Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes volumétricas de células marcadas con proteínas fluorescentes en el interior de corazones intactos, para estudiar la función génica con resolución de una sola célula durante el desarrollo cardíaco y en corazones postnatales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave durante el desarrollo cardíaco, como el estudio de las funciones de los genes y ayudar a obtener imágenes con resolución de una sola célula durante el desarrollo cardíaco y los artefactos animidales. La principal ventaja de este método es que es relativamente simple, barato y pro-sabio en ese análisis temporal especial de las funciones de genes y proteínas a resolución de una sola célula en un embrión o corazón intacto.

Aunque usamos este sistema para estudiar el desarrollo del corazón en ratones, también se puede usar para estudiar otros sistemas de órganos, como los músculos, el cerebro y los pulmones, y también en otros organismos modelo. Aquí se utilizan embriones positivos para proteínas fluorescentes de madres de confeti R-26 Cre-RET2 tratadas con tamoxifren. Comience la tinción sumergiendo cada embrión fijado con paraformaldehído en un mililitro de 0,1% de PBST en los pocillos de una placa de 48 pocillos.

Incubar durante dos horas en un agitador de platos a temperatura ambiente para permeabilizar el tejido. A continuación, se sustituye la solución de permeabilización por un mL de tampón de bloqueo y se incuba, con agitación, durante dos horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, prepare una dilución de uno a 100 del anticuerpo específico de células endoteliales, PECAM, en 0,3 mililitros de tampón de bloqueo para cada pocillo y añádalo a los pocillos que contienen los embriones.

Incubar durante 48 horas con agitación a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lave los embriones cinco veces con PBST durante 30 minutos cada vez para eliminar el exceso de anticuerpos primarios del tejido. A continuación, sumerja los embriones en la solución secundaria de anticuerpos antivat de cabra Alexa Fluor 647 e incube agitándolos durante 48 horas a cuatro grados centígrados, mientras están protegidos de la luz.

48 horas más tarde, después del lavado previo, posfijar los embriones con PFA al 4% durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Luego, después de lavar dos veces con PBS durante cinco minutos cada vez, incubar los embriones con tinción nuclear DAPI durante diez minutos. Siga con dos lavados de PBS de cinco minutos cada uno, luego proceda a la limpieza del tejido.

La limpieza del tejido es el paso más crítico de este protocolo para obtener imágenes del corazón con una resolución de una sola célula. Además, la selección del método de limpieza, ya sea a escala o CUBIC, también es muy importante para preservar las señales fluorescentes en el corazón embrionario intacto. Transfiera los embriones lavados y manchados a un frasco de centelleo envuelto en papel de aluminio, que contiene un mililitro de solución de escala A2.

Incubar a cuatro grados centígrados con agitar suavemente de vez en cuando con la mano durante 48 horas. Después de la incubación de la escala A2, reemplace la solución en el vial con un mililitro de solución de escala B4 e incube a cuatro grados centígrados con agitaciones suaves ocasionales durante otras 48 horas. Incubar los embriones durante otras 48 horas con un mililitro de escala 70 a cuatro grados centígrados con sacudidas suaves ocasionales como antes.

Por último, sumerja la muestra aclarada a escala en un mililitro de glicerol al 90% y almacene a cuatro grados centígrados hasta la obtención de imágenes. Para obtener imágenes, transfiera la muestra a una placa de Petri con fondo de vidrio con una cantidad mínima de glicerol al 90% y obtenga imágenes con un microscopio confocal equipado con dos capacidades de fotones. Para el aclarado de CUBIC, sumerja cada embrión en un mililitro de CUBIC one con una suave agitación ocasional durante 48 horas a 37 grados centígrados.

Después de 48 horas, sustituya la solución por el mismo volumen de reactivo CUBIC fresco e incube la muestra durante 48 horas más, como antes. Después de la incubación, lavar los embriones tratados con PBS varias veces agitando suavemente con las manos para eliminar el exceso de solución CUBIC one. A continuación, sumergir los embriones en la solución CUBIC dos durante 48 horas a 37 grados centígrados con agitar suavemente las manos de vez en cuando.

Si va a haber un retraso antes de la toma de imágenes, incube secuencialmente las muestras con un mililitro de glicerol al 30%, 50% y 70% y PBS durante 30 minutos cada una. Después de pasar por la serie, transfiéralo a una solución de glicerol al 90% para almacenarlo a cuatro grados centígrados. Cuando esté listo, imagínese en una placa de Petri con fondo de vidrio con un 90% de glicerol, como antes.

Esta película muestra secciones ópticas de un corazón E 8.75 tratado con escalas, desde la superficie del corazón hasta el lumen. El amarillo marca la expresión de PECAM y todos los cardiomiocitos aparecen en verde. La profundidad es de 110,4 micras y hay 93 rodajas en total.

Esta es la imagen de la superficie en 3D del corazón reconstruido que se acaba de mostrar. De nuevo, el amarillo marca la expresión de PECAM y el verde marca todos los cardiomiocitos. Esta película muestra secciones de un solo clon progenitor de un corazón E 9.5 tratado a escala en la región del tracto de salida.

El amarillo marca la expresión PECAM y el clon aparece en verde. La profundidad es de 36 micras y hay 10 rodajas en total. Esta película muestra secciones de un corazón P dos tratado con CUBIC, desde la superficie hasta el lumen.

La profundidad es de 130 micras con tres micras por sección. Esta película muestra secciones de un corazón E 17.5 tratado con CUBIC desde la superficie hasta el lumen. La profundidad es de 630 micras con seis micras por sección.

Esta es una imagen de superficie en 3D del corazón que se acaba de mostrar, reconstruida a través del software de reconstrucción 3D. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el embrión es frágil y la patología cardíaca puede alterarse fácilmente. Siguiendo este procedimiento, se puede obtener otra proteína, utilizando la tinción para estudiar la función del gen en una post-osteo y hacer espuma.