Fluorescente modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo ortotópico de ratón de cáncer de páncreas fluorescente que pueda controlarse de forma no invasiva en un animal vivo. Este modelo permite un estudio no invasivo de los efectos de un fármaco específico de interés sobre un tumor primario y su metástasis en un animal vivo. La principal ventaja de esta técnica es que los efectos de los tratamientos se pueden observar fácilmente in situ.

Comience descongelando una alícuota de Matrigel de alta concentración de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, lavar cada matraz de células con cinco mililitros de DPBS y cosechar los cultivos con tripsina. Después de agregar el medio RPMI, transfiera las suspensiones celulares resultantes a tubos de 15 mililitros y gire las celdas.

Al final de la centrifugación, transfiera las células a una cabina de bioseguridad y vuelva a suspender los gránulos en 10 mililitros de DPBS fresco con un pipeteo suave. Después de contar, centrifugar las células de nuevo y diluir las suspensiones celulares a una concentración de tres veces 10 a la sexta célula por 50 microlitros de medio helado sin suero y Matrigel, una membrana de matriz basal de alta concentración. A continuación, agita suavemente las muestras y colócalas en hielo.

Para implantar las células, primero aplique ungüento en los ojos de un ratón anestesiado y coloque al animal en una almohadilla térmica cubierta con un paño estéril. A continuación, desinfecte suavemente el flanco del animal con tres exfoliantes de yodo, seguidos de tres enjuagues con etanol al 70%. Después de confirmar la falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie, cargue aproximadamente 200 microlitros de las células preparadas en una jeringa TB de un mililitro preenfriada equipada con una aguja de calibre 18.

Reemplace la aguja de calibre 18 por una aguja de calibre 27 y vuelva a colocar las células en hielo. Luego, ubique el área general del bazo en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Con pinzas, pellizque la piel por encima del bazo y haga una incisión de aproximadamente un centímetro para crear una bolsa.

A continuación, pellizca el músculo liso en la parte superior del bazo y corta el tejido para acceder a la cavidad peritoneal. A continuación, agarre suavemente el extremo caudal del bazo y sáquelo de la cavidad corporal. Con un hisopo de algodón húmedo y estéril, extienda el páncreas unido al extremo del bazo para ubicar la cola pancreática.

Administre 50 microlitros de las células en la cola pancreática, luego gire lentamente la aguja fuera del páncreas. Una implantación exitosa se verá como una burbuja superficial sin fugas. Regrese los órganos a la cavidad peritoneal y encierre todo con el músculo y la piel.

Luego, use una sutura 6-0 para cerrar la incisión. Después, inyecte ketoprofeno a los animales y vigílelos hasta que se recuperen por completo. En el momento experimental apropiado, utilice un sistema comercial de imágenes de animales pequeños para obtener imágenes del crecimiento tumoral en el animal vivo bajo anestesia y seleccione los filtros de excitación y emisión adecuados.

A continuación, obtenga una imagen inicial utilizando solo luz blanca. Manteniendo al animal en la misma posición, cambie a los filtros GFP y adquiera una segunda imagen. Para analizar el crecimiento tumoral, superponga las imágenes blancas y fluorescentes para evaluar el área fluorescente y la intensidad de las células tumorales.

La detección de una señal fluorescente verde entre dos y tres semanas después de la implantación proporciona una señal visual para confirmar la presencia de un tumor de cáncer de páncreas en desarrollo, ya que los animales que no desarrollan tumores no exhiben una señal GFP. Además, este método permite el seguimiento no invasivo de la progresión del crecimiento tumoral, con un aumento de la señal GFP observado con el tiempo a medida que aumenta el tamaño del tumor. La metástasis del tumor en órganos específicos se puede confirmar mediante la extirpación de los tejidos de interés para la obtención de imágenes fluorescentes ex vivo adicionales.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis u ocho minutos y se puede utilizar para estudiar los efectos de diferentes agentes quimioterapéuticos sobre el cáncer de páncreas y su metástasis. Al intentar este procedimiento, es importante mantener el Matrigel en hielo, o de lo contrario el gel será difícil de inyectar. Además, es importante recordar el uso de técnicas asépticas y controlar todos los niveles de anestesia en todo momento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir un modelo ortotópico de cáncer de páncreas en ratones. No olvide que trabajar con líneas celulares de cáncer humano puede ser peligroso, y que se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección y la eliminación adecuada de los desechos biológicos.