Name: basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 durante la curación de la herida corneal epitelial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende a investigar la función de HSP27 en la curación de heridas corneales epiteliales mediante ARN de interferencia específico. Este método permite evaluar el papel de la proteína de choque térmico 27 en procesos celulares.

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Este estudio fue apoyado por la Beca de Investigación para Estudiantes (13-14) de la Universidad de Ulsan College of Medicine, Seúl, Corea y una subvención (2014-464) del Instituto Asan de Ciencias de la Vida, Seúl, Corea.

1. Línea celular <ol><li> Cultura 10 6 células telomerasa inmortalizado humanos corneales epiteliales (HCECs) en una placa de 6 pocillos (densidad: 1039,9 células / mm 2) en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO 2 utilizando medio de crecimiento epitelio bronquial (BEGM) hasta que alcanzan 95% de confluencia. </li></ol> 2. Análisis de Western Blot después de crear heridas epiteliales de Scratch <ol><li> Streak una punta estéril de 200 l pipeta sobre la superficie de un pozo de confluentes HCECs cultivadas cuatro veces al plato en una cabina de seguridad biológica (Clase II, Tipo A2) e incubar HCECs por separado en una incubadora a 37 ° con una atmósfera con 5% de CO 2 para 1, 5, 10, 30, 60, y 120 min. </li><li> Utilice una placa de 6 pocillos para seis muestras diferentes de acuerdo con el tiempo de incubación después de la herida epitelial corneal. </li><li> Lavar las monocapas HCEC heridos tres veces con 1 x PBS y luego añadir 2,0 ml BEGM a cada pocillo. </li><li> Separar HCECs utilizando 2ácido ml 0,25% de tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) por pocillo durante 5 min, centrifugar a 900 xg durante 5 min en un tubo de 15 ml, y aspirado de tripsina-EDTA usando una pipeta de 1 ml. </li><li> Suspender HCECs con 1 ml de PBS 1x y transferirlos a un tubo de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar HCECs a 10.000 xg durante 15 seg y aspirado de 1x PBS utilizando una pipeta de 1 ml. </li><li> Resuspender HCECs en 100 l de tampón de lisis enfriado en hielo (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, EDTA 2 mM, NaF 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo [PMSF], inhibidores de la proteasa [1 M de pepstatina A, 1 leupeptina mu M, y 0,1 M de aprotinina] y 0,5% de Triton X-100 [pH 7]) y mezclar bien. </li><li> Se incuban las células durante 30 min en hielo para inducir la lisis celular. </li><li> lisados ​​centrifugar a 4ºC a 10.000 xg durante 15 min, y luego transferir los sobrenadantes a nuevos tubos de 1,5 ml (90 ml de alícuotas) y almacenar a -80 ° C. </li><li> Determinar las concentraciones de proteína total de lisados ​​celulares utilizando el pr BradfordOtein ensayo. 9 </li><li> Cargar 30 g de proteínas celulares totales en un gel de acrilamida al 10% o 12% para electroforesis de dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), y luego por electroforesis de transferencia separados bandas de proteínas a filtros de nitrocelulosa con una corriente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C para utilizar en ensayos de Western blot. </li><li> membranas de filtro de bloque de nitrocelulosa con un 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST) durante 1 hora, añadir anticuerpos policlonales de conejo primaria contra HSP27 no fosforilada (dilución 1: 1.000) o el anticuerpo policlonal de conejo primaria contra fosforilada HSP27 (1 : 1000 dilución) en 5% de albúmina de suero bovino (BSA), y se incuban las membranas durante la noche a 4 ° C en un agitador. </li><li> Detectar bandas inmunorreactivas utilizando anticuerpos anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra (1: 10.000 de dilución) en BSA al 5% después del lavado durante 10 minutos 3 veces con TBST. </li><li> Incubar la membrana en los reactivos de transferencia de Western de luminol (6-7 ml por cada 10 cm × 5 cm de membrana) durante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire la membrana de la solución de reactivo, eliminar el exceso de líquido con una toalla absorbente, y coloque en un protector de hojas de plástico. </li><li> Trabajar en un cuarto oscuro con una luz de seguridad, colocar la membrana cubierto en un casete de película con el lado de la proteína hacia arriba. </li><li> Colocar una película de rayos X en la parte superior de la membrana y exponer durante 1 min. </li></ol> 3. Ensayo de transfección siRNA 10 <ol><li> HCECs de cultivo a 5 x 10 5 células / pocillo en una placa de 6 pocillos en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO 2 usando BEGM hasta que alcanzan 95% de confluencia. </li><li> Diluir el reactivo de transfección (2,5 o 7,5 l) con 100 l reducción de medio de suero para la transfección (el factor de dilución fue de 41 o 14.3) y disolver la HSP27-específica y revueltos siRNA control en 100 l medio con suero reducido a crear 10 o 50 nM de -HSP27 específico y revueltos siRNA control. </li><li> Mezclar 100 μ; Solución siRNA l con 100 l de reactivo de transfección diluido (relación 1: 1) y se incuba la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir los complejos lípido-siRNA para las células. A continuación, después de 4 horas de cambio de los medios de comunicación para completar BEGM e incubar las células durante 2 días a 37 ° C. </li><li> Analizar las células transfectadas por el Western Blot, como se describe a partir de las secciones 4.1 a 4.7. </li></ol> 4. Western Blot ensayo para células transfectadas con siRNA 11 <ol><li> Extraer-HSP27 específico y revueltos de control HCECs siRNA-transfectadas en una cabina de seguridad biológica usando 100 l de tampón de lisis enfriado en hielo (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), NaF 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF), inhibidores de la proteasa, y 0,5% de Triton X-100, pH 7). </li><li> Se incuban las células durante 30 min en hielo para inducir la lisis celular. </li><li> lisados ​​de pellets a 10.000 xg durante 15 min y luego transferir los sobrenadantes de bañera fresca 1,5 mlES (90 l alícuotas) y almacenar a -80 ° C. </li><li> Determinar las concentraciones de proteína de los lisados celulares utilizando el ensayo de proteínas de Bradford. 9 </li><li> Cargar las muestras con cantidades iguales de proteínas totales de células en un gel de acrilamida al 10% o 12%, siempre que el gel SDS-PAGE y electroforesis transferir las bandas de proteínas separadas a filtros de nitrocelulosa con una corriente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C hasta utilizar en ensayos de Western blot. </li><li> Bloque membranas de filtro de nitrocelulosa con 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST) durante 1 hora, añadir anticuerpos primarios contra fosforilada y no fosforilada HSP27 (dilución 1: 1000), Akt fosforilada (dilución 1: 1000), no fosforilada Akt (dilución 1: 1000, que se utiliza como marcador de la supervivencia celular), asociada a Bcl-2 de proteínas X (dilución 1: 1000, que se utiliza como una proteína pro-apoptótica), y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1 : dilución 200, que se utiliza como control de carga) en 5% de albúmina de suero bovino (BSA), yincubar las membranas durante la noche a 4 ° C en un agitador. </li><li> Detectar bandas inmunorreactivas utilizando anticuerpos anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra (1: 10.000 de dilución) en BSA al 5% después de lavar 3 veces con TBST, 10 minutos cada lavado. </li><li> Incubar la membrana en los reactivos de transferencia de Western de luminol (6-7 ml por 10 cm × 5 cm de membrana) durante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire la membrana de la solución de reactivo, eliminar el exceso de líquido con una toalla absorbente, y coloque en un protector de hojas de plástico. </li><li> Trabajar en un cuarto oscuro con una luz de seguridad, colocar la membrana de cubierta en una casete de película con el lado de la proteína hacia arriba. </li><li> Coloque película de rayos X en la parte superior de la membrana y exponer para 1 min. </li></ol> 5. rasguño inducida direccional hiriente Ensayo de Evaluación de la migración celular 12 <ol><li> En una cabina de seguridad biológica, hacer una herida arrastrando una punta de pipeta estéril a través de la superficie de un pozo de cultivos confluentes de-HSP27 siRNA transfectadas o HCECs siRNA transfectadas de control revueltos. </li><li> Inmediatamente después de la herida, se lavan las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y mantenerlas en cultivos BEGM en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO 2 durante 24 horas después de la herida. </li><li> Fotografiar imágenes HCEC utilizando un microscopio vertical con un aumento de 100X de 24 horas después de la lesión y realizar aplanamiento fondo usando el filtro comando en el software de análisis de imágenes. </li><li> Usando el comando Seleccionar mediciones, definir el área de interés (AOI), con la misma forma poligonal tamaño que puede cubrir perpendicularmente desde un extremo al otro de la herida inicial, y determinar tres diferentes AOI en la zona de la herida de cada muestra. </li><li> contar automáticamente el número de células en cada campo usando las opciones del menú de medida de recuento / Tamaño. </li></ol> 6. Análisis de Flujo Citometría de apoptosis <ol><li> Cultura HSP27-siRNA-transfectadas y control sHCECs que contienen cada uno 10 nM siRNA RNAi-transfectó a una concentración de 5 x 10 5 células / pocillo en placas de 6 pocillos hasta que las células alcanzan la confluencia 95% en una incubadora a 37 ° con una atmósfera 5% de CO 2 en BEGM. </li><li> Separar HCECs utilizando 2 ml 0,25% de tripsina-EDTA por pocillo durante 5 min, centrifugar a 900 xg durante 5 min en un tubo de 15 ml, y aspirado de tripsina-EDTA usando una pipeta de 1 ml. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS frío y luego volver a suspender las células en 1x tampón (0,1 M de HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl, y CaCl 25 mM 2) de unión a una concentración de 10 6 células / ml. </li><li> Transferencia de 100 l suspensión de células (1 x 10 5 células) en un tubo de cultivo de 5 ml. </li><li> Añadir 5 l isotiocianato de fluoresceína conjugado de Anexina V y 5 l de yoduro de propidio. </li><li> vórtice suavemente las células y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Añadir 200 l de tampón de unión 1X a cada tubo y analizar las células mediante un flujo cytometer dentro de 1 hora. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros o de propiedad de cualquier material o métodos mencionados en este estudio.

En este estudio, evaluamos el papel potencial de HSP27 en la herida epitelial corneal utilizando enfoques in vitro . Los pasos críticos involucraron la transfección de ARNip para la eliminación de HSP27 para observar la función de HSP27 en células sometidas a estrés. En particular, estos experimentos revelaron un papel para HSP27 en la migración de células epiteliales y la apoptosis durante la cicatrización de heridas epiteliales corneales. A diferencia de estudios anteriores10 que utilizaron ARNip es...

Las células epiteliales corneales (CEC) se desprenden continuamente en la película lagrimal, mientras que se sustituyen de forma simultánea por las células desde el limbo y capas basales epiteliales corneales. 1 Varios factores estresantes extrínsecos pueden inducir la apoptosis y la descamación de CECs. 2 Las proteínas de choque térmico (HSPs) están muy conservadas y se puede dividir en dos familias según su tamaño molecular. 3 la familia HSP más grande incluye HSP90, HSP70, y Hsp60, y la familia más pequeña incluye HSP27. 4 la fosforilación de HSP27 se sabe que juega un papel importante en la supervivencia celular y es necesario para la migración celular a causa del papel de esta proteína en la remodelación de la actina. 5-7 por lo tanto, hemos intentado probar el posible papel de la fosforilación de HSP27 en la migración de CEC y la apoptosis en un modelo in vitro de la curación de heridas epiteliales. ARN de interferencia (RNAi), utilizando tanto las pequeñas o cortas ARN de interferencia (siRNA) tiene generated interés tanto en la biología básica y aplicada, ya que potencialmente permite la expresión de cualquier gen de interés para ser derribado. 8 En esto, hemos utilizado siRNA-HSP27 específico para evaluar la contribución de HSP27 para la cicatrización de heridas CCA y la apoptosis. Los métodos tradicionales de ARNi para genes knock-down en células utilizan dúplex de ARN sintéticos, incluyendo dos oligonucleótidos 21-mer no modificados que se pueden ensamblar para crear siRNAs. La RNAi siRNA que hemos utilizado en el presente estudio es un método simple y altamente eficaz para transfectar células, y este reactivo trabaja con diversas líneas de células inmortalizadas. En el presente estudio, se demuestra los métodos utilizados para este análisis, incluyendo un ensayo de cero inducida por la herida direccional, el Western Blot, ensayo de transfección siRNA, ensayo de inmunofluorescencia y citometría de flujo.

<table><tbody><tr><td>Cabina de seguridad biológica</td><td>CHC LAB Co., Ltd,&nbsp; Daejeon, República de Corea&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Clase II, Tipo A2&nbsp;</td></tr><tr><td>ARNi sigiloso y comercio; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>ARNi siRNA; siRNA de control codificado y siRNA específico de HSP27</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175 Medio de</td><td>crecimiento del epitelio bronquial&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340 ,P7626</td><td>1 &#956; M Pepstatina A, 1 &#956; M Leupeptin, 0.1 &#956; Ensayo de proteína M Aprotinin</td></tr><tr><td>Bradford&nbsp;</td><td>Laboratorios Bio-Rad, Hércules, CA</td> <td># 500-0001</td><td>Ensayo de proteínas Bradford&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtros de nitrocelulosa&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, Reino Unido</td><td>RPN3032D</td><td>membrana Western blot membrana</td></tr><tr><td>HSP27 no fosforilada &nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>dilución 1:1.000 (HSP27 total)</td></tr><tr><td>HSP27 fosforilado (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>dilución 1:1.000 HSP27 fue fosforilado en Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg; RNAiMAX reactivo&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Akt fosforilado (Ser473)</td><td>Tecnología de señalización celular, Danvers, MA</td><td>No. 4060</td><td>Dilución 1:1,000 Akt fue fosforilado en Ser473 (marcador de supervivencia celular)</td></tr><tr><td>Akt no fosforilado&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular, Danvers, MA</td><td>No. 4061</td><td>dilución 1:1,000 (Akt total)</td></tr><tr><td>Proteína X asociada a Bcl-2&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular, Danvers, MA Nº</td><td>4062</td><td>1:1.000 (marcador de proteínas antiapoptóticas)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>Nº 4063</td> marcador de <td>control de carga 1:1.000 (gen de mantenimiento doméstico)</td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>dilución 1:10.000</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>medio sérico reducido para la transfección</td></tr><tr><td>software de análisis de imágenes</td><td>Olympus, Inc., Tokio, Japón</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Alemania</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de seis pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>35,00 mm de diámetro / pocillo</td></tr><tr><td>Plato de culutura de 24 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>N-Bioteck, Inc., Seúl, Corea del Sur</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Película de rayos X de</td> citometría de flujo <td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Casete de rayos X médicos con pantalla verde 400&nbsp;</td></tr><tr><td>reactivo de luminol de Western blot</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Kit de detección de apoptosis de anexina V I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

basado en la interferencia de arn investigación de la función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

El ARN interferente pequeño (siRNA) es uno de los métodos de interferencia de ARN más utilizados para el silenciamiento a corto plazo de genes codificadores de proteínas. El siRNA es un dúplex de ARN sintético creado para dirigirse específicamente a una transcripción de ARNm para inducir su degradación, y se ha utilizado para identificar nuevas vías en varios procesos celulares. Existen pocos informes sobre el papel de la proteína de choque térmico fosforilada 27 (HSP27) en la cicatrización de heridas epiteliales corneales. En este trabajo, las células epiteliales de la córnea humana cultivadas se dividieron en un grupo transfectado de siRNA de control codificado y un grupo transfectado de siRNA específico de HSP27. A continuación, se realizaron ensayos de lesiones direccionales inducidas por arañazos, Western blot y citometría de flujo. Concluimos que HSP27 tiene funciones en la cicatrización de heridas epiteliales corneales que pueden implicar la apoptosis y migración de células epiteliales. Aquí se proporcionan descripciones paso a paso de la preparación de la muestra y el protocolo del estudio.

La expresión de HSP27 fosforilada aumentó significativamente a los 5, 10, y 30 min después de cero hiriendo compara con HCECs ilesos 13. El análisis de transferencia Western reveló que la expresión de HSP27 fosforilada y fosforilada Akt se redujo significativamente tanto, mientras que la expresión de Bax fue significativamente mayor en HCECs siRNA transfectadas-HSP27 específica (Figura 1A-E). La expresión HSP27 fosforilada se redujo en un 30% y 40% en 10 nM y ...

En este artículo, presentamos un protocolo para utilizar el ARN interferente pequeño específico de la proteína de choque térmico 27 (HSP27) para evaluar la función de HSP27 durante la cicatrización de heridas epiteliales corneales. La interferencia de ARN es el mejor método para reducir eficazmente la expresión génica para investigar la función de las proteínas en varios tipos de células.

basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

El objetivo general de este ensayo de transfección de ARN es utilizar ARN de interferencia pequeño específico para HSP27 para evaluar el posible papel de HSP27 en la cicatrización de heridas del epitelio corneal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función de la proteína de choque térmico 27 durante el proceso de cicatrización de heridas epiteliales. La principal ventaja de esta técnica es que el ARN de interferencia pequeño es un ARN sensible a la ribonucleasa diseñado específicamente para dirigirse a un transcrito de ARN mensajero e inducir su degradación.Se ha utilizado para identificar nuevas funciones de plagas en diversos procesos celulares. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre la cicatrización de heridas en el epitelio corneal, también podría aplicarse a otro sistema, como la piel y la mucosa. Quien demostrará el procedimiento será Soon-Suk Kang, un técnico de mi laboratorio.Para comenzar este procedimiento, cultive células epiteliales corneales humanas en una placa de seis pocillos con medio de crecimiento para epitelio bronquial a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono hasta alcanzar una confluencia del 95 por ciento. A continuación, diluya 2,5 micro litros o 7,5 micro litros del reactivo de transfección con 100 micro litros de medio con suero reducido para transfección. Luego, disuelva ARNip específico para HSP27 y ARNip de control aleatorio en 100 micro litros de medio con suero reducido para obtener 10 nanomolares de ARNip específico para HSP27 y 15 nanomolares de ARNip de control aleatorio, respectivamente.A continuación, mezcle 100 micro litros de solución de siRNA con 100 micro litros del reactivo de transfección diluido e incube la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, agregue los complejos lipídicos de siRNA a las células. Después de una incubación de cuatro horas, cambie el medio al medio de crecimiento completo para epitelio bronquial e incube las células durante dos días a 37 grados Celsius antes del análisis por inmunotransferencia western.En este paso, extraiga HCEC transfectadas con siRNA específico para HSP27 y siRNA de control aleatorio en una cabina de seguridad biológica utilizando 100 µL de tampón de lisis frío. A continuación, incube las células durante 30 minutos en hielo para inducir la lisis celular. Luego, centrifugue los lisados a 10.000 ×g durante 15 minutos.Posteriormente, transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos de 1,5 mililitros y almacénelos a menos 80 grados Celsius. Después, determine las concentraciones de proteína de los lisados celulares utilizando el ensayo de proteína de Bradford. Luego cargue las muestras con cantidades iguales de proteínas celulares totales en un gel de acrilamida al 10 por ciento o al 12 por ciento.Somete el gel a electroforesis SDS-PAGE y transfiere electroforéticamente las bandas de proteína separadas a membranas de nitrocelulosa con una corriente de 200 miliamperios durante una hora y a cuatro grados Celsius. A continuación, bloquee las membranas de nitrocelulosa con leche descremada al cinco por ciento en TBST durante una hora. Luego agregue anticuerpos primarios e incube las membranas durante la noche a cuatro grados Celsius en agitación.Al día siguiente, lave las membranas tres veces con TBST, permitiendo diez minutos para cada lavado. Luego, detecte las bandas inmunoreactivas utilizando anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante en BSA al cinco por ciento. Posteriormente, incube las membranas en los reactivo luminol para inmunotransferencia durante un minuto a temperatura ambiente.Retire la membrana de la solución de reactivo. A continuación, elimine el exceso de líquido con una toalla absorbente y colóquelas en una funda de plástico para documentos. Posteriormente, coloque la membrana cubierta en una cubeta para película con el lado de las proteínas hacia arriba.Coloque una película de rayos X encima de las membranas y expóngala durante un minuto. En una cabina de seguridad biológica, realice una herida arrastrando la punta estéril de una pipeta a través de cultivos confluentes de HCEC transfectadas con siRNA específico para HSP27 o con siRNA de control aleatorio. Inmediatamente después de provocar la herida, lave las células dos veces con PBS 1X y manténgalas en medio de crecimiento para epitelio bronquial a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 24 horas.24 horas después de la herida, tomar la imagen de las HCEC utilizando un microscopio invertido a 100x y realizar el aplanamiento del fondo mediante el comando de filtro en el software de análisis de imágenes. Usando el comando seleccionar mediciones, definir el área de interés con una forma poligonal del mismo tamaño que pueda cubrir perpendicularmente la herida inicial de extremo a extremo. Luego, determinar tres áreas de interés diferentes en la zona lesionada de cada muestra.Cuente automáticamente el número de células en cada campo utilizando la opción del menú medir tamaño del recuento. El análisis de inmunotransferencia mostrado aquí reveló que la expresión de HSP27 fosforilada y Akt fosforilada se redujo significativamente. Mientras que la expresión de backs aumentó significativamente en HCECs transfectadas con siRNA específico para HSP27.La expresión de HSP27 fosforilada se redujo en un 30 por ciento y un 40 por ciento en células transfectadas con siRNA específico para HSP27 de 10 nanomolar y 15 nanomolar, respectivamente, en comparación con células transfectadas con siRNA control. Además, la expresión de HSP27 no fosforilada se redujo en un 20 por ciento y un 30 por ciento en células transfectadas con siRNA específico para HSP27 de diez nanomolar y 15 nanomolar, respectivamente. El ensayo de herida direccional inducida por rasguño indicó que 24 horas después de la lesión, las células transfectadas con siRNA específico para HSP27 a 10 y 15 nanomolar mostraron una migración reducida.Además, las HCEC transfectadas con siRNA específico para HSP27 sufrieron una mayor muerte celular apoptótica y necrótica en comparación con las células transfectadas con el siRNA de control aleatorio, como se muestra mediante citometría de flujo. Una vez dominada, la técnica de transfección de ARN puede realizarse en 24 horas si se lleva a cabo correctamente. Tras seguir estos procedimientos, puede generarse un episodio como el de boca cerrada para responder preguntas adicionales, como la función inicial de la proteína de choque térmico 27 en la cicatrización de heridas epiteliales de la córnea.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar ARN de interferencia pequeño específico para la Proteína de Choque Térmico 27 para evaluar el posible papel de la Proteína de Choque Térmico 27 en la cicatrización de heridas epiteliales de la córnea. No olvide que trabajar con ARN de interferencia pequeño y reactivos puede ser peligroso, y que siempre se deben utilizar equipos de protección como una cabina de seguridad biológica y una mascarilla protectora al realizar estos procedimientos.

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Genética

Se presenta un ejemplo de terapia génica adenoviral en las córneas diabéticas humanas cultivadas con órganos para la normalización de la cicatrización tardía de heridas y la expresión marcadamente reducida de marcadores de células madre epiteliales en estas córneas. También se describe la optimización de este proceso en cultivos epiteliales limbales enriquecidos con células madre.

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

Pequeña proyección inhibitoria de RNA alto rendimiento es una herramienta importante que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. Adjunto, presentamos el desarrollo y validación de modelos de exposición y métodos para el cribado de alto rendimiento de lesiones epiteliales de córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno y la cloropicrina.

Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

Un protocolo para un ex vivo modelo de cultura órgano córneo es útil para estudios de cicatrización se describe. Este sistema modelo puede utilizarse para evaluar los efectos de agentes para promover la curación regenerativa o toxicidad de la droga en un ambiente organizado de multicelular 3D.

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo de cicatrización de heridas corneales es altamente reproducible y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de enfermedades.

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.

Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

El presente protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Las córneas regeneradoras o completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.

Investigando la regeneración de tejidos sin cicatrices en córneas embrionarias de pollitos heridos

Este protocolo se centra en dañar la superficie ocular del pez cebra a través de la abrasión para evaluar el posterior cierre de la herida a nivel celular. Este enfoque explota una rebaba ocular para eliminar parcialmente el epitelio corneal y utiliza microscopía electrónica de barrido para rastrear los cambios en la morfología celular durante el cierre de la herida.

Cicatrización de heridas corneales de pez cebra: de la abrasión al análisis de imágenes de cierre de heridas

El presente trabajo describe un novedoso protocolo experimental que utiliza un soporte impreso en 3D para permitir imágenes de células vivas de alta resolución de globos enucleados. A través de este protocolo, la actividad de señalización de calcio celular en el epitelio corneal herido de globos ex vivo se puede observar en tiempo real.

Imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3D

Desarrollamos un modelo de rata de inflamación corneal severa a través de legrado de epitelio corneal combinado con suturas corneales. El estudio evaluó los patrones de inflamación de la córnea, la proliferación epitelial y los cambios en las células madre limbales en condiciones inflamatorias.

Establecimiento de un modelo de inflamación corneal severa en ratas basado en legrado del epitelio corneal combinado con suturas corneales

El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.

Evaluación de la toxicidad terapéutica y química mediante el cultivo de órganos de córneas porcinas y la cicatrización de heridas epiteliales

Aprende a investigar la función de HSP27 en la curación de heridas corneales epiteliales mediante ARN de interferencia específico. Este método permite evaluar el papel de la proteína de choque térmico 27 en procesos celulares.

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basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

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