Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

El objetivo general de este protocolo es desarrollar un método para el cribado rápido y automatizado de alto rendimiento de protoplastos vegetales, específicamente para abordar el cuello de botella actual en la fase inicial de cribado de un gran número de dianas de edición del genoma y silenciamiento génico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biotecnología vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que permite la producción y transformación automatizadas de protoplastos a alto rendimiento, para el cribado rápido y paralelo de la función de promotores en la expresión génica.

Este procedimiento se demostrará utilizando el cultivo en suspensión ampliamente empleado de tabaco amarillo brillante dos, o BY-2. Comience cultivando un cultivo BY-2 en un matraz Erlenmeyer, como se describe en el texto del protocolo. El día del aislamiento de protoplastos, mezcle bien el cultivo, ya que las células se sedimentan rápidamente, y transfiera seis mililitros del cultivo a un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros.

Deje que las células sedimenten durante al menos 10 minutos. Ajuste el volumen celular empaquetado al 50 % del volumen total eliminando el volumen adecuado de sobrenadante. Agite el tubo invirtiéndolo y luego use pipetas de gran apertura para transferir 500 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de una placa de seis pocillos para la digestión.

El primer paso en este procedimiento consiste en encender todos los componentes del sistema robótico, que son el transportador de microplacas, el manipulador de líquidos, el lector de placas multimodal, el dispensador multimodal, el calentador o refrigerador de placas y las computadoras. A continuación, abra el software de programación de tareas del transportador de placas que integra el microtransportador con los demás equipos para permitir la transferencia de placas entre cada uno de ellos. En el software del transportador de placas, defina las especificaciones técnicas de los materiales de laboratorio utilizados en el protocolo.

Haga clic en Configuración en la barra de herramientas principal y seleccione el comando Administrar tipos de contenedores. Seleccione el tipo de contenedor adecuado de la lista de tipos de contenedores existentes. Defina las especificaciones técnicas para toda la material de laboratorio que encontrará el transportador de placas.

El siguiente paso consiste en definir las posiciones de inicio y fin para cada recipiente. Haga clic en la pestaña Inicio/Fin en un protocolo específico. Seleccione la posición de inicio de cada recipiente y marque la casilla correspondiente a Tapa, Sin tapa tanto en las posiciones de inicio como de fin.

Después de definir las posiciones de inicio y fin para cada pieza de material de laboratorio, cargue manualmente todas las placas en la posición inicial para todo el flujo de trabajo. Coloque las placas de cribado fluorescente de 96 pocillos en el hotel dos, las placas de seis pocillos con células BY-2 en el hotel tres, una placa de fondo profundo de 96 pocillos que se utilizará para la transformación en el nido dos del calentador o refrigerador de placas, y un tubo cónico de 50 mililitros que contenga la solución enzimática en el dispensador multiformato. Para llevar a cabo la transformación en el protocolo, precargue cada pocillo de la placa de fondo profundo de 96 pocillos con 10 microlitros de ADN plasmídico que contenga el constructo del reportero de proteína fluorescente naranja e incube en el calentador o refrigerador de placas a cuatro grados Celsius.

Cargue todos los materiales y placas en la plataforma automatizada de manipulación de líquidos en las ubicaciones designadas. Coloque una placa de 96 pocillos precargada con 200 microlitros de una solución de polietilenglicol al 40% por pocillo en la columna uno. Coloque una caja de puntas de pipeta en el nest ocho.

Para definir la ubicación de cada elemento en el software de las plataformas automatizadas de manipulación de líquidos, seleccione Herramientas en el menú y haga clic en Editor de material de laboratorio. Seleccione el tipo de material de laboratorio en el menú desplegable. Seleccione la pestaña Protocolo principal y haga clic en Configurar material de laboratorio para definir la posición de cada pieza de material de laboratorio.

Haga clic en Ejecutar para inicializar todos los dispositivos que se utilizarán en el protocolo. Finalmente, en la ventana Explorador de trabajo, haga clic en Agregar unidad de trabajo para verificar toda la vidriería de laboratorio en el sistema y comenzar el protocolo automatizado. La parte más sensible del procedimiento es la transformación de protoplastos.

Dado que la transformación es realizada por el sistema robótico, es fundamental que los protocolos automatizados se configuren correctamente. Para los fines de este video, solo se mostrarán pasos seleccionados de los protocolos automatizados. Durante el protocolo de transformación, la plataforma automatizada de manipulación de líquidos aspira 70 microlitros de la solución de protoplastos desde la placa de seis pocillos y los dispensa en la placa de 96 pocillos profundos en el nido seis.

Luego, se utilizan puntas de pipeta nuevas para aspirar lentamente 70 microlitros de la solución altamente viscosa de polietilenglicol desde la placa de pozos profundos precargada y dispensar completamente la solución en los pozos correspondientes de la placa de pozos profundos. A continuación, la plataforma automatizada de manipulación de líquidos mueve la placa de pozos profundos del nido seis al nido nueve, donde el transportador de placas toma la placa y la lleva a la estación de agitación, agitándola a 1500 RPM durante 30 segundos. Tras una incubación de 20 minutos sin agitación para permitir la equilibración de los protoplastos, el transportador de placas mueve la placa de 96 pozos profundos al dispensador multimodal y activa el protocolo de lavado.

Cuando finalice el protocolo automatizado de aislamiento y transformación de protoplastos, retire la placa con los protoplastos transformados del hotel uno del sistema robótico. Encienda el microscopio invertido, la cámara y la lámpara fluorescente. Seleccione el objetivo de 10X para enfocar inicialmente los protoplastos.

Encienda la lámpara de halógeno y cierre el obturador para la lámpara fluorescente. Coloque la placa en el sistema microscópico y enfoque los protoplastos utilizando campo claro. A continuación, apague la bombilla de halógeno y abra el obturador para la lámpara fluorescente.

Seleccione el juego de filtros Cy3/TRITC para la visualización de la proteína fluorescente naranja expresada por los protoplastos transgénicos. Examine cada pocillo para determinar el número de protoplastos que expresan el marcador fluorescente. La digestión enzimática de los protoplastos en las condiciones especificadas en este protocolo dio como resultado 2 820 000 protoplastos por placa de seis pocillos.

Se evaluó la pérdida en la concentración de protoplastos tras cada paso de transferencia en el protocolo. Después del protocolo de digestión, se transfirieron 11.500 protoplastos a cada pocillo de las placas de 96 pocillos profundos. Una vez completado el protocolo de transformación, se transfirieron 1.230 protoplastos a la placa de cribado fluorescente de 96 pocillos.

Para asegurarse de que varias etapas de pipeteo no dañaran los protoplastos, su viabilidad se evaluó mediante tinción con yoduro de propidio. Los resultados mostraron ninguna diferencia significativa en viabilidad tras la digestión, tras la transferencia a la placa de cribado fluorescente de 96 pocillos y tras el protocolo de transformación. El protocolo de transformación tuvo éxito en generar células transgénicas que expresan la proteína fluorescente naranja, aunque la eficiencia de transformación fue baja, solo alrededor del 2 %. Esto se debe al gran plásmido binario utilizado y a que el protocolo no ha sido optimizado específicamente para protoplastos BY-2.

Las métricas obtenidas para el curso temporal del protocolo mostraron que la mayor inversión de tiempo se realiza durante la etapa de Digestión. La duración completa del aislamiento y transformación de protoplastos fue de tres horas, 50 minutos y 53 segundos, sin necesidad de intervención externa por parte del operador. Una vez configurado adecuadamente, esta técnica puede ser realizada por el robot en menos de cuatro horas.

Tras su desarrollo, esta técnica está allanando el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología vegetal realicen procedimientos genómicos de alto rendimiento en cultivos, como la edición del genoma y la selección de promotores.