El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

El objetivo general de este método FINA, que significa aislamiento por filtración de ácidos nucleicos, es aislar el ADN genómico para la amplificación por PCR de muestras complejas de forma rápida y sencilla, sin el uso de instrumentación de laboratorio, como una centrífuga. Este método rápido de extracción de ADN en papel para el ADN pro viral del VIH se desarrolló para su incorporación en un dispositivo de diagnóstico de PCR cuantitativa. La principal ventaja de esta técnica es que los módulos de preparación de muestras y los tubos de PCR se pueden preparar con antelación, por lo que la extracción de ADN tarda menos de dos minutos.

Primero desarrollamos este método para incorporarlo a una muestra para responder a la prueba de diagnóstico infantil temprano para VIH-1 a partir de sangre de talón. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque quitar el respaldo de la cinta de doble cara que sostiene la membrana de captura celular al costado del tubo de PCR requiere práctica. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Jen Reed, una técnica sénior de mi laboratorio.

Comience este procedimiento preparando los materiales necesarios para ensamblar el módulo de preparación de muestras de la FINA. Prepare la almohadilla secante cortando un cuadrado de 35 por 35 milímetros de una almohadilla de algodón 100% de 2,6 milímetros de grosor. Prepare una película plástica de parafina con una cinta adhesiva de papel.

Corta un pedazo de película de parafina de 25 por 50 mm y luego usa un martillo para perforar un agujero de 7,14 mm de diámetro en el centro de la cinta. Prepare una membrana separadora de sangre de vidrio unida o un disco de captura utilizando un martillo para perforar un círculo de 8,35 mm de diámetro. Para ensamblar el módulo de preparación de muestras de la FINA, use pinzas para colocar el disco de captura en el centro de la almohadilla secante.

Retire el soporte de la cinta de película de parafina y colóquela sobre el disco de captura de modo que toda la cinta de parafina deje expuesto el centro del disco de captura. Asegure el máximo contacto entre el disco y la almohadilla secante estirando ligeramente la cinta de parafina para cubrir la almohadilla secante y presionando firmemente la cinta de parafina para pegarla a la almohadilla secante alrededor de todos los bordes del disco. Se requiere un disco de cinta de 5,1 mm para anclar la membrana de captura al lado del tubo de qPCR para evitar que la membrana bloquee la detección de fluorescencia del instrumento de PCR en tiempo real.

Prepare este disco de cinta con un martillo para perforar un círculo de cinta diagnóstica de poliéster de doble capa a partir de una hoja de la cinta. Con unas pinzas, retire un lado del revestimiento de la pegatina de la cinta. Coloque la cinta en un tubo de PCR de 200 microlitros, pegándolo en un lado y hacia el fondo del tubo.

Retira el segundo revestimiento de la pegatina. El tubo ya está listo para recibir el disco preparado. En este vídeo se demostrará la detección de ADN proviral a partir de sangre total enriquecida con células LAV 8e5.

Descongele los gránulos de celda 8e5 LAV previamente congelados en hielo. Prepare una dilución en serie de las células en medio de congelación con concentraciones que oscilan entre 1 y 400 células por microlitro. Pipetear 10 microlitros de células de cada una de las diluciones en un tubo de microcentrífuga.

Agregue 100 microlitros de muestra fresca de sangre entera tratada con eDTA VIH-1 negativo a cada tubo para crear una curva estándar. Mezcle golpeando suavemente el fondo del tubo cinco veces. Para comenzar el procedimiento de extracción de ADN, lise las células sanguíneas agregando tritón X-100 hasta una concentración final del uno por ciento.

Mezcle golpeando suavemente el fondo del tubo cinco veces. La sangre debe volverse de un rojo translúcido. Pipetear toda la muestra de sangre en el disco de captura.

Un sello hermético entre la cinta de parafina y la membrana de captura asegura que la sangre fluya a través de la membrana. Y el buen contacto entre la membrana de contacto y el conjunto de la almohadilla secante garantiza una rápida absorción de la muestra. Deje que la muestra penetre a través del filtro.

El lisado de sangre se ha empapado en el disco de captura y el disco aparece mate. Agregue de 600 a 1.000 microlitros de hidróxido de sodio de 10 mmol gota a gota en el disco de captura. El filtro cambiará de rojo a blanco, lo que indica la eliminación de hemoglobina.

A continuación, separe el disco de la almohadilla secante y aplique el disco a la cinta en el tubo de PCR preparado. Después de colocar el filtro en el tubo de PCR, analice la muestra de inmediato. Prepare la mezcla maestra de qPCR como se describe en el texto del protocolo y asegúrese de que el filtro esté completamente cubierto con la mezcla maestra y permanezca fijo al lado del tubo durante toda la reacción.

Realice la amplificación utilizando un dispositivo de PCR en tiempo real como se describe en el texto del protocolo. Alternativamente, si no se puede realizar qPCR, seque inmediatamente el filtro durante la noche en una caja que contenga sulfato de calcio desecante. Al día siguiente, tape y coloque el tubo de PCR en una bolsa de aluminio con desecante de sílice y guárdelo a temperatura ambiente hasta que esté listo para el análisis.

Este método permite la amplificación eficiente del provirus VIH-1 a partir de células 8e5 LAV con diferentes números de copias. Las líneas sólidas son parcelas de amplificación obtenidas a partir de cuatro réplicas de sangre total VIH-1 negativa enriquecidas con 4, 000, 400, 40 y 10 células LAV 8e5 con 500 copias por reacción del control interno. La línea punteada indica el umbral.

El siguiente gráfico muestra las curvas estándar de los valores del ciclo de cuantificación calculados a partir del gráfico de amplificación vs. log número de copias de 8e5 células LAV por cada 100 microlitros de sangre total. La eficiencia de la PCR calculada fue del 103%Las réplicas de la curva estándar de ADN proviral del VIH también tienen una amplificación altamente reproducible.

Además, la presencia de un control interno de 500 copias de hidroxipiruvato reductasa muestra que no hay inhibición de la PCR como resultado de la extracción de sangre con este método, independientemente del número de copias de provirus VIH-1 presentes. Las líneas continuas representan los gráficos de amplificación y la línea punteada representa el umbral. Siguiendo este procedimiento, los objetivos de PCR se pueden amplificar a partir de varios tipos de muestras para detectar el gen de interés.

Por ejemplo, hisopos de mejillas para el cribado farmacogenético o sangre para el genotipado rápido de modelos animales. No olvide que trabajar con patógenos transmitidos por la sangre puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones universales al realizar este procedimiento.