De Alto Rendimiento de genes de marcado en las
12 de agosto de 2016
La adición de una etiqueta a una proteína es una forma poderosa de obtener información sobre su función. Aquí, describimos un protocolo para marcar endógenamente cientos de proteínas de Trypanosoma brucei en paralelo, de modo que se pueda lograr el marcaje a escala del genoma.
El objetivo general de este método es marcar proteínas en Trypansoma brucei de manera de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los cinetoplastídeos sobre la localización y la función potencial de grandes cohortes de proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que grandes cantidades de proteínas pueden marcarse rápidamente y en paralelo de forma sencilla.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la localización, las interacciones de grandes cohortes de proteínas también se pueden investigar utilizando otras etiquetas. Por ejemplo, la etiqueta BirA para un experimento de mapeo de proximidad bio-ID. El procedimiento será demostrado por Ross Madden, un asistente de investigación de nuestro laboratorio.
Antes de comenzar este procedimiento, preenfríe un enfriador para PCR de 96 pocillos en el congelador a menos 80 grados Celsius. Prepare la Mezcla Maestra A combinando lo siguiente en un tubo de 10 mililitros: 2, 100 microlitros de agua destilada desionizada, 105 microlitros de DMSO de grado PCR, 105 microlitros de dNTPs 10 milimolares y 105 microlitros de la plantilla pPOT.
Vierta la Mezcla Maestra A en un depósito de reactivo y alícuota 23 microlitros de la Mezcla Maestra A en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Utilizando una pipeta multicanal de 12 canales P20, agregue dos microlitros de cebadores agrupados de 100 micromolar a cada pocillo cargado. Selle la placa con una película.
Colóquelo sobre el enfriador de PCR previamente enfriado y déjelo congelar durante un mínimo de 20 minutos a menos 80 grados Celsius. La congelación de la mezcla maestra de PCR A es fundamental para garantizar una reacción de inicio en caliente eficiente, incluso cuando se utiliza una polimerasa específica de inicio en caliente. Esto permite una amplificación reproducible y de alto rendimiento.
Mientras la placa de PCR está en el congelador, prepare la Mezcla Maestra B. Combine lo siguiente en un tubo de 10 mililitros: 2.048 microlitros de agua destilada desionizada, 525 microlitros de tampón 10X y 52,5 microlitros de polimerasa, para un volumen total de 2.626 microlitros por placa. Retire la placa de PCR y el enfriador de PCR del congelador a menos 80 grados Celsius.
Con la placa aún en el enfriador de PCR, agregue rápidamente 25 microlitros de la Mezcla Maestra B encima de la Mezcla Maestra A congelada en cada pocillo, para un volumen total de reacción de 50 microlitros. Este paso es crítico en cuanto al tiempo y debe completarse antes de que la Mezcla Maestra A se derrita. Selle la placa con una película adhesiva.
Configure el termociclador como sigue: 94 grados Celsius durante 10 minutos, luego, 30 ciclos de 94 grados Celsius durante 15 segundos, 65 grados Celsius durante 30 segundos y 72 grados Celsius durante dos minutos, seguido de un periodo final de extensión de 72 grados Celsius durante siete minutos. Una vez que el bloque haya alcanzado 94 grados Celsius, coloque la placa de PCR en el termociclador e inicie el programa de amplificación.
Comience este procedimiento preparando un gel de agarosa al 1 % grande en tampón de electroforesis Tris-acetato EDTA o TAE, con cuatro hileras de pocillos. Cargue un marcador de ADN de un kb en los pocillos primero y 28 de cada hilera. El siguiente paso es transferir dos microlitros de producto de PCR directamente, sin tampón de carga de ADN, a cada carril del gel, siguiendo el patrón mostrado aquí.
Por ejemplo, los productos de PCR de las filas A y B de la placa de PCR se cargan en los pozos numerados con números impares y pares de la primera fila del gel, respectivamente. Trabajando rápidamente para reducir la posibilidad de contaminar los amplicones, cargue los productos de PCR de la fila A de la placa de PCR en los pozos impares de la primera fila del gel. Luego, cargue los productos de PCR de la fila B de la placa de PCR en los pozos pares de la primera fila del gel.
Cargue los productos de PCR de las filas C y D de la placa de PCR utilizando este mismo patrón, colocando la fila C en los pozos impares y la fila D en los pozos pares de la segunda fila del gel. Continúe con este patrón de carga hasta que cada pozo de la placa de PCR se haya cargado en el gel. Coloque el gel en el tanque de electroforesis y llene el tanque con tampón de corrida TAE hasta que el gel quede sumergido.
Correr a 100 voltios durante 30 minutos. Visualizar utilizando un transiluminador UV. Aquí se muestra un gel de agarosa representativo de validación de PCR de 96 pocillos, en el que 95 de las 96 PCR tuvieron éxito.
La PCR fallida fue la H11. Este procedimiento utiliza la línea celular SMOXP9 de Trypansoma brucei, forma procíclica. Cultive las células hasta la densidad adecuada según se describe en el texto del protocolo y recolecte el número requerido de células mediante centrifugación a 800 × g durante 10 minutos.
Comience a prepararse para la electroforesis mientras las células se centrifugan. Conecte el manipulador de placas al electroforizador. En la unidad del electroforizador, ajuste el voltaje a 1.500 voltios, la duración del pulso a 100 microsegundos, el número de pulsos a 12 y el intervalo entre pulsos a 500 milisegundos.
En el manipulador de placas, ajuste el conteo de pulsos a uno. Utilizando una pipeta multicanal de 12 canales P200, transfiera las reacciones de PCR desde la placa de PCR a una placa desechable de electroforesis de 96 pocillos. Lave las células con 10 mililitros de citomix modificado y centrifugue nuevamente a 800 × g durante 10 minutos.
Re-suspender las células en 23 mililitros de citomix modificado para obtener una concentración final de cinco por 10 a la séptima células por mililitro. Transferir la suspensión celular a un depósito de reactivo. Pipetear 200 microlitros de la solución celular en cada pocillo de la placa de electroforesis y mezclar con el producto de PCR mediante pipeteo.
Utilice un tejido para eliminar cualquier gota de la parte superior de la placa y evitar cortocircuitos. Aplique una película sellante en la parte superior de la placa de electroforesis, colocándola de manera que deje descubiertos los orificios para los electrodos en la parte superior e inferior de cada columna. Evite cubrir los puntos elevados utilizados para guiar la película.
Cargue la placa de electroforesis en el manipulador de placas y cierre la tapa. Presione el pulso en la unidad de electroforesis. Después de la electroforesis, las células deben transferirse rápidamente a cuatro placas de cultivo celular de 24 pocillos que contienen un mililitro de medio SDM-79 por pocillo para su recuperación.
Utilice una pipeta multicanal de 12 canales P200 con cada punta alternativa ausente, de modo que las seis puntas restantes se alineen con las seis filas de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Después de transferir las células de la placa de 96 pocillos a la placa de 24 pocillos, lave los pocillos de la placa de 96 pocillos con el medio de los pocillos correspondientes de la placa de 24 pocillos. Luego, transfiera el lavado nuevamente a los pocillos de la placa de 24 pocillos.
Transfiera las células electro poradas desde la placa de electro poración de 96 pocillos hasta las placas de cultivo celular de 24 pocillos siguiendo el patrón predefinido que se muestra aquí. Por ejemplo, las células de los pocillos con número impar de la fila A de la placa de 96 pocillos se transfieren a la fila A de la placa A, mientras que las células de los pocillos con número par de la fila A de la placa de 96 pocillos se transfieren a la fila A de la placa C. Después de cada transferencia de células desde la placa de 96 pocillos hasta la placa de 24 pocillos, lave los pocillos en la placa de 96 pocillos con medio de la fila correspondiente de la placa de 24 pocillos. Luego, transfiera el lavado de vuelta a la placa de 24 pocillos.
Transferir las células a las placas de 24 pocillos es confuso, pero debe ser capaz de rastrear las líneas celulares resultantes hasta el ID del gen correcto. Es fundamental realizar este paso rápidamente para mantener las células sanas. Después de que todas las células electro poradas se hayan transferido a las cuatro placas de 24 pocillos, coloque las placas de 24 pocillos en una caja de plástico limpia con tapa que forme un sello hermético. Coloque la caja en un incubador a 28 grados Celsius.
Entre seis y ocho horas después, añada a cada pocillo un mililitro de SDM-79 con 10 % de FCS que contenga antibiótico selectivo. Incube a 28 grados Celsius durante nueve a 10 días hasta que las líneas celulares transgénicas sean visibles. Después de una transfección en placas de 96 pocillos para marcar 96 proteínas diferentes en el extremo terminal, las células se transfieren a placas de cultivo celular de 24 pocillos para recuperación y selección.
A continuación, se evalúa cada pocillo para determinar si contiene células sanas resistentes al fármaco. Un pocillo saludable contiene predominantemente células altamente activas que se observan brillantes en microscopía de contraste de fases. En este esquema de ejemplo, el color verde representa un pocillo con transfección exitosa, y el gris representa un pocillo con solo células muertas.
88 de 96, o 92% de los pocillos, contienen parásitos transfectados con éxito tras 15 días de selección. Una vez dominado, se necesitará aproximadamente una hora desde el conteo de las células hasta su siembra tras la electrotransferencia. Al intentar este procedimiento, es importante recordar añadir las drogas selectivas entre seis y ocho horas después de la transfección.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar cohortes grandes de proteínas en Trypansoma brucei.
Descripción general
Este artículo presenta un método de alto rendimiento para la marcación de proteínas en Trypanosoma brucei, lo que permite el estudio de la localización y función de las proteínas. El protocolo posibilita la marcación paralela de cientos de proteínas, facilitando estudios genómicos a gran escala.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genómica
Antecedentes
- La marcación de proteínas es esencial para comprender la función proteica.
- Trypanosoma brucei es un organismo modelo para estudiar los cinetoplastídeos.
- Las técnicas de alto rendimiento mejoran la eficiencia de los estudios de proteínas.
- La marcación puede revelar la localización y la dinámica de interacción de las proteínas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la marcación endógena de proteínas en T. brucei.
- Facilitar la investigación de la localización y función de proteínas.
- Permitir la marcación genómica a gran escala para estudios integrales.
Métodos Utilizados
- Preparación de mezclas maestras de PCR para amplificación.
- Electroporación de células de T. brucei con constructos marcados.
- Validación de productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa.
- Uso de etiquetas específicas para estudios de interacción proteica.
Resultados principales
- Etiquetado exitoso de una gran cohorte de proteínas de T. brucei.
- Alto rendimiento y reproducibilidad de la amplificación por PCR.
- Factibilidad demostrada de estudios de proteínas de alto rendimiento.
- Validación del método mediante resultados exitosos de PCR.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado permite la etiquetación eficiente de proteínas en T. brucei.
- Este método puede avanzar significativamente la investigación en el campo de los cinetoplastídeos.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para obtener mayores conocimientos sobre las funciones de las proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La etiquetación de proteínas de alto rendimiento permite la anotación funcional sistemática de proteomas de patógenos, apoyando la reducción de riesgos de dianas en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos antiparasitarios. Al generar bibliotecas etiquetadas a partir de loci endógenos, este método proporciona datos cuantitativos sobre localización e interacciones, esenciales para priorizar dianas farmacológicas en las líneas de desarrollo para enfermedades desatendidas. La escalabilidad del enfoque se alinea con iniciativas de cribado a escala del genoma, acelerando los ciclos de hipótesis a validación en los flujos de trabajo de validación de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la marcación endógena de proteínas patógenas para la localización y la cartografía de interacciones.
- Valor operativo: Facilita la marcación paralela de decenas a cientos de candidatos, aumentando el rendimiento para la clasificación de objetivos y el seguimiento del cribado fenotípico.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al generar datos reproducibles de localización subcelular y co-inmunoprecipitación en grandes cohortes génicas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce líneas celulares validadas que expresan proteínas marcadas, lo que permite ensayos estandarizados para lecturas de unión, localización o funciones.
- Valor operativo: La electrotransferencia en formato de placa de 96 pocillos permite una entrega consistente de constructos de ADN, mejorando la reproducibilidad en plataformas de cribado basadas en transfección.
- Escalabilidad: El cultivo en placas de 24 pocillos facilita el aislamiento y selección clonal, creando un recurso renovable para campañas de validación de dianas en pasos posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Las líneas de proteínas marcadas permiten la correlación entre fenotipos moleculares y sensibilidad a fármacos, lo que apoya modelos preclínicos alineados con biomarcadores.
- Conocimiento Mecanicista: Facilita la identificación de complejos proteicos y vías metabólicas, ayudando a comprender el mecanismo de acción y los mecanismos de resistencia.
- Confianza en el Blanco: El marcado endógeno conserva los niveles nativos de expresión, reduce los artefactos y mejora el valor predictivo en las evaluaciones de esencialidad del blanco.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja en la fase de biología de descubrimiento, donde la etiquetación de alto rendimiento apoya la identificación y validación de dianas antes de la optimización del candidato. Permite la generación de líneas celulares listas para reactivos destinadas a ensayos bioquímicos y celulares, conectando hallazgos genómicos con validación funcional. Resultados como patrones de localización y redes de interacción informan las decisiones de continuar o descartar en la priorización de dianas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis mediante la identificación de la localización subcelular y de socios de interacción de genes candidatos procedentes de análisis genómicos.
- Selección: Permite la preparación de líneas celulares estandarizadas y marcadas para el desarrollo de ensayos reproducibles en cascadas de validación de dianas.
- Análisis: Genera muestras para imágenes cuantitativas y proteómica preparadas para comparar la localización, expresión y estados de interacción en distintas condiciones.
- Investigación Traslacional: Conecta la validación de dianas moleculares con resultados fenotípicos mediante líneas marcadas utilizables en estudios de respuesta y resistencia a fármacos.
- Reutilización Empresarial: El sistema de plásmidos y cebadores es adaptable a diferentes conjuntos de genes, lo que permite su reutilización en múltiples proyectos sin necesidad de reingenierizar los componentes principales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco mediante etiquetado endógeno y paralelo que conserva el contexto y la función nativos de la proteína.
- Valor operativo: El flujo de trabajo estandarizado de electrotransferencia y selección en placas de 96 pocillos mejora la reproducibilidad y reduce el tiempo de manipulación por blanco.
- Valor estratégico: Permite escalar rápidamente los esfuerzos de validación de blancos, mejorando la eficiencia del capital en las fases iniciales del descubrimiento al reducir la eliminación tardía debida a blancos mal validados.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar datos multiparamétricos (localización, interacciones, expresión) para una clasificación informada de los blancos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular en el diseño de cebadores para PCR, clonación y técnicas de cultivo de tripanosomas.
- Depende del acceso a sistemas de electrotransferencia compatibles con manipuladores de placas de 96 pocillos y parámetros de pulsos estandarizados.
- Necesita protocolos estandarizados de selección con antibióticos y recuperación para garantizar una recuperación consistente de líneas transgénicas en todas las placas.
- La adaptación a otros tipos de etiquetas (por ejemplo, fluorescentes, de afinidad, de proximidad) requiere la validación de la funcionalidad de la etiqueta y su compatibilidad con los ensayos posteriores.
- El éxito depende de un seguimiento cuidadoso de la correspondencia entre pocillo y gen durante los pasos de transferencia para mantener el vínculo entre genotipo y fenotipo.
