Para lograr nuestro objetivo, nos infunde isotiocianato de fluoresceína de alto peso molecular etiquetado (FITC)-albúmina en yugular de ratón de la vena y evaluado su salida en el parénquima cerebral por microscopía de fluorescencia.

Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Medicamentos dirigidos a tumores del sistema nervioso central es un gran desafío. Aquí se describe un protocolo para producir a un imitador in vitro de la tumor-barrera blood-brain con células murinas y humanas y discutir su pertinencia para la previsibilidad del sistema nervioso central tumor targeting in vivo.

Prediciendo en Vivo cargas entrega usando una Barrera Blood-brain Tumor en un plato

Este protocolo ilustra un ensayo de transcitosis de células endoteliales in vitro como modelo para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina midiendo la capacidad de las células endoteliales microvasculares de la retina humana para transportar peroxidasa de rábano picante a través de las células en procesos de transporte transcelular mediados por caveolas.

Ensayo de transcitosis de células endoteliales como modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina

En el presente estudio, el dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se administra a ratones a través de sonda oral para evaluar la permeabilidad intestinal tanto in vivo como en muestras plasmáticas y fecales. Como la función de barrera intestinal se ve afectada en muchos procesos de enfermedad, este ensayo directo y cuantitativo se puede utilizar en diversas áreas de investigación.

Evaluación de la integridad de la barrera intestinal en ratones utilizando dextrano marcado con fluoresceína-isotiocianato

"ADN electrónico" sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

Aprende a estudiar la permeación de moléculas fluorescentes nanoformuladas a través de la barrera hematoencefálica usando ferritinas cargadas con FITC en un modelo in vitro con células endoteliales y astrocitos de rata.

In vitro de permeación de ferritinas cargados con FITC través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas Nanoformulated (Video) | JoVE Journal

In vitro de permeación de ferritinas cargados con FITC través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas Nanoformulated

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