Name: El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende el método FINA para aislar ADN genómico de sangre completa en menos de dos minutos sin centrifugación. Esta técnica de extracción en papel facilita el diagnóstico rápido de VIH mediante PCR cuantitativa.

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Este desarrollo de protocolo fue apoyado por la subvención 37774 de la Fundación Bill y Melinda Gates Grandes Desafíos en Salud Global. Los reactivos de PCR en tiempo real y el asesoramiento fueron proporcionados por Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. Las células 8E5-LAV fueron proporcionadas por el Laboratorio de Aseguramiento de Calidad de Virología, Rush Presbyterian; Centro Médico St. Luke's. La sangre VIH-1 negativa fue proporcionada por Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Gracias a Mark Fisher por su ayuda con la fotografía.

Ética declaración: Las muestras de sangre utilizadas en este estudio no se consideran como la investigación en seres humanos. Se obtuvieron los especímenes con fines de diagnóstico clínico, que estaban satisfechos, y se proporcionó la porción restante de estas muestras para el ensayo de la investigación de la FINA. Las muestras se codificaron de manera que los investigadores no fueron capaces de determinar fácilmente la identidad de los individuos. 1. Preparación de la FINA Preparación de muestras Módulo <ol><li> Preparar la almohadilla secante cortando un disco de algodón 100% de espesor de 35 x 35 mm 2 de unos 2,6 mm. Cortar una almohadilla por espécimen. </li><li> Preparar película de parafina de plástico con una cinta de soporte de papel por una pieza de corte de la película de parafina (25 mm (h) por 50 mm (W)) y después la perforación de un orificio de diámetro 7,14 mm en el centro de la cinta utilizando un martillo accionado perforadora. Preparar una cinta por espécimen. </li><li> Preparar una membrana de vidrio separador de sangre unido (membrana de captura) de disco por la perforación de un círculo de 8,35 mm de diámetroutilizando un martillo accionado perforadora. Perforar un disco por espécimen. El disco tiene una capacidad de retención de partículas de 2,3 micras. </li><li> Montar el módulo de preparación de la muestra de la FINA, coloque el disco de captura en el centro del papel secante con unas pinzas. Coloque la cinta de la película de parafina sobre el disco de captura de modo que el orificio de la cinta de parafina sale del centro del disco de captura expuesta. </li><li> Asegurar el máximo contacto entre el disco y la almohadilla de transferencia por el estiramiento de la cinta de parafina ligeramente para cubrir la almohadilla de transferencia y presionando la cinta de parafina firmemente que se pegue a la almohadilla de transferencia alrededor de todos los bordes del disco. </li><li> Hacer tantos módulos como sea necesario para el experimento o de las existencias para su uso futuro. </li></ol> 2. Preparación de qPCR Tubo <ol><li> Prepare un disco de cinta 5.1 mm que anclar la membrana de captura de células al lado del tubo de qPCR para evitar que la membrana desde el bloqueo de la detección de la fluorescencia por la perforación de un círculo de Polié de doble revestimientoster cinta de diagnóstico con un martillo accionado punzón partir de una lámina de la cinta. Preparar un disco de cinta por espécimen. </li><li> Retire un lado del forro de la etiqueta engomada de la cinta. Coloque la cinta en un 200 l tubo de PCR, pegándolo sobre un lado y hacia la parte inferior del tubo. Retire el segundo revestimiento de etiqueta. El tubo está ahora lista para recibir el disco preparado. </li><li> Producir tantos tubos como sea necesario para el experimento o de las existencias para su uso futuro. </li></ol> 3. Contrive Sangre de muestras Nota: Si se está preparando una muestra de prueba genuina, continúe con el paso 4. <ol><li> Descongelar las células 8E5-LAV 15 que albergan una sola copia de los provirus VIH-1 obtenidos del Laboratorio de Control de Calidad de Virología (VQA; fiebre del Presbyterian / St Centro Médico de Lucas, Chicago, IL.). Nota: Se almacenan como sedimentos de células congeladas a una concentración de 4.000 células / l. Recuento de células fue verificada como se ha descrito anteriormente 9. </li><li> preparar Serdilución ial en medio de congelación (suero de 90% de bovino fetal, 10% de sulfóxido de dimetilo) a concentraciones que van de 1 a 400 células / mL. </li><li> Pipetear 10 células mu l de cada una de las diluciones en serie en un tubo de microcentrífuga. Añadir 100 l de fresco VIH-1 EDTA negativo tratado muestra de sangre entera a cada tubo para crear una curva patrón de número de copias de 8E5-LAV 10-4,000. Mezclar con un movimiento rápido suavemente la parte inferior del tubo 5 veces. </li></ol> 4. Realizar la FINA Extracción <ol><li> células de la sangre Lyse mediante la adición de Triton-X100) a una concentración final de 1% (11 l 10% de Triton-X100 para 110 l de sangre completa y células de la etapa 3.3). </li><li> Mezclar con un movimiento rápido suavemente la parte inferior del tubo 5 veces. La sangre debe ponerse en rojo translúcido. </li><li> Pipet todo de la muestra de sangre en el disco de captura. Nota: un sello hermético entre la cinta de parafina y la membrana de captura se asegura de que la sangre fluye a través de la membrana, y un buen contacto entre la captura membrane y secante conjunto de almohadilla asegura una rápida absorción de la muestra. </li><li> Deje que la muestra penetre a través del filtro. Nota: Las mechas de lisado de sangre en la almohadilla de transferencia debido a la acción capilar, la captura del ADN genómico en la superficie del disco de captura. El lisado se ha empapado en el disco cuando aparece mate. </li><li> Añadir 600-1000 l de NaOH 10 mM gota a gota en el disco de captura. Nota: El tampón de lavado también se puede añadir como una adición mayor de 600 l. El tampón se formará una gotita en la cinta de parafina hidrófoba y la mecha a través del agujero en el disco en aproximadamente 20 segundos. El filtro cambiará de rojo a blanco indicando la liquidación de la hemoglobina. </li><li> Separar el disco de la almohadilla de transferencia con unas pinzas y aplicar el disco a la cinta en el tubo de PCR preparado. Si hay cualquier color rojo a la izquierda en el filtro de añadir 50 a 100 l de tampón de lavado para limpiar el filtro antes de colocar en el tubo. Nota: Con poca frecuencia, el exceso de presión aplicada durante la preparación dela FINA módulos resultados en la partición de las capas de la membrana durante la separación del papel secante. Desechar estos discos y preparar una muestra fresca. </li><li> Después de que el filtro se coloca en el tubo de PCR, análisis de las muestras de inmediato. Alternativamente, secar durante la noche en una caja que contiene calcio desecante sulfato, a continuación, la tapa y colóquelo en una bolsa de aluminio con desecante de sílice y la tienda hasta que esté listo para su análisis. </li></ol> 5. Reacción qPCR <ol><li> Preparar 100 l qPCR mezcla maestra de reacción usando por VIH cebadores y sondas específicas como se describió previamente 9,11. Incluir un control interno de amplificación para monitorear la presencia de inhibidores de la amplificación y para verificar que una muestra negativa es un verdadero negativo. Asegúrese de que el filtro está completamente cubierta de mezcla maestra y que el filtro se mantiene fijo a lado del tubo a lo largo de la reacción. </li><li> Realizar la amplificación usando un dispositivo de PCR en tiempo real como se describió anteriormente 9. </li></ol>

<ol><li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li>
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<li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+Med+J%22%5BJournal%5D)">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

EID relacionado con el acceso rápido tratamiento se ha demostrado para reducir la mortalidad infantil debida a la infección por el VIH 16. Debido a la persistencia de anticuerpos maternos en sangre de un bebé, pruebas rápidas de anticuerpos del VIH tienen una utilidad limitada en la determinación de la condición de los niños expuestos al VIH. La OMS recomienda que todos los niños nacidos de madres VIH-1 positivas se deben probar a las 4-6 semanas de edad, usando una prueba virológica 17. Hemos info...

Varios informes han analizado el desarrollo de métodos de extracción de papel o basados ​​en membranas para uso en el punto de atención (PDA) dispositivos de 1-5 con el objetivo de hacer la exquisita sensibilidad y especificidad del diagnóstico molecular disponible para todos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) Enfermedades de Transmisión Sexual Diagnóstico Iniciativa acuñó el término ASSURED (asequibles sensible, específico, fácil de usar, rápido y robusto, libre de Equipo y se entrega a aquellos que lo necesitan,) para describir las características ideales de un POC prueba 6. De estas directrices, la característica libre de equipo es particularmente difícil de alcanzar para el diagnóstico molecular. Sin embargo, todas las innovaciones en el campo avanzará el objetivo de llegar a los más necesitados, y no hay esperanza para mejoras a corto plazo en el rendimiento de la prueba mediante la adaptación de la tecnología existente 7. Aquí se describe un protocolo sencillo para la extracción de ADN a partir de sangre enteraque no requiere la química compleja o instrumentación de laboratorio. La FINA (aislamiento de filtración de los ácidos nucleicos) Método de preparación de la muestra fue desarrollado originalmente para extraer el ADN de leucocitos de la sangre entera con el fin de detectar el provirus VIH-1 como parte de un punto de atención (POC) de muestra a respuesta PCR cuantitativa (qPCR) plataforma de diagnóstico infantil precoz (EID) para su uso en entornos de recursos limitados 8-11. Extracción FINA difiere de los métodos de purificación convencionales que utilizan membranas de sílice o partículas paramagnéticas recubiertas de sílice para unirse de forma reversible de ADN en presencia de agentes caotrópicos 12. En su lugar, utiliza FINA filtración vertical, a través de una membrana de separación para extraer el ADN celular de la sangre completa directamente. La membrana que contiene el ADN atrapado se puede colocar directamente en un tubo de PCR y, o bien inmediatamente utilizado en una reacción de PCR o se seca al aire para la amplificación posterior 9. No hay agentes caotrópicos, fenol, o alcoholes se utilizan en la extracción de la muestra, Eliminating las extensas etapas de lavado necesarias para eliminar los inhibidores de la qPCR potentes derivados del proceso de extracción de 13,14. La membrana FINA puede capturar cualquiera de las células 9 o el ADN genómico liberado por lisis celular 11 antes de añadir la muestra a la membrana. Para la captura de células, se añade la sangre total directamente a la membrana. Las células se lisan posteriormente en la membrana mediante la adición de NaOH 10 mM. La ventaja de este método es que implica sólo 3 pasos: 1) adición de la muestra; 2) la lisis celular / lavado y 3) la colocación disco de filtro en el tubo de qPCR. El inconveniente de este método es que la membrana sólo puede contener un número definido de células directamente proporcional al diámetro del disco de membrana. Para llegar al límite de detección requerido para la EID, se requiere 100 l de sangre entera para la entrada de muestra, que implica un filtro que es demasiado grande para ser colocado en un tubo de qPCR. Lisis de las células de la sangre con detergente antes de añadir la muestra a la colecciónmembrana añade una etapa de procesamiento, pero permite el uso de un filtro más pequeño para el mismo tamaño de la muestra. Hemos sido capaces de demostrar una alta reproducibilidad, la detección de copia única, y la cuantificación de tan poco como 10 copias de VIH-1 El material de ADN de 100 l de sangre utilizando esta configuración de prueba 11. En este informe se describe el protocolo de la FINA como originalmente desarrollado para uso en laboratorio. El sándwich de membrana / filtro conocido como el módulo de preparación de la muestra FINA se puede preparar en grandes lotes y almacenadas para su uso posterior. Cuando las muestras se van a extraer este proceso tarda 2 min y se puede realizar en diferentes lotes de tamaño. El qPCR se puede ejecutar inmediatamente o los filtros que contienen el ADN integrado puede ser almacenado hasta que es conveniente para llevar a cabo qPCR. Este método es muy conveniente para el análisis de rutina de muestras en ambos ajustes de alta y baja de los recursos.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 almohadilla secante</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M Cinta diagnóstica de poliéster de doble capa&nbsp;</td><td>3M Especialidades Médicas</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 y micro; l Tubos de tira de qPCR</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>tapas de tiras ópticas</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p Sistema de qPCR</td><td></td><td></td> Hidróxido de sodio 401456 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich 221465</td><td></td><td>Reactivo A.C.S.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich</td><td></td><td>D8418</td><td>para biología molecular</td></tr><tr><td>suero fetal bovino, certificado, de origen estadounidense</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Perforadora pequeña accionada por martillo Diámetro de agujero de 3/16" (5,1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>Perforadora pequeña accionada por martillo de 1/4" de diámetro (7,14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>Perforadora de agujeros pequeños accionada por martillo de 5/16" de diámetro (8,35 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: a extracción de adn método sencillo y rápido

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, el aislamiento de los ácidos nucleicos de filtración, es un nuevo método de extracción que utiliza filtración vertical, a través de una membrana de separación y la almohadilla absorbente para extraer el ADN celular de la sangre total en menos de 2 min. La muestra de sangre se trata con detergente, se mezclaron brevemente y se aplicó mediante una pipeta a la membrana de separación. El lisado absorbe en la almohadilla de transferencia debido a la acción capilar, la captura del ADN genómico en la superficie de la membrana de separación. El ADN extraído se retiene en la membrana durante un simple paso de lavado en el que los inhibidores de la PCR son malvados en el papel secante absorbente. Se añade entonces la membrana que contiene el ADN atrapado a la reacción de PCR sin purificación adicional. Este sencillo método no requiere equipos de laboratorio y se puede implementar fácilmente con suministros de laboratorio de bajo costo. Aquí se describe un protocolo para la detección altamente sensible y cuantificación de VIH-1 DNA proviral de todo 100 l de sangre como un modelo para principios deFANT diagnóstico del VIH que podrían ser fácilmente adaptado a otras dianas genéticas.

El flujo de trabajo para la extracción de ADN proviral de sangre total enriquecida con células 8E5-LAV se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra el módulo de muestra de FINA y prepararon tubo qPCR. Este método permite la amplificación eficiente de VIH-1 provirus a partir de células 8E5-LAV en diferentes números de copias, como se muestra en la curva estándar de muestras artificiales (Figura 3). PCR tenía una eficiencia del 103%, com...

Se describe aquí un método de extracción de ADN basado en papel simple y rápida del ADN proviral del VIH de la sangre total detectado por PCR cuantitativa. Este protocolo se puede extender para su uso en la detección de otros marcadores genéticos o el uso de métodos de amplificación alternativos.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

El objetivo general de este método FINA, que significa aislamiento por filtración de ácidos nucleicos, es aislar ADN genómico para la amplificación por PCR a partir de muestras complejas de forma rápida y sencilla, sin utilizar instrumentación de laboratorio como una centrífuga. Este método rápido de extracción de ADN basado en papel, desarrollado para el ADN proviral del VIH, fue diseñado para su incorporación en un dispositivo diagnóstico de PCR cuantitativa. La principal ventaja de esta técnica es que los módulos de preparación de muestras y los tubos de PCR pueden prepararse por anticipado, de modo que la extracción de ADN dura menos de dos minutos.Primero desarrollamos este método para incorporarlo en una muestra con el fin de realizar una prueba de diagnóstico temprano del VIH-1 a partir de sangre obtenida mediante punción en el talón. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque retirar el respaldo de la cinta de doble cara que sujeta la membrana de captura celular al costado del tubo de PCR requiere práctica. El procedimiento será demostrado por Jen Reed, una técnica sénior de mi laboratorio.Comience este procedimiento preparando los m

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una herramienta y química se describen para aislar secuencialmente ácidos nucleicos seguido de proteínas a partir de una muestra sin la necesidad de electricidad. La herramienta consta de un sorbente a cabo dentro de una pipeta de transferencia, mientras que las químicas de aislamiento se basa en los principios de extracción en fase sólida. Las macromoléculas aisladas pueden ser analizados mediante ensayos de inmuno-basados ​​y basado en la PCR.

Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas

Fuente: Dembowski, J. A., et al. Purificación de ADN viral para la identificación de proteínas virales y celulares asociadas. J. Vis. Exp. (2017).Este video demuestra el aislamiento de complejos de ADN viral–proteína a partir de núcleos celulares mediante química click y purificación con perlas magnéticas. El protocolo incluye la marcación de genomas virales con nucleótidos modificados con alquino, biotinilación mediante una reacción click y unión a perlas magnéticas recubiertas con...

Aislamiento de proteínas a partir de complejos ADN viral-proteína

Describimos una metodología para el procesamiento de sangre total para obtener una variedad de componentes para su posterior análisis. Hemos optimizado un protocolo simplificado que permite el procesamiento simultáneo rápido y de alto rendimiento de muestras de sangre completa en un entorno no clínico.

Fraccionamiento rápida y aislamiento de componentes de sangre total en las muestras obtenidas a partir de una configuración basada en la comunidad

Aquí, presentamos un protocolo para la extracción de ácidos nucleicos de virus rápido de la sangre virus inactivado. La extracción se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad. El método no es dependiente de laboratorios y puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales).

Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos

Este protocolo describe un método rentable para acelerar la extracción de ADN plasmid. Utilizando racks personalizados impresos en 3D compatibles con rotores estándar de placas de cubo oscilante, los investigadores pueden procesar hasta 48 columnas de giro con condensadores o hasta 116 columnas de giro sin condensadores simultáneamente, reduciendo significativamente el tiempo de manipulación en comparación con los métodos manuales de microcentrífuga.

Extracción de ADN en columna de rendimiento medio usando racks de 24 pozos

El uso de sistemas de NanoDrop microvolumen como alternativa práctica y eficaz a la tradicional metodología de cuantificación de ácidos nucleicos se describe a través de la demostración de dos protocolos de ácido nucleico microvolumen cuantificación.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Esta comunicación se presentan datos sobre la precisión y la reproducibilidad de los BioSpec nano-Espectrofotómetro UV-VIS de ADN de doble cadena y cuantificación de proteínas. Incluso con ultra-pequeños volúmenes (1 a 2 L), la reproducibilidad es excelente, mientras que la función de limpieza automática mejora el rendimiento y los resultados en un mínimo de arrastre para obtener resultados más precisos.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Aprende el método FINA para aislar ADN genómico de sangre completa en menos de dos minutos sin centrifugación. Esta técnica de extracción en papel facilita el diagnóstico rápido de VIH mediante PCR cuantitativa.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

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