Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales

El objetivo general es proporcionar un ensayo simple para medir la comunicación intercelular de unión gap a través de una población de células de mamíferos que pueda satisfacer una amplia gama de necesidades farmacológicas y toxicológicas in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología, como si un compuesto afecta el desarrollo o el mantenimiento de un tejido, al desregular la comunicación intercelular de la unión gap. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una evaluación sencilla y rápida de la función de la unión gap en una gran población de células en respuesta a tóxicos y toxinas.

La demostradora del procedimiento estará a cargo de Ajna Uzuni, asistente de investigación de pregrado de mi laboratorio. Para comenzar el experimento, siembre tres veces 10 a la quinta células epiteliales de hígado de rata WB-F344 en placas de cultivo de 35 milímetros de diámetro que contenían medio modificado de Eagle más 5% de suero fetal-bovino. Cultivar las células en una incubadora hasta que alcancen el 100% de confluencia y continuar con el tratamiento experimental de las células.

Para continuar con los experimentos de dosis-respuesta, agregue 10 microlitros y 20 microlitros de una solución madre de fenantreno de dos milimolares previamente preparada en acetonitrilo al 100%, y cuatro microlitros, seis microlitros y ocho microlitros de una solución madre de 20 milimolares de fenantreno en acetonitrilo al 100% a tres placas de células que contengan dos mililitros de medio de crecimiento por cada volumen agregado de solución madre. A continuación, agregue cuatro microlitros, seis microlitros, ocho microlitros, 10 microlitros y 20 microlitros de una solución al 100% de acetonitrilo a tres placas de células que contengan dos mililitros de medio de crecimiento por cada volumen agregado de solución de acetonitrilo para que sirva como control del vehículo. Después de agregar el acetonitrilo, incubar las placas.

Para realizar experimentos de respuesta al tiempo, agregue siete microlitros de una solución madre de 20 milimolares de fenantreno en acetonitrilo al 100% a tres placas de células, que contienen dos mililitros de medio de crecimiento para cada punto de tiempo. A continuación, añada siete microlitros de acetonitrilo al 100% a tres placas de células, que contengan dos mililitros de medio de crecimiento para cada punto de tiempo, para que sirvan como vehículo de control. Incuba las placas para cada punto de tiempo designado.

Deseche el medio de cultivo vertiéndolo suavemente. Enjuague las células con tres mililitros de PBS y decante o aspire entre enjuagues. Pipetear un mililitro de un miligramo por mililitro de colorante amarillo lucifer disuelto en PBS en cada placa celular.

Precargue el tinte en las células pellizcando el bisturí entre el dedo índice y el pulgar. Coloque el bisturí perpendicular a y a cinco milímetros del borde de la placa de cultivo y luego use la gravedad para permitir que el bisturí ruede suavemente desde este ángulo perpendicular a un ángulo de 15 grados. Haga rodar la cuchilla a través de una población de celdas en tres áreas diferentes de la placa total.

A continuación, incube las células con la solución LY durante tres minutos a temperatura ambiente. Decantar o aspirar el LY y enjuagar las células para eliminar todo el tinte extracelular y eliminar la fluorescencia de fondo extracelular. A continuación, añada 0,5 mililitros de una solución de formalina tamponada con fosfato al 4% para fijar las células.

Visualice las células fijas utilizando un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 200x. Alinee todas las placas de modo que la línea de indentación sea paralela al campo de visión horizontal. Se generaron una serie de imágenes SL-DT de células epiteliales hepáticas de rata WB-F344 tratadas con dosis crecientes de fenantreno.

La disminución en la migración del colorante fluorescente amarillo lucifer es causada por el aumento de las dosis de fenantreno, lo que demuestra la creciente inhibición inducida por tóxicos de la comunicación intercelular de unión gap, o GJIC. La fracción del control, o valores de FOC, obtenidos de las imágenes SL-DT se promedió, se analizó estadísticamente y luego se graficó. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como Western blots de proteínas de transducción única, para responder a preguntas adicionales.

Por ejemplo, ¿estos compuestos activan eventos mitogénicos de perforación celular?