Medición In Vitro Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la actividad in vitro de la ATPasa de las proteínas purificadas para su caracterización funcional. Este método se puede utilizar para caracterizar nuevas ATPasas putativas, evaluar los activadores o inhibidores potenciales efectivos y determinar la contribución de dominios o residuos particulares a la actividad de la ATPasa. La principal ventaja de esta técnica es que es un método sencillo y sensible para medir la actividad de la ATPasa in vitro y que se puede optimizar fácilmente.

Prepare las existencias de todos los reactivos necesarios para la incubación con proteína purificada como se indica en el protocolo de texto. Premezcle 100 milimolares de cloruro de magnesio y 100 milimolares de ATP en una proporción de uno a uno justo antes de configurar la reacción de hidrólisis de ATP. Prepare y etiquete tubos de 1,5 mililitros para recoger muestras a intervalos regulares durante toda la reacción.

Prepare los tubos para recoger muestras en los momentos cero, así como en los momentos de 15, 30, 45 y 60 minutos. Agregue 245 microlitros de tampón 1x HNG a cada tubo para diluir las muestras recolectadas de las reacciones de hidrólisis de ATP en una dilución de uno a 50. A continuación, prepare un baño de hielo seco y etanol para congelar rápidamente las muestras y detener la reacción.

En una cubeta de hielo de goma u otro recipiente seguro, agregue varios trozos de hielo seco y vierta con cuidado suficiente 70% a 100% de etanol para cubrir el hielo seco. Diluya la proteína purificada en tampón HNG 1X y manténgala en hielo. Configure las reacciones de hidrólisis de ATP en los tubos de 0,5 mililitros preparados agregando un volumen de agua precalculado para alcanzar un volumen de reacción final de 30 microlitros.

Seguido de seis microlitros de 5X HNG u otro tampón, tres microlitros de 100 milimolares de mezcla de cloruro de magnesio ATP y 0,25 a cinco micromolares de proteína. Incubar una condición de control negativo de solo tampón en la que no se agrega proteína. A continuación, elimine cinco microlitros de la reacción en tiempos cero.

A continuación, diluya la alícuota uno a 50 en el tubo preparado de 1,5 mililitros que contiene 245 microlitros de tampón HNG. Congele inmediatamente la muestra en el baño de etanol de hielo seco. Incubar las reacciones a 37 grados centígrados para permitir que se produzca la hidrólisis del ATP durante una hora.

En cada intervalo, retire cinco alícuotas de microlitros de la reacción y agréguelas a los tubos de muestra etiquetados que contengan tampón HNG como antes. Al final de la reacción de hidrólisis de ATP, mueva las muestras diluidas a un congelador de 80 grados Celsius para su almacenamiento. Para asegurarse de que todas las muestras estén completamente congeladas, espere al menos 10 minutos antes de continuar.

Descongele las muestras diluidas que contengan alícuotas de reacción de hidrólisis de ATP desde cada punto de tiempo a temperatura ambiente. A continuación, prepare una placa de 96 pocillos que contenga muestras y patrones de fosfato. En un tubo de 0,5 mililitros, diluya el patrón de fosfato de 800 micromolares a 40 micromolares añadiendo 5,5 microlitros del patrón a 104,5 microlitros de tampón HNG.

Mezcle bien y agregue 100 microlitros de este estándar de fosfato de 40 micromolares al pocillo A1 de la placa de 96 pocillos. Agregue 50 microlitros de tampón HNG a los pocillos B1 a H1 para diluciones en serie uno a uno del patrón de fosfato. Extraer 50 microlitros de fosfato de 40 micromolares del pocillo A1, añadirlo a los 50 microlitros de tampón de ensayo del pocillo B1 y mezclar.

Luego retire 50 microlitros del pocillo B1 y agréguelo al pocillo C1, continuando las diluciones a través del pocillo G1. Deseche 50 microlitros del pocillo G1 después de mezclar para asegurarse de que cada pocillo tenga el mismo volumen. El pozo H1 debe contener solo tampón para crear un estándar de fosfato de 40 a cero micromolares. A continuación, agregue 50 microlitros de cada muestra por duplicado al plato.

Agregue muestras del mismo punto de tiempo en columnas verticalmente y de diferentes puntos de tiempo horizontalmente. Esto permite hasta ocho muestras y cinco puntos de tiempo por placa. Utilice una pipeta estéril para eliminar suficiente reactivo de detección de fosfato de meliptato verde de malaquita para agregar 100 microlitros a cada uno de los pocillos que contienen muestras y estándares.

Añada el reactivo de detección a una placa para facilitar el pipeteo con una pipeta multicanal. No vierta el reactivo de detección directamente en la placa, ya que es probable que se produzca una contaminación por fosfato. Con una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros del reactivo de detección de fosfato a cada pocillo y mezcle cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo un número constante de veces sin introducir burbujas, trabajando en orden desde el último punto de tiempo hasta el primer punto de tiempo.

Deje la placa a temperatura ambiente durante 25 minutos o según las instrucciones del fabricante. Para cuantificar los resultados, lea la absorbancia de las muestras a 650 nanómetros utilizando un lector de microplacas de absorbancia. Se muestran resultados representativos de las ATPasas cinéticas y de punto final, en las que se determina la actividad de las formas de tipo salvaje y mutantes de la secreción de tipo dos ATPasa/EPSE en presencia y ausencia de un estimulante cardiolipina.

Aquí se muestran los resultados de una ATPasa cinética estimulada por cardiolipina, que demuestra la liberación lineal de fosfato a lo largo del tiempo para EPSE de tipo salvaje y un mutante de lisina doble, con albúmina sérica bovina que sirve como control negativo. Estos datos se pueden representar como la cantidad de fosfato liberada por minuto dividida por la concentración de la proteína para cuantificar y comparar la actividad ATPasa de cada proteína. Los datos indican que dos residuos de lisina, K417 y K419, contribuyen a la actividad de la ATPasa estimulada por la cardiolipina de EPSE.

La comparación de la actividad de la ATPasa de las mismas proteínas sin estimulación con cardiolipina muestra que estos dos residuos de lisina no contribuyen a la baja actividad basal de EPSE, sino más bien a la capacidad de la proteína para ser estimulada por la cardiolipina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar de manera rápida y precisa la actividad de la ATPasa de las proteínas purificadas. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta la sensibilidad del reactivo de detección de fosfato.

Para evitar la contaminación por fosfato, recomendamos utilizar material de plástico desechable y agua ultrapura y realizar una exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio iónico después de la purificación de proteínas.