El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

El objetivo general de este método FINA, que significa aislamiento por filtración de ácidos nucleicos, es aislar ADN genómico para la amplificación por PCR a partir de muestras complejas de forma rápida y sencilla, sin utilizar instrumentación de laboratorio como una centrífuga. Este método rápido de extracción de ADN basado en papel, desarrollado para el ADN proviral del VIH, fue diseñado para su incorporación en un dispositivo diagnóstico de PCR cuantitativa. La principal ventaja de esta técnica es que los módulos de preparación de muestras y los tubos de PCR pueden prepararse por anticipado, de modo que la extracción de ADN dura menos de dos minutos.

Primero desarrollamos este método para incorporarlo en una muestra con el fin de realizar una prueba de diagnóstico temprano del VIH-1 a partir de sangre obtenida mediante punción en el talón. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque retirar el respaldo de la cinta de doble cara que sujeta la membrana de captura celular al costado del tubo de PCR requiere práctica. El procedimiento será demostrado por Jen Reed, una técnica sénior de mi laboratorio.

Comience este procedimiento preparando los materiales necesarios para armar el módulo de preparación de muestras FINA. Prepare la almohadilla de absorción cortando un cuadrado de 35 por 35 milímetros de una almohadilla de algodón al 100% de 2,6 milímetros de grosor. Prepare la película plástica de parafina con una cinta de respaldo de papel.

Corte un trozo de película de parafina de 25 por 50 mm y luego use un martillo para perforar un orificio de 7,14 mm de diámetro en el centro de la cinta. Prepare una membrana de separación de sangre de vidrio unida o un disco de captura perforando un círculo de 8,35 mm de diámetro con un martillo. Para armar el módulo de preparación de muestras FINA, use pinzas para colocar el disco de captura en el centro de la almohadilla de absorción.

Retire el respaldo de la cinta de película de parafina y colóquela sobre el disco de captura de manera que toda la cinta de parafina deje expuesto el centro del disco de captura. Asegure el máximo contacto entre el disco y la almohadilla de transferencia estirando ligeramente la cinta de parafina para cubrir la almohadilla y presionando firmemente la cinta contra la almohadilla alrededor de todos los bordes del disco. Se requiere un disco de cinta de 5,1 mm para anclar la membrana de captura al costado del tubo de qPCR y evitar que la membrana bloquee la detección de fluorescencia del instrumento de PCR en tiempo real.

Prepare este disco de cinta utilizando un martillo para perforar un círculo de cinta diagnóstica de poliéster doble cara a partir de una hoja de la cinta. Con pinzas, retire un lado del forro protector de la cinta adhesiva. Coloque la cinta en un tubo PCR de 200 microlitros, adheriéndola a un lado y hacia el fondo del tubo.

Retire el segundo forro adhesivo. El tubo ya está listo para recibir el disco preparado. En este video se demostrará la detección de ADN proviral a partir de sangre total enriquecida con 8e5 células LAV.

Descongele los pellet de células LAV 8e5 previamente congelados sobre hielo. Prepare una dilución seriada de las células en medio de congelación con concentraciones que varían desde 1 hasta 400 células por microlitro. Pipetee 10 microlitros de células de cada una de las diluciones en un tubo microcentrífugo.

Agregue 100 microlitros de muestra fresca de sangre total tratada con eDTA y negativa para VIH-1 a cada tubo para crear una curva patrón. Mezcle golpeando suavemente la base del tubo cinco veces. Para iniciar el procedimiento de extracción de ADN, lisar las células sanguíneas agregando Tritón X-100 hasta una concentración final del uno por ciento.

Mezcle agitando suavemente la parte inferior del tubo cinco veces. La sangre debe volverse roja translúcida. Pipetee la muestra completa de sangre sobre el disco de captura.

Un sello hermético entre la cinta de parafina y la membrana de captura garantiza que la sangre fluya a través de la membrana. Y un buen contacto entre la membrana de contacto y el conjunto del pad absorbente asegura una absorción rápida de la muestra. Permita que la muestra se impregne a través del filtro.

El lisado sanguíneo ha penetrado en el disco de captura y este presenta una apariencia mate. Añada de 600 a 1.000 microlitros de hidróxido de sodio 10 mmol gota a gota sobre el disco de captura. El filtro cambiará de color rojo a blanco, lo que indica la eliminación de la hemoglobina.

A continuación, separe el disco de la almohadilla de absorción y coloque el disco sobre la cinta en el tubo PCR preparado. Una vez colocado el filtro en el tubo PCR, analice la muestra inmediatamente. Prepare la mezcla maestra de qPCR según se describe en el texto del protocolo y asegúrese de que el filtro quede completamente cubierto con la mezcla maestra y permanezca fijo al costado del tubo durante toda la reacción.

Realice la amplificación utilizando un dispositivo de PCR en tiempo real según se describe en el texto del protocolo. Alternativamente, si no se puede realizar la PCR cuantitativa inmediatamente, seque el filtro durante la noche en una caja que contenga desecante de sulfato de calcio. Al día siguiente, tape el tubo de PCR y colóquelo en una bolsa de aluminio con desecante de sílice, y guárdelo a temperatura ambiente hasta que esté listo para su análisis.

Este método permite la amplificación eficiente del provirus del VIH-1 a partir de células 8e5 LAV con diferentes números de copias. Las líneas continuas son gráficos de amplificación obtenidos de cuatro réplicas de sangre total negativa para el VIH-1, enriquecida con 4.000, 400, 40 y 10 células 8e5 LAV, con 500 copias por reacción del control interno. La línea punteada indica el umbral.

El siguiente gráfico muestra curvas estándar de los valores del ciclo de cuantificación calculados a partir de la gráfica de amplificación frente al logaritmo del número de copias de 8e5 células LAV por 100 microlitros de sangre completa. La eficiencia calculada de la PCR fue del 103 %. Las réplicas de la curva estándar de ADN proviral del VIH también presentan una amplificación altamente reproducible.

Además, la presencia de un control interno de 500 copias de hidroxipiruvato reductasa muestra que no existe inhibición de la PCR derivada de la extracción de sangre con este método, independientemente del número de copias del provirus del VIH-1 presentes. Las líneas continuas representan los gráficos de amplificación y la línea punteada representa el umbral. Siguiendo este procedimiento, se pueden amplificar dianas de PCR a partir de diversos tipos de muestras para detectar su gen de interés.

Por ejemplo, hisopados de mejilla para la detección farmacogenética o sangre para la genotipificación rápida de modelos animales. No olvide que trabajar con patógenos transmitidos por la sangre puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones universales al realizar este procedimiento.