Name: De Alto Rendimiento de genes de marcado en las Trypanosoma brucei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a etiquetar proteínas de alto rendimiento en Trypanosoma brucei mediante PCR y electroporación. Este método permite estudiar la localización y función de grandes cohortes de proteínas en cinétidos.

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SD fue apoyada por una beca Sir Henry Wellcome [092201/Z/10/Z]. Este trabajo fue financiado por las subvenciones del Wellcome Trust [WT066839MA] [104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] al profesor Keith Gull. Nos gustaría agradecer al profesor Keith Gull por sus útiles conversaciones y conocimientos.

1. 96 pocillos largo cebador de PCR <ol><li> Pre-congelación enfriador 96 pocillos PCR en -80 ° C congelador. </li><li> En un tubo de 10 ml, preparar Master Mix A: 2100 ddH l 2 O, 105 l PCR grado DMSO, 105 l dNTPs 10 mM, 105 l plantilla pPot (25 ng / l) 9, para un volumen total de 2415 l por placa . </li><li> Alícuota de 23 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR. </li><li> Añadir 2 l de 100 mM agrupados cebadores para cada uno cargado también con una pipeta multicanal P20 de 12 canales. Sellar con la película, placa lugar en el enfriador de PCR previamente enfriado y dejar que se congele durante un mínimo de 20 min a -80 ° C. </li><li> En un tubo de 10 ml, preparar Master Mix B: 2,048 l ddH 2 O, 525 l de 10x tampón, 52,5 l de la polimerasa para un volumen total de 2626 l por placa. </li><li> Retire la placa y el refrigerador de PCR a partir del congelador a -80ºC. </li><li> Con la placa todavía en el enfriador de PCR, se añaden 25 l Master Mix B en la parte superior de la congelón Master Mix A para un volumen total de reacción de 50 l. Este es el tiempo crítico, y debe ser completado antes de la mezcla A puede descongelarse. Sellar la placa con película. </li><li> Conjunto termociclador de la siguiente manera: 94 ° C durante 10 min, luego 30 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 2 min seguido de un periodo de extensión final de 72 ° C durante 7 min . </li><li> Cargar la placa de PCR que el bloque haya alcanzado 94 ° C. </li></ol> 2. Validación de 96 pocillos a largo cebador de PCR <ol><li> Reparto de un gran 1% (w / v) en gel de agarosa en Tris acetato EDTA (TAE) tampón de ejecución con peines de 4 x 28 pocillos para dar un gel con 4 filas de pocillos. Alinear los dientes suplentes del peine con la punta de una pipeta multicanal de 12 canales. Sumerja con cuidado el gel en TAE funcionamiento de amortiguación después de que los carriles están cargados. </li><li> Cargar escalera de ADN de 1 kb en la 1ª y 28ª pocillo de cada fila. </li><li> Con una pipeta multicanal P20 de 12 canales, transferir 2 l de producto de PCR dirrectamente a cada carril del gel (Figura 1A). Hacer esto de manera rápida para reducir la posibilidad de contaminación de los amplicones. <ol><li> Cargar los productos de PCR de la fila A de la placa de PCR en las pistas impares de la fila 1 del gel (A1 - carril 3, A2 - carril 5 ...... A11 - carril 23, A12 - carril 25) y cargar los productos de PCR de la fila B de la placa de PCR en los carriles pares del st fila del gel 1 (B1 - carril 4, A2 - carril 6 ...... B11 - carril 24, B12 - carril 26). </li><li> Cargar los productos de PCR de la fila C y D de la placa de PCR utilizando el mismo patrón que se ha descrito anteriormente, con la fila C en el carril numeradas y la fila D extraña en los carriles de número par. Continuar este patrón de carga hasta que cada pocillo de la placa de PCR se carga en el gel. tampón de carga de DNA no es necesaria para cargar este gel. </li></ol></li><li> Colocar el gel en el tanque de correr y llenar el tanque con TAE tampón de ejecución hasta que se sumergió el gel. Ejecutar a 100 V durante 30 min yvisualizar utilizando un transiluminador UV. Véase la Figura 1B para un gel de ejemplo. Nota: Los productos de PCR se pueden almacenar a -20 ° C durante varias semanas antes de la transfección </li></ol> 3. La transfección de 96 pocillos <ol><li> Utilice la T. brucei línea celular de forma procíclica SMOXP9 10 para este procedimiento y crecer en SDM-79 medio que contiene FCS al 10% 10. </li><li> Utilice 1 x 10 7 células por transfección (total de 1,1 x 10 9 células) cuando se marcan en el extremo N de la proteína y 2 x 10 7 células por transfección (un total de 2,2 x 10 9 células) cuando se marcan en el extremo C terminal de la proteína. Mantener las células en mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 células / ml) durante varios días antes de la transfección y cosechar las células para la transfección a una densidad de 5-8 x 10 6 células / ml. </li><li> Permitir a los productos de la PCR para la transfección congelados se descongelen a temperatura ambiente. </li><li> Recuento de células usando un hemoocytometer o contador de células automático. </li><li> Pellet requerido número de células en múltiples tubos de 50 ml a 800 xg durante 10 min. </li><li> Después de sobrenadante de centrifugación de descarte y resuspender las células en 10 ml Cytomix modificado (EGTA mM 0,8 mM, KCl 24, 0,15 mM CaCl 2, 10 mM de tampón de fosfato de potasio pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl 2, 0.5% (w / v) de glucosa, 100 mg / ml BSA, hipoxantina 1 mM, sacarosa 144 mM) por tubo. Transferencia de todas las soluciones de células a un solo tubo y girar de nuevo a 800 xg durante 10 min. </li><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 23 ml de Cytomix modificado para una concentración final de 5 x 10 7 células / ml. </li><li> Mientras que las células están girando, añadir 1 ml de SDM-79 medios de comunicación a cada pocillo de placas de cultivo de tejido de 4 x 24 pocillos. Etiquetar las placas de AD y dibujar un anillo alrededor pocillo A1 en cada plato con un marcador permanente para ayudar orientación de la placa. </li><li> Conectar el controlador de placa a la electroporador. En la electroporaunidad tor ajustar el voltaje a 1500 V, la longitud del pulso de 100 microsegundos y el número de impulsos a 12 y el intervalo de impulso de 500 ms. En el controlador de placa, establecer el cómputo de impulsos a 1. Esto asegura que que electroporador se aplicará un pulso único a cada una de las 12 columnas de la placa de la electroporación. </li><li> El uso de un P200 12 pipeta multicanal canal, la transferencia de las reacciones de PCR de la placa de PCR a las placas de 96 pocillos de electroporación desechables, brecha 4 mm. </li><li> Cuando las células se han hecho girar y se resuspendieron a la concentración final de 5 x 10 7 células / ml (paso 3.7), transferir a un depósito de reactivo. Pipetear 200 l de la solución de células en cada pocillo de la placa de electroporación usando un P200 12 canal pipeta multicanal, mezclar con el producto PCR mediante pipeteo. </li><li> El uso de tejido a eliminar cualquier gota de la parte superior de la placa para evitar cortocircuitos. </li><li> Aplicar la película de sellado proporcionada en el envase placa a la parte superior de la placa de la electroporación, positioning que a fin de dejar los orificios de los electrodos no cubierto en la parte superior e inferior de cada columna. Evitar cubrir los puntos planteados utilizados para guiar la película. </li><li> Cargar la placa de electroporación en el controlador de la placa y cierre la tapa. Pulse &#39;Pulso&#39; en la unidad electroporador. </li><li> Después de la electroporación, transferir rápidamente las células de la placa de la electroporación de 96 pocillos a las placas de cultivo de tejido de 4 x 24 pocillos. Para transferir las células, utilizar una pipeta P200 12 canal multicanal con cada otra punta falta de tal manera que los 6 restantes puntas se alinean con los 6 filas en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Transferencia de las células electroporadas en las placas electroporaciones de 96 pocillos en patrón predefinido a las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Figura 2A). </li><li> Preparar las puntas de pipeta P200 - para cada transfección de 96 pocillos preparar 2 cajas de 96 puntas con cada otra columna eliminado. <ol><li> pozos de transferencia A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 de la placa de electroporación de 96 pocillos aLa placa A la fila A de las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 en la fila B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 en la fila C y D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 en la fila D. Después de la transferencia de cada grupo de 6 pocillos de la placa de 96 pocillos a la placa de 24 pocillos, los pocillos en la placa de 96 pocillos se lavan a continuación con los medios de los pocillos correspondientes en el 24- así placa y el lavado se transfirieron de nuevo a los pozos de la placa de 24 pocillos. </li><li> pozos de transferencia E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 en la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa B fila A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 en la fila B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 en la fila C y H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos de la placa de 96 pocillos de la placa de 24 pocillos, los pozos en el 96 placa -bien se lavan entonces con medios de los pocillos correspondientes en la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pocillos en la placa de 24 pocillos. </li><li> pozos de transferencia A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 de la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa C la fila A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 en la fila B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 en la fila C y D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos desde el 96 -bien placa a la placa de 24 pocillos, los pozos de la placa de 96 pocillos se lavan a continuación con los medios de los pocillos correspondientes de la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pozos de la placa de 24 pocillos. </li><li> pozos de transferencia E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 en la placa de electroporación de 96 pocillos a 24 pocillos placa D fila A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 en la fila B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 en la fila C y H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 en la fila D. Después de la transferencia de cada conjunto de 6 pozos de la placa de 96 pocillos de la placa de 24 pocillos, los pozos en el 96 placa -bien se lavan entonces con medios de los pocillos correspondientes en la placa de 24 pocillos y el lavado se transfiere de nuevo a los pocillos en la placa de 24 pocillos. </li></ol></li><li> Utilizando un microscopio de contraste de fase invertida, así examinar 1 de cada columna para comprobar las células. Habrá una mezcla de células vivas y muertas con unacantidad sustancial de los restos celulares. Las células vivas se pueden distinguir de las células muertas, ya que será brillante bajo un microscopio de contraste de fase y se mueve. </li><li> Colocar las placas de 24 pocillos en una caja limpia, de plástico con una tapa que forma un sello hermético. Ponga la caja en un 28 ° C incubadora. </li><li> Entre 6-8 horas más tarde, añadir 1 ml de SDM-79 con 10% de FCS que contiene el antibiótico selectivo 2x a cada pocillo. En nuestra experiencia, las líneas celulares donde los genes etiquetados en el extremo N terminal son resistentes a concentraciones más altas de la droga selectiva. Por lo tanto, el uso de blasticidin como un ejemplo, el marcado en el extremo N terminal requiere una concentración final de 20 mg / ml de blasticidina y etiquetado en el extremo C terminal requiere una concentración final de 10 mg / ml de blasticidina. Nota: Las líneas celulares transgénicas serán visibles 9-10 días después de la transfección. </li><li> Passage al menos dos veces en fármaco fresco y medios de comunicación antes del análisis. La Figura 2B muestra los resultados de una típica transfe 96 pocilloscción para el marcado de 96 proteínas diferentes en el extremo N-terminal. Evaluar cada pocillo por microscopía de contraste de fase para determinar si contiene células sanas, resistentes a las drogas. Un bien sana contiene predominantemente (&lt;95%) las células altamente activos que son brillantes en microscopía de contraste de fase. se requiere un análisis posterior por microscopía de epifluorescencia o transferencia de western para determinar si la proteína ha sido etiquetado con éxito. </li></ol>

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<li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+meth%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
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<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

mejoras dramáticas en la sensibilidad de la proteómica y transcriptómica métodos en los últimos 5-10 años ha proporcionado valiosos datos sobre miles de genes y sus productos. Sin embargo, las herramientas para hacer frente a la función de estas proteínas no han avanzado al mismo ritmo. Etiquetar una proteína facilita numerosos experimentos para determinar su función. Por ejemplo, una proteína se puede fusionar a una proteína fluorescente en una variedad de diferentes colores para facilitar los estudios de localización y co-localización. Etiquetas desarrollados para microscopía electrónica, tales como APEX2 o miniSOG 11,12, permitir la localización ultraestructural de la proteína de la etiqueta. Etiquetas para la bioquímica, como la etiqueta TAP, y ProtC-TEV-ProtA (PTP) Marcar 7,13 permitir la purificación de complejos asociados con la proteína para la identificación de las parejas de unión o en ensayos bioquímicos in vitro. Los pasos específicos que son críticos para el éxito de la protocol son: la incorporación de DMSO en la PCR Master Mix 1, la congelación de la PCR Master Mix 1 antes de la adición de la mezcla maestra 2, el uso de la polimerasa comercial en Master Mix 2 y la modificación de la memoria intermedia de Cytomix electroporación. En nuestra experiencia, es necesario usar el doble del número de células para C transfecciones terminal de marcado como para N terminal de transfecciones de etiquetado con el fin de lograr una proporción similar de los pocillos positivos. Por lo tanto, todos los pasos deben realizarse como se ha descrito. Esta técnica sólo es probable que tenga éxito cuando la transfección de la forma de insecto tripanosoma procíclico. Formas sanguíneas tienen una menor eficiencia de transfección 14, por otra parte son propensos a morir durante la selección debido a la toxicidad dependiente de la densidad que no está relacionada con el fármaco selectivo. Por lo tanto, nuestro protocolo anterior representa la mejor tecnología actual para etiquetar de forma tripanosomas torrente sanguíneo 9. También es probable que el transeficiencia infección variará dependiendo del aislado tripanosoma específico. Este protocolo se ha optimizado el uso de 927 SMOX procíclico formas - otras cepas pueden requerir una optimización adicional. Medidas que pueden aumentar la probabilidad de éxito incluyen: el aumento de la cantidad de amplicón de PCR, el aumento del número de células incluidas en la transfección. Se presenta un método donde cientos de proteínas se pueden etiquetar de forma paralela. Esto facilitará estudios a gran escala sobre la localización y la interacción, como complemento de grandes conjuntos de datos existentes y proporcionar información de gran valor para la comunidad. plantillas de cebadores están disponibles bajo petición y una lista de plantillas de plásmidos está disponible a partir de: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei es un parásito protozoario que causa trypanosomasis africana humana y nagana en el ganado. T. brucei es un organismo ideal para el análisis de la función de la proteína debido a la combinación de un genoma de alta calidad, numerosos proteómica y conjuntos de datos transcriptómica y herramientas moleculares bien desarrollados 1-3. Los avances en la proteómica y la secuenciación han dado lugar a grandes conjuntos de datos que ponen de relieve los genes potencialmente interesantes 4-6; sin embargo, muchos genes tienen un mínimo de información asociada con ellos en las bases de datos existentes. Por tanto, existe una necesidad de un método de alto rendimiento para ayudar a la caracterización funcional de proteínas. La expresión de una proteína marcada puede dar una multiplicidad de conocimientos sobre la función de una proteína. Por ejemplo, una proteína marcada con una proteína fluorescente o epítopo puede ser localizada mediante microscopía de fluorescencia, lo que da información acerca de dónde la protein podría estar ejerciendo su efecto biológico. Alternativamente, una proteína marcada con un TAP 7, 8 o HaloTag His se puede purificar para los ensayos bioquímicos y la identificación de sus compañeros de interacción. Recientemente hemos desarrollado una metodología robusta para el etiquetado T. brucei 9. Este utilizado durante mucho tiempo cebador de PCR para generar el ADN para la transfección y permitió que el marcaje de proteínas de docenas en paralelo - una mejora importante de los protocolos existentes. Ahora hemos mejorado la escalabilidad de este protocolo en formas procíclicas en un orden de magnitud. A continuación, presentamos nuestro método en el que llevamos a cabo la PCR y la transfección en placas de 96 pocillos, con la recuperación y la selección se produce en placas de 24 pocillos. Como cientos de proteínas ahora se pueden etiquetar de forma paralela este método proporciona un método rentable y viable para etiquetar todo el genoma tripanosoma.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleótido Tecnologías de</td><td>vida</td><td></td><td>na solo desalinización (no utilice purificación adicional)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Incluido con el paquete Expand HiFi</td><td>Debe ser de grado PCR</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>cualquier</td> polímero Expand HiFi de buena reputación <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>Manipulador de placas HT-200</td><td>Aparato</td><td>Harvard HT-200</td><td>Maneja las placas eléctricas de 96 pocillos</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROCHAPADO 4 mm</td><td>Aparato</td><td>Harvard 45-0452</td><td>Galvanoplastia para la electroporación de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Clorhidrato de blasticidina S</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina b Oro</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Fleomicina</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>Matraz TC de 225 cm, cuello inclinado, tapón fenólico</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 placas de cultivo de pocillos</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; Enfriador de PCR, sistema de almacenamiento en frío sin hielo para placas de 96 pocillos y tubos de PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA Multiply</td><td></td></tr><tr><td>&reg de 96 pocillos; Placa PCR con faldón lateral</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; trypanosoma brucei</em

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Las mejoras en espectrometría de masas, secuenciación y bioinformática han generado grandes conjuntos de datos de genes potencialmente interesantes. El etiquetado de estas proteínas puede proporcionar información sobre su función al determinar su localización dentro de la célula y permitir la identificación de los socios de interacción. Recientemente hemos publicado un método rápido y escalable para generar líneas celulares de Trypanosoma brucei que expresan una proteína marcada del locus endógeno. El método se basó en un plásmido que generamos que, cuando se combina con la PCR de cebador largo, se puede utilizar para modificar un gen para codificar una proteína marcada en cualquiera de los extremos. Esto permite el marcaje de docenas de proteínas tripanosomas en paralelo, lo que facilita la validación a gran escala de genes candidatos de interés. Este sistema se puede utilizar para marcar proteínas para la localización (utilizando una proteína fluorescente, una etiqueta de epítopo o una etiqueta de microscopía electrónica) o bioquímica (utilizando etiquetas para la purificación, como la etiqueta TAP (purificación por afinidad en tándem)). En este trabajo se describe un protocolo para realizar la PCR de cebador largo y la electroporación en placas de 96 pocillos, con la recuperación y selección de tripanosomas transgénicos en placas de 24 pocillos. Con este flujo de trabajo, se pueden etiquetar cientos de proteínas en paralelo; Esta es una mejora de orden de magnitud con respecto a nuestro protocolo anterior y ahora es posible el etiquetado a escala del genoma.

En este transfección representativa, los cebadores se diseñaron utilizando la secuencia de comandos Perl TagIt 9 y sintetizados comercialmente. El 96 pocillos PCR se llevó a cabo y validó como se describe (Figura 1A); en este ejemplo, 95/96 PCR tuvieron éxito (Figura 1B). En nuestra experiencia, la repetición de las reacciones fallidas ya sea con los cebadores originales o re-sintetizado cebadores no da lugar a una PCR con éxito. Los amplicones se transfirieron a placas de 96 pocillos de electroporación para la electroporación (Figura 2A) y después se transfirieron a placas de cultivo de 24 pocillos para la recuperación y selección. Después de tiempo suficiente para permitir la selección que se produzca, los pocillos se marcaron para la supervivencia antes de un análisis adicional. En este ejemplo, pozos 88/96 (92%) fueron positivos después de la selección de los 15 días. <img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1: Validación de PCR del patrón largo de imprimación (A) para la transferencia de productos de PCR de 96 pocillos placa de PCR para el gel de agarosa para la validación de PCR.. (B) A 96 pocillos gel representante validación de PCR para el marcado de 95 genes en el terminal N, y 1 amplicón no contiene &#39;homología 5 de orientación para actuar como un control negativo en la transfección. Las muestras se cargan en un 1% (w / v) en gel de agarosa y se resolvieron a 100 V durante 30 minutos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Figura 2: de 96 pocillos electroporación y selección (A) Modelo para la transferencia de las células sometidas a electroporación de 96 pocillos plat electroporación.e a placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. (B) Un diagrama esquemático que muestra una puntuación típica en vivo / muerto después de 15 días de selección en placas de 24 pocillos. El verde representa una transfección exitosa, gris representa un pozo con sólo las células muertas. En este ejemplo, 88/96 (92%) de los pozos contenían parásitos transfectadas con éxito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La adición de una etiqueta a una proteína es una forma poderosa de obtener información sobre su función. Aquí, describimos un protocolo para marcar endógenamente cientos de proteínas de Trypanosoma brucei en paralelo, de modo que se pueda lograr el marcaje a escala del genoma.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

El objetivo general de este método es marcar proteínas en Trypansoma brucei de manera de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los cinetoplastídeos sobre la localización y la función potencial de grandes cohortes de proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que grandes cantidades de proteínas pueden marcarse rápidamente y en paralelo de forma sencilla.Aunque este método puede proporcionar información sobre la localización, las interacciones de grandes cohortes de proteínas también se pueden investigar utilizando otras etiquetas. Por ejemplo, la etiqueta BirA para un experimento de mapeo de proximidad bio-ID. El procedimiento será demostrado por Ross Madden, un asistente de investigación de nuestro laboratorio.Antes de comenzar este procedimiento, preenfríe un enfriador para PCR de 96 pocillos en el congelador a menos 80 grados Celsius. Prepare la Mezcla Maestra A combinando lo siguiente en un tubo de 10 mililitros: 2, 100 microlitros de agua destilada desionizada, 105 microlitros de DMSO de grado PCR, 105 microlitros de dNTPs 10 milimolares y 105 microlitros de la plantilla pPOT.Vierta la Mezcla Maestra A en un depósito de reactivo y alícuota 23 microlitros de la Mezcla Maestra A en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Utilizando una pipeta multicanal de 12 canales P20, agregue dos microlitros de cebadores agrupados de 100 micromolar a cada pocillo cargado. Selle la placa con una película.Colóquelo sobre el enfriador de PCR previamente enfriado y déjelo congelar durante un mínimo de 20 minutos a menos 80 grados Celsius. La congelación de la mezcla maestra de PCR A es fundamental para garantizar una reacción de inicio en caliente eficiente, incluso cuando se utiliza una polimerasa específica de inicio en caliente. Esto permite una amplificación reproducible y de alto rendimiento.Mientras la placa de PCR está en el congelador, prepare la Mezcla Maestra B. Combine lo siguiente en un tubo de 10 mililitros: 2.048 microlitros de agua destilada desionizada, 525 microlitros de tampón 10X y 52,5 microlitros de polimerasa, para un volumen total de 2.626 microlitros por placa. Retire la placa de PCR y el enfriador de PCR del congelador a menos 80 grados Celsius.Con la placa aún en el enfriador de PCR, agregue rápidamente 25 microlitros de la Mezcla Maestra B encima de la Mezcla Maestra A congelada en cada pocillo, para un volumen total de reacción de 50 microlitros. Este paso es crítico en cuanto al tiempo y debe completarse antes de que la Mezcla Maestra A se derrita. Selle la placa con una película adhesiva.Configure el termociclador como sigue: 94 grados Celsius durante 10 minutos, luego, 30 ciclos de 94 grados Celsius durante 15 segundos, 65 grados Celsius durante 30 segundos y 72 grados Celsius durante dos minutos, seguido de un periodo final de extensión de 72 grados Celsius durante siete minutos. Una vez que el bloque haya alcanzado 94 grados Celsius, coloque la placa de PCR en el termociclador e inicie el programa de amplificación.Comience este procedimiento preparando un gel de agarosa al 1 % grande en tampón de electroforesis Tris-acetato EDTA o TAE, con cuatro hileras de pocillos. Cargue un marcador de ADN de un kb en los pocillos primero y 28 de cada hilera. El siguiente paso es transferir dos microlitros de producto de PCR directamente, sin tampón de carga de ADN, a cada carril del gel, siguiendo el patrón mostrado aquí.Por ejemplo, los productos de PCR de las filas A y B de la placa de PCR se cargan en los pozos numerados con números impares y pares de la primera fila del gel, respectivamente. Trabajando rápidamente para reducir la posibilidad de contaminar los amplicones, cargue los productos de PCR de la fila A de la placa de PCR en los pozos impares de la primera fila del gel. Luego, cargue los productos de PCR de la fila B de la placa de PCR en los pozos pares de la primera fila del gel.Cargue los productos de PCR de las filas C y D de la placa de PCR utilizando este mismo patrón, colocando la fila C en los pozos impares y la fila D en los pozos pares de la segunda fila del gel. Continúe con este patrón de carga hasta que cada pozo de la placa de PCR se haya cargado en el gel. Coloque el gel en el tanque de electroforesis y llene el tanque con tampón de corrida TAE hasta que el gel quede sumergido.Correr a 100 voltios durante 30 minutos. Visualizar utilizando un transiluminador UV. Aquí se muestra un gel de agarosa representativo de validación de PCR de 96 pocillos, en el que 95 de las 96 PCR tuvieron éxito.La PCR fallida fue la H11. Este procedimiento utiliza la línea celular SMOXP9 de Trypansoma brucei, forma procíclica. Cultive las células hasta la densidad adecuada según se describe en el texto del protocolo y recolecte el número requerido de células mediante centrifugación a 800 × g durante 10 minutos.Comience a prepararse para la electroforesis mientras las células se centrifugan. Conecte el manipulador de placas al electroforizador. En la unidad del electroforizador, ajuste el voltaje a 1.500 voltios, la duración del pulso a 100 microsegundos, el número de pulsos a 12 y el intervalo entre pulsos a 500 milisegundos.En el manipulador de placas, ajuste el conteo de pulsos a uno. Utilizando una pipeta multicanal de 12 canales P200, transfiera las reacciones de PCR desde la placa de PCR a una placa desechable de electroforesis de 96 pocillos. Lave las células con 10 mililitros de citomix modificado y centrifugue nuevamente a 800 × g durante 10 minutos.Re-suspender las células en 23 mililitros de citomix modificado para obtener una concentración final de cinco por 10 a la séptima células por mililitro. Transferir la suspensión celular a un depósito de reactivo. Pipetear 200 microlitros de la solución celular en cada pocillo de la placa de electroforesis y mezclar con el producto de PCR mediante pipeteo.Utilice un tejido para eliminar cualquier gota de la parte superior de la placa y evitar cortocircuitos. Aplique una película sellante en la parte superior de la placa de electroforesis, colocándola de manera que deje descubiertos los orificios para los electrodos en la parte superior e inferior de cada columna. Evite cubrir los puntos elevados utilizados para guiar la película.Cargue la placa de electroforesis en el manipulador de placas y cierre la tapa. Presione el pulso en la unidad de electroforesis. Después de la electroforesis, las células deben transferirse rápidamente a cuatro placas de cultivo celular de 24 pocillos que contienen un mililitro de medio SDM-79 por pocillo para su recuperación.Utilice una pipeta multicanal de 12 canales P200 con cada punta alternativa ausente, de modo que las seis puntas restantes se alineen con las seis filas de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Después de transferir las células de la placa de 96 pocillos a la placa de 24 pocillos, lave los pocillos de la placa de 96 pocillos con el medio de los pocillos correspondientes de la placa de 24 pocillos. Luego, transfiera el lavado nuevamente a los pocillos de la placa de 24 pocillos.Transfiera las células electro poradas desde la placa de electro poración de 96 pocillos hasta las placas de cultivo celular de 24 pocillos siguiendo el patrón predefinido que se muestra aquí. Por ejemplo, las células de los pocillos con número impar de la fila A de la placa de 96 pocillos se transfieren a la fila A de la placa A, mientras que las células de los pocillos con número par de la fila A de la placa de 96 pocillos se transfieren a la fila A de la placa C. Después de cada transferencia de células desde la placa de 96 pocillos hasta la placa de 24 pocillos, lave los pocillos en la placa de 96 pocillos con medio de la fila correspondiente de la placa de 24 pocillos. Luego, transfiera el lavado de vuelta a la placa de 24 pocillos.Transferir las células a las placas de 24 pocillos es confuso, pero debe ser capaz de rastrear las líneas celulares resultantes hasta el ID del gen correcto. Es fundamental realizar este paso rápidamente para mantener las células sanas. Después de que todas las células electro poradas se hayan transferido a las cuatro placas de 24 pocillos, coloque las placas de 24 pocillos en una caja de plástico limpia con tapa que forme un sello hermético. Coloque la caja en un incubador a 28 grados Celsius.Entre seis y ocho horas después, añada a cada pocillo un mililitro de SDM-79 con 10 % de FCS que contenga antibiótico selectivo. Incube a 28 grados Celsius durante nueve a 10 días hasta que las líneas celulares transgénicas sean visibles. Después de una transfección en placas de 96 pocillos para marcar 96 proteínas diferentes en el extremo terminal, las células se transfieren a placas de cultivo celular de 24 pocillos para recuperación y selección.A continuación, se evalúa cada pocillo para determinar si contiene células sanas resistentes al fármaco. Un pocillo saludable contiene predominantemente células altamente activas que se observan brillantes en microscopía de contraste de fases. En este esquema de ejemplo, el color verde representa un pocillo con transfección exitosa, y el gris representa un pocillo con solo células muertas.88 de 96, o 92% de los pocillos, contienen parásitos transfectados con éxito tras 15 días de selección. Una vez dominado, se necesitará aproximadamente una hora desde el conteo de las células hasta su siembra tras la electrotransferencia. Al intentar este procedimiento, es importante recordar añadir las drogas selectivas entre seis y ocho horas después de la transfección.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar cohortes grandes de proteínas en Trypansoma brucei.

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