basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

El objetivo general de este ensayo de transfección de ARN es utilizar ARN interferente pequeño específico de HSP27 para evaluar el papel potencial de HSP27 en la cicatrización de heridas epiteliales corneales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función de la proteína de choque térmico 27 durante el proceso de cicatrización de heridas epiteliales. La principal ventaja de esta técnica es que el ARN interferente pequeño es sacarosa de ARN sensible creado para dirigirse específicamente a una transcripción de ARN mensajero para inducir su degradación.

Se ha utilizado para identificar nuevos procesos celulares en el espacio de plagas. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre la cicatrización de la herida epitelial corneal, también puede aplicarse a otros sistemas, como la piel y las mucosas. La demostración del procedimiento estará a cargo de Soon-Suk Kang, un técnico de mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, se cultivan células epiteliales de la córnea humana en una placa de seis pocillos con un medio de crecimiento del epitelio bronquial a 37 grados centígrados y un cinco por ciento de dióxido de carbono hasta que confluyan al 95 por ciento. A continuación, diluya 2,5 microlitros o 7,5 microlitros del reactivo de transfección con 100 microlitros de medio sérico reducido para la transfección. A continuación, disuelva el siRNA específico de HSP27 y el siRNA controlado revuelto en 100 microlitros o en medio sérico reducido para crear 10 nanomolares de siRNA específico de HSP27 y 15 nanomolares de siRNA de control codificado, respectivamente.

A continuación, mezcle 100 microlitros de solución de siRNA con 100 microlitros de reactivo de transfección diluido e incube la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, agregue complejos lipídicos de siRNA a las células. Después de una incubación de cuatro horas, cambie el medio por el medio de crecimiento completo del epitelio bronquial e incube las células dos días a 37 grados centígrados antes del análisis de Western blot.

En este paso, extraiga los HCEC transfectados de siRNA de control específico y codificado de HSP27 en una cabina de seguridad biológica utilizando 100 microlitros de tampón de lisis en frío hielo. A continuación, incubar las células durante 30 minutos en hielo para inducir la lisis celular. A continuación, centrifugar los lisados a 10.000 veces G durante 15 minutos.

Posteriormente, transfiera los sobrenadantes a tubos frescos de 1,5 mililitros y guárdelos a menos 80 grados centígrados. Después de eso, determine las concentraciones de proteínas de los lytatos celulares utilizando el ensayo de proteínas de Bradford. A continuación, cargue las muestras con cantidades iguales de proteínas celulares totales en un gel de acrilamida al 10 o al 12 por ciento.

Someta el gel a la página SDS y transfiera electroforéticamente las bandas de proteínas separadas a los filtros de nitrocelulosa con 200 miliamperios de corriente durante una hora y cuatro grados Celsius. A continuación, bloquee las membranas del filtro de nitrocelulosa con leche desnatada al cinco por ciento en TBST durante una hora. A continuación, añada los anticuerpos primarios e incube las membranas durante la noche a cuatro grados centígrados en un agitador.

Al día siguiente, lave las membranas tres veces con TBST, dejando diez minutos para cada lavado. A continuación, detecte las bandas inmunolreactivas utilizando anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante en BSA al cinco por ciento. Posteriormente, incubar las membranas en los reactivos de luminol Western blot durante un minuto a temperatura ambiente.

Retire la membrana de la solución reactiva. Luego, retira el exceso de líquido con una toalla absorbente y colócalos en un protector de láminas de plástico. A continuación, coloque la membrana cubierta en un casete de película con el lado de la proteína hacia arriba.

Coloque una película de rayos X encima de las membranas y expóngase durante un minuto. En una cabina de seguridad biológica, haga una herida arrastrando una punta de pipeta estéril a través de los cultivos confluentes de HCEC transfectados con siRNA de control específico o codificado de HSP27. Inmediatamente después de herir, lavar las células dos veces con 1XPBS y mantenerlas en un medio de crecimiento del epitelio bronquial a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 24 horas.

24 horas después de la herida, tome la imagen de HCEC con un microscopio vertical a 100x y realice el aplanamiento de fondo usando el comando de filtro en el software de análisis de imágenes. Con el comando seleccionar mediciones, defina el área de interés con la forma poligonal del mismo tamaño que puede cubrir la herida inicial perpendicularmente de extremo a extremo. Luego, determine tres áreas de interés diferentes en el área herida de cada muestra.

Cuente automáticamente el número de celda en cada campo utilizando la opción de menú de medición de tamaño de recuento. El análisis de Western blot que se muestra aquí reveló que la expresión de HSP27 fosforilada y Akt fosforilada se redujo significativamente. Mientras que la expresión de espaldas aumentó significativamente en los HCEC transfectados con siRNA específicos de HSP27.

La expresión de HSP27 fosforilada se redujo en un 30 por ciento y un 40 por ciento en 10 nanomolares y 15 nanomolares de células transfectadas de siRNA específicas de HSP27, respectivamente, en comparación con las células transfectadas de siRNA de control. Además, la expresión de HSP27 no fosforilada se redujo en un 20 por ciento y un 30 por ciento en diez nanomolares y 15 nanomolares de células transfectadas de siRNA específicas de HSP27, respectivamente. El ensayo de herida direccional inducida por rasguño indicó que 24 horas después de la herida, las células transfectadas de siRNA específicas de HSP27 a 10 y 15 nanomolares exibidieron una migración reducida.

Además, las células transfectadas de ARNip específico de HSP27 sufrieron más muertes celulares apoptóticas y necróticas en comparación con las células transfectadas de siRNA de control codificadas que se muestran por citometría de flujo. Una vez dominada, la técnica de transfección de ARN se puede realizar en 24 horas si se realiza correctamente. Siguiendo estos procedimientos, se puede generar un episodio como el bloqueo de la boca para responder a preguntas adicionales como la función inicial de la proteína de choque térmico 27 en la cicatrización de heridas epiteliales de la córnea.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar el ARN interferente pequeño específico de la proteína de choque térmico 27 para evaluar el papel potencial de la proteína de choque térmico 27 en la cicatrización de heridas epiteliales de la córnea. No olvide que trabajar con ARN y reactivos interferentes pequeños puede ser peligroso y que siempre se deben usar precursores, como una cabina de seguridad biológica y una máscara protectora, mientras se realizan estos procedimientos.