Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

El objetivo general de este protocolo es desarrollar un método para el cribado rápido y automatizado de alto rendimiento de protoplastos vegetales, específicamente para abordar el cuello de botella actual en el cribado temprano de un gran número de objetivos de edición del genoma y silenciamiento génico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biotecnología vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que permite la producción y transformación automatizada de protoplastos de alto rendimiento para el cribado paralelo rápido de la función del promotor en la expresión génica.

Este procedimiento se demostrará utilizando el cultivo en suspensión de tabaco amarillo brillante dos, o BY-2, ampliamente utilizado. Comience cultivando un cultivo de BY-2 en un matraz Erlenmeyer, como se describe en el texto del protocolo. El día del aislamiento del protoplasto, mezcle bien el cultivo, ya que las células se asentarán rápidamente, y transfiera seis mililitros del cultivo a un tubo centrífugo de fondo cónico de 15 mililitros.

Deje que las células se asienten durante al menos 10 minutos. Ajuste el volumen de la celda empaquetada al 50% del volumen total eliminando el volumen apropiado de sobrenadante. Agite el tubo invirtiéndolo y luego use pipetas de diámetro ancho para pipetear 500 microlitros de suspensión celular en cada pocillo de una placa de seis pocillos para la digestión.

El primer paso en este procedimiento es encender todos los componentes del sistema robótico, que son el motor de microplacas, el manipulador de líquidos, el lector de placas multimodo, el dispensador multimodo, el calentador o enfriador de placas y las computadoras. A continuación, abra el software de programación de tareas del motor de placas que integra el transportador de microplacas con el otro equipo para permitir la transferencia de placas entre cada pieza del equipo. En el software de movimiento de placas, defina las especificaciones técnicas para el material de laboratorio utilizado en el protocolo.

Haga clic en Configuración en la barra de herramientas principal y seleccione el comando Administrar tipos de contenedores. Seleccione el tipo de contenedor adecuado de la lista de tipos de contenedor existentes. Defina las especificaciones técnicas de todo el material de laboratorio que encontrará el transportador de placas.

El siguiente paso es definir las posiciones de inicio y fin de cada contenedor. Haga clic en la pestaña Inicio/Fin en un protocolo específico. Seleccione la posición de inicio de cada contenedor y marque la casilla Lidded, Unlidded en las posiciones Start y Fin.

Después de definir las posiciones de inicio y fin para cada pieza de material de laboratorio, cargue manualmente todas las placas en la posición inicial para todo el flujo de trabajo. Cargue las placas de cribado fluorescente de 96 pocillos en el hotel dos, las placas de seis pocillos con celdas BY-2 en el hotel tres, una placa de 96 pocillos de profundidad que se utilizará para la transformación en el nido dos del calentador o enfriador de placas, y un tubo cónico de 50 mililitros que contiene la solución enzimática en el dispensador multimodo. Para llevar a cabo la transformación en el protocolo, precargue cada pocillo de la placa de 96 pocillos de profundidad con 10 microlitros de ADN plasmático que contiene la construcción reportera de proteína fluorescente naranja e incube en el calentador o enfriador de placas a cuatro grados Celsius.

Cargue todos los suministros y placas en la plataforma automatizada de manejo de líquidos en las ubicaciones designadas. Cargue una placa de 96 pocillos precargada con 200 microlitros de una solución de polietilenglicol al 40% por pocillo en la columna uno. Cargue una caja de puntas de pipeta en el nido ocho.

Para definir la ubicación de cada elemento en el software de las plataformas automatizadas de manejo de líquidos, seleccione Herramientas en el menú y haga clic en Editor de material de laboratorio. Seleccione el tipo de material de laboratorio en el menú desplegable. Seleccione la pestaña Protocolo principal y haga clic en Configurar material de laboratorio para definir la posición de cada pieza de material de laboratorio.

Haga clic en Ejecutar para inicializar todos los dispositivos que se utilizarán en el protocolo. Finalmente, en la ventana Explorador de trabajo, haga clic en Agregar unidad de trabajo para verificar todo el material de laboratorio en el sistema y comenzar el protocolo automatizado. La parte más sensible del procedimiento es la transformación del protoplasto.

Dado que la transformación la realiza el sistema robótico, es fundamental que los protocolos automatizados se configuren correctamente. A los efectos de este vídeo, solo se mostrarán los pasos seleccionados en los protocolos automatizados. Durante el protocolo de transformación, la plataforma automatizada de manejo de líquidos aspira 70 microlitros de la solución de protoplast de la placa de seis pocillos y la dispensa en la placa de 96 pocillos de profundidad en el nido seis.

A continuación, se utilizan nuevas puntas de pipeta para aspirar lentamente 70 microlitros de la solución de polietilenglicol de alta viscosidad de la placa de pocillos profundos precargada y dispensar completamente la solución en los pocillos correspondientes de la placa de pocillos profundos. A continuación, la plataforma automatizada de manejo de líquidos mueve la placa de pozo profundo desde los siguientes seis hasta el nido nueve, donde el transportador de placas recoge la placa y la mueve a la estación agitadora de placas y la agita a 1500 RPM durante 30 segundos. Después de una incubación de 20 minutos sin agitar para permitir el equilibrio de los protoplastos, el motor de placas mueve la placa de 96 pocillos de profundidad al dispensador multimodo y activa el protocolo de lavado.

Cuando se complete el protocolo automatizado de aislamiento y transformación de protoplastos, retire la placa con los protoplastos transformados del hotel uno del sistema robótico. Encienda el microscopio invertido, la cámara y la lámpara fluorescente. Seleccione el objetivo 10X para el enfoque inicial en los protoplastos.

Encienda la lámpara halógena y cierre el obturador de la lámpara fluorescente. Cargue la placa en el sistema de microscopio y concéntrese en los protoplastos utilizando el campo claro. A continuación, apague la bombilla halógena y abra el obturador de la lámpara fluorescente.

Seleccione el conjunto de filtros Cy3/TRITC para la visualización de la proteína fluorescente naranja expresada por los protoplastos transgénicos. Escanee cada pocillo para determinar el número de protoplastos que expresan el marcador fluorescente. La digestión enzimática de los protoplastos en las condiciones especificadas en este protocolo dio como resultado 2.820.000 protoplastos por placa de seis pocillos.

Se evaluó la pérdida en la concentración de protoplasto después de cada paso de transferencia en el protocolo. Después del protocolo de digestión, se transfirieron 11.500 protoplastos a cada pocillo de las 96 placas de pocillos de profundidad. Una vez finalizado el protocolo de transformación, se transfirieron 1.230 protoplastos a la placa de cribado fluorescente de 96 pocillos.

Para garantizar que las múltiples etapas de pipeteo no dañaran los protoplastos, se ensayó su viabilidad mediante tinción con yoduro de propidio. Los resultados no mostraron diferencias significativas en la viabilidad después de la digestión, después de la transferencia a la placa de cribado fluorescente de 96 pocillos y después del protocolo de transformación. El protocolo de transformación tuvo éxito en la generación de células transgénicas que expresan proteína fluorescente de color naranja, aunque la eficiencia de transformación fue baja, solo alrededor del 2%, esto se debe al gran plásmico binario utilizado y a que el protocolo no ha sido optimizado específicamente para los protoplastos BY-2.

Las métricas obtenidas para el curso del tiempo del protocolo mostraron que la mayor inversión de tiempo se gasta durante la etapa de digestión. La duración completa del aislamiento y la transformación del protoplasto fue de tres horas, 50 minutos y 53 segundos, sin necesidad de intervención externa por parte del operador. Una vez configurada correctamente, el robot puede realizar esta técnica en menos de cuatro horas.

Tras su desarrollo, esta técnica está allanando el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología vegetal realicen procedimientos genómicos de cultivos de alto rendimiento, como la edición del genoma y el cribado de promotores.