Name: Medición In Vitro Actividad ATPasa para enzimática Caracterización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a cuantificar la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas para caracterización enzimática. Este método sensible permite evaluar activadores e inhibidores potenciales en bioquímica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer la financiación de una subvención de los Institutos Nacionales de Salud RO1AI049294 (a M. S.).

1. Realizar la reacción de hidrólisis de ATP con la proteína purificada <ol><li> Las existencias de preparar todos los reactivos necesarios para la incubación con proteína purificada. <ol><li> Preparar tampón 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) que contiene 100 mM de HEPES pH 8,5, NaCl 65 mM, y 5% de glicerol (u otro tampón de ensayo según el caso). </li><li> Preparar 100 mM de MgCl 2 (u otro metal, si es de metal ATPasa dependiente) en agua. </li><li> Preparar fresca mM ATP 100 en 200 mM Tris Base (no ajuste de pH más) utilizando ATP alta pureza. Alícuota y almacenar el archivo de ATP a -20 ° C durante no más de unas pocas semanas, en forma de ATP se descompone con el tiempo, y se abstengan de congelación y descongelación de la población de ATP. </li><li> Premix MgCl 2 y ATP en una relación 1: 1 justo antes de la creación de la reacción de hidrólisis de ATP. </li></ol></li><li> Preparar y etiquetar tubos de 1,5 ml para la recogida de muestras a intervalos regulares a lo largo de la reacción. Preparar tubos para recoger muestras en el tiempo 0 y en el tiempo de 15, 30,45, y 60 min. NOTA: Como alternativa, recoger muestras solamente en el tiempo 0 y el punto final. <ol><li> Añadir 245 l de tampón 1x HNG a cada tubo con el fin de diluir las muestras recogidas de las reacciones de hidrólisis de ATP 1:50. </li></ol></li><li> Preparar un baño de hielo seco y etanol para congelar rápidamente muestras para detener la reacción. En un cubo de hielo de caucho o recipiente de otro seguro (no plástico), añade varios trozos de hielo seco y se vierte con cuidado suficiente etanol 70-100% para cubrir el hielo seco. </li><li> Diluir la proteína purificada en tampón HNG 1x, según sea apropiado (normalmente, un 5-10 mM), y mantener en hielo. </li><li> Configurar las reacciones de hidrólisis de ATP. <ol><li> En distintos tubos de 0,5 ml para cada muestra, añadir los siguientes reactivos (en orden): H 2 O (hasta un volumen final de 30 l), 6 l 5x HNG u otro tampón, 3 l mM MgCl 100 mezcla 2 -ATP, y 0,25-5 proteína M. </li><li> Incluir un único amortiguador-condición de control negativo en el que no se añade ninguna proteína.</li></ol></li><li> Retire 5 l de la reacción en el tiempo 0, se diluye 1:50 en el tubo de 1,5 ml preparado que contiene 245 l de tampón HNG, y congelar inmediatamente la muestra en el baño de hielo seco / etanol. </li><li> Incubar las reacciones a 37 ° C para permitir la hidrólisis de ATP que se produzca durante 1 hora. En cada intervalo (15, 30, 45, y 60 min), retirar 5 ml de alícuotas de la reacción y añadir a los tubos de muestra etiquetados que contienen tampón HNG como en el paso 1.6. </li><li> Al final de la reacción de hidrólisis de ATP, mover muestras diluidas a un congelador -80 ° C para el almacenamiento. Para asegurarse de que todas las muestras se congelaron por completo, espere al menos 10 minutos antes de continuar. </li></ol> 2. Las muestras que contienen Incubar libre pi con el reactivo de detección <ol><li> Descongelar las muestras diluidas que contienen partes alícuotas de la reacción de hidrólisis de ATP en cada punto de tiempo (obtenidos a partir de los pasos 1.6 y 1.7) a temperatura ambiente. </li><li> Configurar una placa de 96 pocillos que contienen las muestras y patrones de fosfato. <ol><li> En una ma 0,5 mlser, diluir el estándar de fosfato (proporcionado con el reactivo de detección de Pi) de 800 mM a 40 mM mediante la adición de 5,5 l de tampón de la HNG 800 M estándar a 104,5 l. Mezclar bien y añadir 100 l de esta norma Pi 40 M a pocillo A1 de una placa de 96 pocillos. </li><li> Añadir tampón HNG 50 l a los pocillos B1-H1 para 1: 1 diluciones en serie de la norma Pi. </li><li> Retire 50 l de 40 mM Pi desde el pocillo A1 y añadir al tampón de ensayo en 50 l B1 así, mezclar y remover 50 l de bien B1 y C1 añadir a bien, diluciones continuas a través de G1 también. Desechar 50 l de G1 bien después de la mezcla para asegurar cada pocillo tiene el mismo volumen. Así H1 debe contener solamente tampón para crear un estándar a PI 40 a 0 M. NOTA: Si un factor adicional (tal como un inhibidor) se ha añadido a las muestras, crear una curva estándar que contiene ese factor en el control de cambios en la liberación de fosfato o absorbancia bajo esas condiciones. </li><li> Añadir 50 l de cada sampLe por duplicado a la placa. Añadir muestras del mismo punto de tiempo en las columnas verticalmente (muestra 1 hora 0 = A2, A3; muestra 2 tiempo 0 = B2, B3) y diferentes puntos de tiempo horizontalmente. Esto permite hasta 8 muestras y 5 puntos de tiempo por placa. </li></ol></li><li> Usar una pipeta estéril para eliminar suficiente reactivo de detección de verde malaquita / molibdato de Pi añadir 100 l a cada uno de los pocillos que contienen las muestras y los estándares (reactivo necesario (ml) = 0,1 x número de muestras y los estándares) y añadir a un plato para facilitar el pipeteado utilizando una pipeta multicanal. No vierta el reactivo de detección directamente en la cápsula, ya que es probable que se produzca contaminación Pi. </li><li> Con una pipeta multicanal, se añaden 100 l de reactivo de detección Pi a cada pocillo y mezclar cuidadosamente con la pipeta hacia arriba y abajo un número considerable de veces sin la introducción de burbujas, preferentemente en el orden de los últimos puntos de tiempo a los primeros momentos de la hora. </li><li> Incubar la placa durante 25 min a temperatura ambiente, o de acuerdo con la madirecciones de nufacturer. </li></ol> 3. cuantificar Resultados El uso de un lector de microplacas <ol><li> Leer la absorbancia de las muestras a 650 nm utilizando un lector de microplaca de absorbancia. </li><li> Hacer una curva estándar Pi. El uso de un software de gráficos, representar gráficamente los valores de absorbancia de las muestras estándar Pi frente a la concentración con el fin de encontrar una ecuación usada para resolver la cantidad de fosfato en cada muestra. </li><li> Calcular la actividad ATPasa para cada muestra mediante la calibración con el estándar de fosfato. Fosfato liberado = (OD 650 - Intersección) / pendiente. <ol><li> Promediar el Pi total a partir de duplicados de cada muestra. Restar lectura de la absorbancia del control de tampón de sólo de este número. Multiplique esto por el factor de dilución (50 en nuestro ejemplo). </li><li> Determinar el Pi liberado por nmol de proteína mol. Representación gráfica de estos valores para cada punto de tiempo en un ensayo de cinética debe producir ajustes lineales de al menos R = 0,99 (Figura 1); Si nOT, el ensayo puede ajustarse con más o menos proteína o un tiempo de incubación más largo o más corto. </li></ol></li><li> Representan los resultados como nmol Pi / mol de proteína / min (Figuras 2, 3), o como proteína nmol Pi / mg / min si se desea. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este es un protocolo general para la medición de la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas para la caracterización bioquímica. Este método se optimiza fácilmente; por ejemplo, el ajuste de la cantidad de proteína, tampón y composiciones de sal, temperatura, y la variación de la longitud de ensayo y los intervalos (incluyendo el aumento del número total de intervalos) puede mejorar la actividad de la cuantificación. Comercialmente disponibles malaquita reactivos basados ​​en verde son muy se...

ATPasas son enzimas integrales en muchos procesos en todos los reinos de la vida. Las ATPasas actúan como motores moleculares que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para impulsar reacciones tan diversas como el tráfico, el despliegue y el ensamblaje de proteínas; replicación y transcripción; metabolismo celular; movimiento muscular; motilidad celular; y bombeode iones 1-3. Algunas ATPasas son proteínas transmembrana involucradas en el transporte de solutos a través de las membranas, otras son citoplasmáticas y pueden estar asociadas con una membrana biológica como la membrana plasmática o las de los orgánulos.
AAA+ ATPasas (ATPasas asociadas con diversas actividades celulares) constituyen un gran grupo de ATPasas que comparten cierta secuencia y conservación estructural. Estas proteínas contienen motivos de unión a nucleótidos conservados, como las cajas Walker-A y -B, y forman oligómeros (generalmente hexámeros) en su estado activo1. Se han caracterizado grandes cambios conformacionales en estas proteínas tras la unión de nucleótidos entre diversos miembros de la familia AAA+. La EpsE es una ATPasa AAA+ y miembro de la subfamilia de secreciones bacterianas de tipo II/IV de las NTPasas4-6. EpsE potencia la secreción tipo II (T2S) en Vibrio cholerae, el agente causante del cólera. El sistema T2S es responsable de la secreción de una amplia variedad de proteínas, como el factor de virulencia toxina del cólera que causa diarrea acuosa profusa cuando V. cholerae coloniza el intestino delgado humano7. 
Las técnicas para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro son variadas, pero comúnmente miden la liberación de fosfato utilizando sustratos colorimétricos, fluorescentes o radiactivos8-11. Describimos un método básico para determinar la actividad de la ATPasa in vitro de proteínas purificadas utilizando un ensayo colorimétrico basado en un sustrato que contiene verde de malaquita disponible comercialmente y que mide el fosfato inorgánico (Pi) liberado. A pH bajo, el molibdato verde de malaquita forma un complejo con Pi y el nivel de formación de complejos se puede medir a 650 nm. Este ensayo simple y sensible se puede utilizar para caracterizar funcionalmente nuevas ATPasas y para evaluar las funciones de posibles activadores o inhibidores, para determinar la importancia de dominios y/o residuos específicos, o para evaluar el efecto de tratamientos particulares sobre la actividad enzimática.

<table><tbody><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos (transparentes, de fondo plano)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Ciencias</td><td>BML-AK111</td><td>Reactivo de detección de fosfato preferido. Precaución: irritante.</td></tr><tr><td>Lector</td><td></td><td></td> de microplacas <td>BioTek Synergy o software Prism</td></tr><tr><td>5</td><td>GraphPad comparable</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición<em&gt; in vitro</em&gt; actividad atpasa para enzimática caracterización

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

enzimas trifosfato-hidrólisis de la adenosina, o ATPasas, juegan un papel crítico en una diversa gama de funciones celulares. Estas proteínas dinámicas pueden generar energía para el trabajo mecánico, como el tráfico de proteínas y la degradación, transporte de solutos, y los movimientos celulares. El protocolo descrito aquí es un ensayo básico para la medición de la actividad in vitro de ATPasas purificadas para la caracterización funcional. Las proteínas se hidrolizan ATP en una reacción que resulta en la liberación de fosfato inorgánico, y la cantidad de fosfato liberado a continuación, se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico. Este protocolo altamente adaptable se puede ajustar para medir la actividad de ATPasa en ensayos cinéticos o de punto final. Se proporciona aquí un protocolo representativo basado en la actividad y requisitos de EPSE, la AAA + ATPasa implicada en la secreción de Tipo II en la bacteria Vibrio cholerae. La cantidad de proteína purificada necesaria para medir la actividad, la duración del ensayo y la sincronización y la cantidad de saintervalos mpling, tampón y composición de sal, temperatura, cofactores, estimulantes (si lo hay), etc., pueden variar de los descritos aquí, y por lo tanto una optimización pueden ser necesarios. Este protocolo proporciona un marco básico para ATPasas que caracterizan y se puede realizar rápida y fácilmente ajustarse según sea necesario.

La actividad in vitro de la ATPasa T2S EPSE puede ser estimulada por copurification de EPSE con el dominio citoplásmico de EPSL (EPSE-cytoEpsL) y la adición de la cardiolipina fosfolípido ácido 12. También es posible determinar el papel de los residuos particulares EPSE en la hidrólisis de ATP mediante la comparación de la actividad de tipo salvaje (WT) a formas variantes de la proteína utilizando este ensayo. Aquí, el efecto de sustituir dos residuos de lisina en el ...

Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.

Medición<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas para su caracterización funcional. Este método puede utilizarse para caracterizar nuevas ATPasas putativas, evaluar posibles activadores o inhibidores efectivos y determinar la contribución de dominios o residuos específicos a la actividad ATPasa. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método sencillo y sensible para medir la actividad ATPasa in vitro, y puede optimizarse fácilmente.Prepare soluciones de todos los reactivos necesarios para la incubación con la proteína purificada según se indica en el protocolo escrito. Mezcle previamente cloruro de magnesio 100 milimolar y ATP 100 milimolar en una proporción uno a uno justo antes de preparar la reacción de hidrólisis de ATP. Prepare y etiquete tubos de 1,5 mililitros para recoger muestras a intervalos regulares durante toda la reacción.Prepare tubos para recolectar muestras en el tiempo cero, así como a los 15, 30, 45 y 60 minutos. Añada 245 microlitros de tampón HNG 1x a cada tubo para diluir las muestras recolectadas de las reacciones de hidrólisis de ATP en una dilución de uno a 50. A continuación, prepare un baño de hielo seco y etanol para congelar rápidamente las muestras y detener la reacción.En un cubo de hielo de goma u otro recipiente seguro, agregue varias piezas de hielo seco y vierta cuidadosamente suficiente etanol al 70 % hasta 100 % para cubrir el hielo seco. Diluya la proteína purificada en tampón HNG 1X y manténgala en hielo. Prepare las reacciones de hidrólisis de ATP en los tubos de 0,5 mililitros previamente preparados, añadiendo un volumen precalculado de agua para alcanzar un volumen final de reacción de 30 microlitros.A continuación, seis microlitros de HNG 5X u otro tampón, tres microlitros de mezcla de cloruro de magnesio 100 milimolar y ATP, y proteína de 0,25 a cinco micromolar. Incubar una condición de control negativo con tampón únicamente, a la que no se añade proteína. A continuación, retirar cinco microlitros de la reacción en los tiempos cero.Luego, diluya la alícuota de uno a 50 en el tubo de 1,5 mililitros preparado que contiene 245 microlitros de tampón HNG. Congele inmediatamente la muestra en el baño de hielo seco y etanol. Incube las reacciones a 37 grados Celsius durante una hora para permitir la hidrólisis de ATP.En cada intervalo, retire alícuotas de cinco microlitros de la reacción y añádalas a tubos de muestra etiquetados que contienen tampón HNG como antes. Al final de la reacción de hidrólisis de ATP, transfiera las muestras diluidas a un congelador de 80 grados Celsius para su almacenamiento. Para asegurar que todas las muestras se congelen completamente, espere al menos 10 minutos antes de continuar.Descongele las muestras diluidas que contienen alícuotas de la reacción de hidrólisis de ATP de cada punto temporal a temperatura ambiente. A continuación, prepare una placa de 96 pocillos que contenga muestras y estándares de fosfato. En un tubo de 0,5 mililitros, diluya el estándar de fosfato de 800 micromolar a 40 micromolar añadiendo 5,5 microlitros del estándar a 104,5 microlitros de tampón HNG.Mezcle bien y agregue 100 microlitros de este patrón de fosfato de 40 micromolar al pocillo A1 de la placa de 96 pocillos. Agregue 50 microlitros de tampón HNG a los pocillos B1 a H1 para realizar diluciones seriadas uno a uno del patrón de fosfato. Retire 50 microlitros de fosfato de 40 micromolar del pocillo A1, añádalos a los 50 microlitros de tampón de ensayo en el pocillo B1 y mezcle.Luego, retire 50 microlitros del pocillo B1 y añádalos al pocillo C1, continuando las diluciones hasta el pocillo G1. Deseche 50 microlitros del pocillo G1 después de mezclar para asegurar que cada pocillo tenga el mismo volumen. El pocillo H1 debe contener solo tampón para crear un estándar de fosfato desde 40 hasta cero micromolar. A continuación, añada 50 microlitros de cada muestra en duplicado a la placa.Agregue muestras del mismo punto de tiempo en columnas verticalmente y muestras de diferentes puntos de tiempo horizontalmente. Esto permite hasta ocho muestras y cinco puntos de tiempo por placa. Utilice una pipeta estéril para retirar suficiente reactivo de detección de fosfato de malacita verde meliptato para añadir 100 microlitros a cada uno de los pocillos que contienen muestras y patrones.Agregue el reactivo de detección a un recipiente para facilitar la pipetación con una pipeta multicanal. No vierta el reactivo de detección directamente en el recipiente, ya que es probable que ocurra contaminación por fosfato. Utilizando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros del reactivo de detección de fosfato a cada pocillo y mezcle cuidadosamente aspirando y dispensando un número constante de veces sin introducir burbujas, trabajando en orden desde el último punto de tiempo hasta el primer punto de tiempo.Deje la placa a temperatura ambiente durante 25 minutos o según las indicaciones del fabricante. Para cuantificar los resultados, lea la absorbancia de las muestras a 650 nanómetros utilizando un lector de microplacas de absorbancia. Se muestran resultados representativos de ATPasas cinéticas y de punto final, en los cuales se determina la actividad de las formas silvestre y mutante de la ATPasa de secreción tipo dos/EPSE en presencia y ausencia del estimulante cardiolipina.Se muestran aquí los resultados de una prueba cinética de ATPasa estimulada por cardiolipina, que demuestra la liberación lineal de fosfato a lo largo del tiempo para el tipo silvestre de EPSE y un mutante doble de lisina, utilizando albúmina sérica bovina como control negativo. Estos datos pueden representarse como la cantidad de fosfato liberado por minuto dividida por la concentración de proteína, con el fin de cuantificar y comparar la actividad ATPasa de cada proteína. Los datos indican que dos residuos de lisina, K417 y K419, contribuyen a la actividad ATPasa estimulada por cardiolipina de EPSE.La comparación de la actividad ATPasa de las mismas proteínas sin estimulación por cardiolipina muestra que estos dos residuos de lisina no contribuyen a la baja actividad basal de EPSE, sino más bien a la capacidad de la proteína para ser estimulada por la cardiolipina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar rápida y precisamente la actividad ATPasa de proteínas purificadas. Al intentar este procedimiento, es importante considerar la sensibilidad del reactivo de detección de fosfato.Para evitar la contaminación por fosfatos, recomendamos usar material plástico desechable y agua ultrapura, y realizar cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico tras la purificación de la proteína.

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método para la determinación de la actividad quinasa de acetato se describe. Este ensayo utiliza una reacción directa para determinar la actividad enzimática y la cinética de la cinasa de acetato en la dirección de acetato de formación con diferentes aceptores fosforilo. Además, este método puede ser utilizado para el ensayo de fosfato de otros o acetil de acetil-CoA utilizando enzimas.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Los efectos de la activación de la proteína quinasa C (PKC) las isoenzimas en las funciones mitocondriales asociadas con la respiración y la fosforilación oxidativa y en la viabilidad celular se describen. El enfoque se adapta técnica adenoviral para sobreexpresar selectivamente las isozimas de la PKC en cultivo de células primarias y una diversidad de ensayos para determinar las funciones mitocondriales y el estado de energía de la célula.

Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

Este video muestra un ensayo enzimático basado en cromatografía en capa fina para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa utilizando nucleótidos radiomarcados. El método proporciona información sobre la síntesis de nucleótidos y las reacciones de fosfotransferencia.

Ensayo de actividad enzimática basado en cromatografía en capa fina: una técnica para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa in vitro mediante cromatografía en capa fina

Este video muestra la medición in vitro de la actividad enzimática para la α-galactosidasa A y la α-glucosidasa ácida en muestras utilizando sustratos sintéticos de 4-Methylumbelliferilo.

Medición in vitro de la actividad de la enzima α-galactosidasa A y α-glucosidasa ácida

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Aquí describimos ensayos bioquímicos que se pueden utilizar para caracterizar las enzimas de remodelación de la cromatina dependientes de ATP por sus capacidades para 1) catalizar el deslizamiento de nucleosomas dependientes de ATP, 2) interactuar con sustratos de nucleosomas y 3) hidrolizar ATP de una manera dependiente de nucleosomas o ADN.

Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

El presente informe describe un ensayo enzimático in vitro para medir la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa utilizando extractos de células de Leishmania. Este ensayo se basa en la transferencia de un grupo metilo radiactivo de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a la fosfatidiletanolamina endógena.

Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.

In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe

Aquí, describimos un método para purificar enzimas pyrophosphokinase etiqueta histidina y utilizando cromatografía en capa fina de sustratos marcados radiactivamente y productos para análisis de la actividad enzimática in vitro. El ensayo de actividad de la enzima es ampliamente aplicable a la quinasa, ciclasa de nucleótidos o reacción de transferencia de fósforo cuyo mecanismo incluye la hidrólisis de nucleótidos trifosfato.

Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile

Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

Aprende a cuantificar la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas para caracterización enzimática. Este método sensible permite evaluar activadores e inhibidores potenciales en bioquímica.

Medición

Explorar más videos