Name: Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de Drosophila En un olfatómetro de cuatro cuadrantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a evaluar comportamientos olfativos en Drosophila melanogaster mediante un olfatómetro de cuatro cuadrantes con seguimiento automatizado. Este método versátil permite estudiar respuestas de poblaciones grandes y explorar bases neuronales del procesamiento sensorial.

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Agradecemos a Terry Shelley por fabricar la arena de mosca y el recinto hermético a la luz, a Liz Marr por su ayuda con el mantenimiento del stock de moscas, y a Xiaojing Gao y Junjie Luo por su ayuda con el código Matlab utilizado para el análisis de datos. Agradecemos a Johan Lundström del Monell Chemical Senses Center por demostrar su configuración de entrega de olores. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Whitehall (CJP) y NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

1. Configuración de la Asamblea <ol><li> Fabricación la arena en forma de estrella (19,5 cm por 19,5 cm por 0,7 cm) de politetrafluoroetileno (PTFE) de acuerdo con el dibujo (Materiales suplementarios, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf), siempre. La arena puede ser fabricado por un una instalación de encargo comercial o. </li><li> Adquirir dos placas de vidrio (20.25 cm por 20.25 cm con espesor de 2 mm), y perforar un agujero (~ 0,7 cm de diámetro), precisamente en el centro de una de las placas de vidrio utilizando una broca de diamante recubierto. </li><li> Fabricar una caja hermética a la luz el comportamiento de la arena de comportamiento. También la fabricación de una caja hermética a la luz de la cámara para la cámara de vídeo CCD de infrarrojos de acuerdo con los planos proporcionados (materiales complementarios, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Las cajas pueden ser fabricados por un encargo una instalación comercial o. </li><li> Montar la unidad de aire acondicionado en la pared posterior y las matrices de LED en las paredes laterales de la caja comportamiento. Coloque la sonda de temperaturaen el cuadro de la conducta a través de un orificio lateral para la retroalimentación de la temperatura en tiempo real y el ajuste (ver figuras 1 y 2 para más detalles). </li><li> Coloque el filtro de IR y polarizador circular para la cámara, y montar el conjunto en la caja de la cámara. El cuadro de comportamiento y la caja de la cámara están separadas por una ventana de cristal para un mejor control de la temperatura de la caja de comportamiento (ver las figuras 1 y 2 para más detalles). </li><li> Conectar la cámara CCD de infrarrojos a un adaptador de cámara. Conecte el adaptador de la cámara a un convertidor de USB. Conectar el convertidor de USB a un puerto USB del ordenador para la adquisición de datos. </li><li> Instalar el controlador del convertidor de vídeo en el ordenador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Opcionalmente, instale el software de procesamiento de imágenes proporcionado por el fabricante del convertidor de vídeo USB para acceder a una gama más amplia de opciones de la cámara y los parámetros de adquisición. </li><li> Conecte la unidad de aire acondicionado (a través de &quot;salida&quot;En la parte posterior del controlador de temperatura) y la sonda de temperatura (a través de&quot; termopar &quot;en la parte posterior del controlador de temperatura) al controlador de temperatura. Coloque la sonda en la caja de comportamiento. Nota: El sistema de control de temperatura en nuestro diseño es capaz de mantener la temperatura de la caja entre 18 ° C y 30 ° C. Temperaturas ambiente altas o más bajas podrían ser útiles para thermogenetic (dTRPA1, TRPM8 o shibire ts) experimentos para manipular la actividad neuronal o inhibir la transmisión sináptica. Para la mayoría de los experimentos, la temperatura se mantiene a 25 ° C. </li><li> Montar el sistema de suministro de olor en los siguientes pasos (ver Figura 1B para esquemas detallados y accesorios de conexión): <ol><li> Utilice el regulador de presión de aire para controlar la entrada de aire del sistema de aire central. Conectar un filtro de aire de carbono (lleno de carbón vegetal) al regulador de presión para purificar el aire de la central de unasistema de IR. </li><li> Montar el sistema de control de flujo que consta de múltiples canales regulados por los tubos del medidor de caudal de alta resolución. </li><li> Conectar la salida del filtro de aire de carbono a los tubos del medidor de caudal a través de un colector tal como se muestra en la Figura 1B y 2F. Dirigir la salida de los tubos del medidor de caudal a través de válvulas de solenoide de 3 vías con control electrónico para regular si el aire limpio dejando a los medidores de flujo es expulsado a la habitación o entró en cámaras de olor a la medida 24. </li><li> Instalar el controlador de la válvula solenoide de acuerdo con el manual del fabricante. </li></ol></li><li> Instalar el medidor de flujo de aire electrónico mediante la conexión a un dispositivo de adquisición de datos (DAQ) y una fuente de alimentación de acuerdo con el manual del fabricante. Instalar el software de interfaz de adquisición de datos para verificar caudales iguales en cada cuadrante de la arena antes de cada experimento. </li></ol> 2. Preparación olfativa Estímulos <ol><li> Preparar 5 olorcámaras de hormigas 24 que constan de un recipiente exterior de plástico, vidrio recipiente interior, una tapa de PTFE de inserción a medida, tapa del recipiente original con parte central retirados, y dos válvulas unidireccionales. Nota: Una junta tórica alrededor de la tapa PTFE podría ser utilizado para prevenir la fuga de aire desde la cámara de olor durante la perfusión olor. En la figura 1 esquemática y la Figura 2 para las fotos de las cámaras. </li><li> Utilice cuatro cámaras de olor para controles de disolvente, y una cámara para un odorante prueba. Llenar los recipientes de vidrio con 1.000 l de dilución de disolvente o odorante (prueba de olores + disolventes apropiados, mezclar bien antes de los experimentos), coloque el recipiente de vidrio dentro de la cámara de plástico correspondiente (no se derrame el líquido en la cámara de plástico) y apretar la tapa . Asegúrese de utilizar siempre una cámara limpia para el odorante de ensayo y controles de disolvente. Nota: atracción olfativa puede ser desencadenada por la dilución 1/16 de vinagre de manzana (5% de acidez) en water. Por el contrario, el comportamiento de repulsión olfativo puede estudiarse mediante el uso de una dilución de 10% de propionato de etilo en aceite mineral. estímulos de control en estos casos son cámaras de olor con aceite mineral puro. </li></ol> 3. Preparación de la mosca <ol><li> Posterior vuela en medio de harina de maíz. Coloca 30 masculinos y 30 femeninos en las moscas de los padres de una botella estándar, y dejar que ellos ponen sus huevos durante 5 días a 25 ° C o temperatura ambiente. </li><li> Para cada experimento, recoja recién eclosed (&lt;1 día de edad) 25 masculinos y 25 moscas hembra bajo breves CO 2 anestesia. </li><li> Mantener las moscas en un vial con medio mosca estándar durante 2-4 días. </li><li> 40-42 h antes del experimento, transferir las moscas sin CO 2 anestesia &#160; a un vial con ~ gel de agarosa 10 ml 1%. Esto evitará que las moscas humidificados sin alimentos, lo que ayuda a aumentar su actividad locomotora. Nota: Más del 90% de las moscas debe sobrevivir a la hambruna. Algunos genotipos son menos curartu y no puede hacerlo a través de un hambre de 40 horas. En esos casos, los períodos más cortos como 24 a 28 hr son aceptables, pero deben mantenerse el mismo para todas las condiciones experimentales y repeticiones. </li></ol> 4. respuestas de comportamiento a atractivos y repelente Odorantes <ol><li> Encienda el controlador de temperatura y ponerlo a 25 ° C. </li><li> Conectar las cámaras de olor (odorizantes control y de prueba) mediante la inserción del tubo a la salida de la cámara de odorizante y para el push-to-accesorio de conexión en el cuadro de comportamiento. </li><li> Compruebe la velocidad de flujo en cada cuadrante usando el metro de flujo de aire para asegurarse de que el control y corrientes de aire de olor son igual a 100 ml / min. </li><li> Limpiar la arena mosca PTFE y las placas de vidrio, con un 70% de etanol 2-3 veces y permitir que se dispone de aire seco (~ 3-4 min). </li><li> Colocar las placas de vidrio a la arena con pinzas. </li><li> Transferencia vuela sin anestesia de CO 2 a la arena a través del agujero en una de las placas de vidrio. En popaer la transferencia, coloque una malla circular en el agujero para evitar que las moscas escapen. Nota: CO 2 anestesia se ha demostrado que afecta el comportamiento de Drosophila 25 y no debe ser usado dentro de las 24 horas de un experimento conductual. </li><li> Coloque la arena con las moscas en la cámara hermética a la luz, conectar las cuatro corrientes de aire de control conectando el tubo conectado a la conexión en la caja de la conducta de las esquinas de la arena push-to-connect, cierre la puerta de la cámara y esperar 10- 15 minutos para dejar que las moscas aclimatarse al nuevo ambiente. Si es posible, apagar las luces en la sala donde se realizan los experimentos, para evitar posibles fugas de luz mínima que puede sesgar los resultados experimentales. </li><li> Ejecutar un experimento de control 5-10 minutos, en los que las moscas están expuestos a corrientes de aire 4 de control. </li><li> Analizar los datos inmediatamente (ver sección de análisis de datos más adelante) para asegurarse de que las moscas se distribuyen uniformemente en la arena, y la atracción Índice está cercaa 0. Este paso es esencial, ya que verifica que no hay fuentes no controladas de preferencia o evitación dentro de la arena (por ejemplo, la luz se escapa desde el exterior, la distribución desigual de la temperatura, arena desigual, la contaminación de olores, etc.). Si las moscas se distribuyen de manera desigual o de su actividad locomotora es baja, desechar las moscas, limpiar la arena de nuevo (paso 4.4) y utilizar un nuevo lote de moscas para repetir el experimento. </li><li> Conectar la cámara de odorizante de prueba a la configuración mediante el encendido de las válvulas de 3 vías y de volver a conectar los tubos conectores. </li><li> Ejecutar experimento de prueba durante 5-10 minutos y analizar los datos como se discutió en la sección 5 (véase también referencia 14 y la Figura 3). Grabaciones de más de 20 minutos puede resultar en archivos de datos que pueden ser difíciles de procesar computacionalmente. Si se desean grabaciones experimentales más tiempo, rápidamente detener y volver a iniciar el programa de seguimiento. Esto resulta en una brecha sec ~ 10 entre grabaciones experimentales. </li><li> Discarmoscas d. </li><li> placas de vidrio de la arena y limpias, con un 70% de etanol (paso 4.4), y reemplazan tubos conectores dentro del recinto hermético a la luz. Para acelerar los experimentos, una nueva arena limpia se puede utilizar, y la arena sucia limpiar el desempeño de corridas experimentales. </li><li> Ejecutar otro experimento con un nuevo lote de moscas, si es necesario. Si varios experimentos se realizan en el mismo día, tener un cuidado extremo para asegurarse de que ningún odorante se deja en el sistema a partir de una prueba de funcionamiento anterior. Esto normalmente no es un problema con bajas concentraciones de sustancias olorosas o con CO 2, pero puede ser necesaria para los estímulos altamente concentrados hasta una brecha de 24 horas entre las corridas experimentales. Además, todos los tubos de flujo después de que los tubos se puede reemplazar si se sospecha de contaminación odorizante durante los experimentos de control. Siempre deje el aire seco entre en los experimentos para limpiar continuamente el sistema de </li></ol> Análisis 5. Datos Nota: El softwar adquisición de seguimiento mosca sugeridoe (se detalla en Materiales), pistas de moscas en tiempo real durante la adquisición, y guarda el sello de tiempo y coordenadas de todas las moscas detectadas en formato * .dat. Hemos desarrollado una rutina de Matlab a medida para convertir los datos en un formato de Matlab, y para analizar los datos. Los ejemplos de código se proporcionan en Materiales complementarios, pero los detalles de aplicación dependerán del software utilizado para la adquisición de datos. <ol><li> Cargar los datos en bruto. Crear una máscara espacial que sigue el contorno de la arena y aplicar la máscara a los datos en bruto para eliminar todos los puntos de datos que caen fuera de la arena, ya que representan el ruido (Figura 4A, Código suplementario MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. metro). </li><li> Eliminar todos los puntos de datos que se mueven a una velocidad inferior a 0.163 cm / s durante más de 3 segundos, como estos datos es probable que sea el ruido o generada por las moscas sin movimiento (Figura 4B, Código suplementario TemporalFiltering.m). </li><li> Visualizar los datos restantespuntos trazándolos todos a la vez o como trayectorias individuales (Figura 3, Código suplementario SingleTrajectoryViewer.m). Nota: La ubicación de los límites de olor en el campo de cuatro probablemente depende de una serie de factores, como las características de cada odorante y las tasas de flujo de aire que se utiliza. Por ejemplo, los odorantes fácilmente volátiles probablemente llenar el cuadrante olor más plenamente que odorantes menos volátiles. Así, es probable que cada odorante puede exhibir ligeramente diferentes límites de olor. El uso de un detector de fotoionización para medir los límites de olor puede ser problemático, ya que utiliza un vacío para muestra de aire a partir de un punto en particular, y por lo tanto altera la concentración de olor en ese punto. Sin embargo, los límites de olor se pueden estimar rápidamente sobre la base de datos de comportamiento de la mosca. Por ejemplo, un límite de olor basado en pistas de moscas acumulados en respuesta a diferentes olores se puede observar claramente en las figuras 3C y 3D. </li><li> Californiacular un índice de atracción para determinar si los experimentos de control no generan respuesta preferencia, y también para acceder a la respuesta a un odorante (o optogenético 9) estímulo. Para calcular un Índice de atracción (AI), utilice los últimos 5 minutos de un control o grabación de prueba. Para obtener una medida de la atracción que cae entre 1 (atracción absoluta) y -1 (repulsión absoluta), la siguiente fórmula se usa para calcular el AI: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> donde prueba N es el número de puntos de datos en el cuadrante de prueba, control N es el número promedio de puntos de datos en los tres cuadrantes de control. Esta medida es intuitivo como ninguna preferencia estaría indicada por valores cercanos a cero. Sin embargo, no indica correctamente la proporción del número total de moscas que se encuentran en el cuadrante odorante. Para obtener esta medida, un Índice de Porcentaje (PI) se puede utilizar: <img alt="Ecuación 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg&quot; /&gt; donde prueba N es el número de puntos de datos en el cuadrante de ensayo, y N total es el número total de puntos de datos en los cuatro cuadrantes. Esta fórmula proporciona una medida que cae entre 0 y 1, con 0,25 correspondiente a ninguna preferencia de comportamiento (Figura 3E y 4C, Código suplementario AttractionIndex.m). </li><li> Ejecutar 5-10 repeticiones de cada condición experimental, el uso de un nuevo grupo de moscas para cada repetición. Comparación de los índices de atracción entre las condiciones o en contra de los controles mediante la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov (Figura 3F, la función kstest2 en Matlab). </li></ol>

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<li>Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+discrimination+in+Drosophila%3A+from+neural+population+codes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior.</a> Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El olfatómetro de cuatro campos se describe aquí es un sistema de comportamiento versátil para el estudio de las respuestas olfativas de grandes poblaciones de tipo salvaje y mutante moscas Drosophila. Cada experimento tiene ~ 1 hr (incluida la instalación, corridas experimentales, y limpieza), y 4-6 experimentos se puede realizar de forma rutinaria cada día. Un ensayo típico usando 40-50 moscas durante 5 minutos genera aproximadamente 450.000 puntos de datos rastreados para su análisis. La configuración descri...

La capacidad de adaptarse y responder al entorno externo es fundamental para la supervivencia de todos los animales. Un animal necesita para evitar peligros, buscar comida y encontrar compañeros, y aprender de las experiencias anteriores. Los sistemas sensoriales funcionan para recibir una variedad de estímulos, tales como visual, químicas y mecanosensorial, y enviar estas señales al sistema nervioso central debe ser interpretado y decodificada. Entonces, el cerebro dirige conductas motoras apropiadas basadas en la percepción del medio ambiente, tales como la búsqueda de alimentos o escapar de un depredador. La comprensión de cómo los sistemas sensoriales detectan el mundo exterior, y cómo el cerebro decodifica y dirige las decisiones, es un reto importante en la neurobiología. Drosophila melanogaster es un sistema poderoso modelo para la investigación de cómo los comportamientos de los nervios de guía circuitos. Además de ser sencillo y barato de mantener, Drosophila exhiben muchos de los comportamientos estereotipados diversas y complejas, sin embargo, lo hacen con un compacT del sistema nervioso de los cerca de 100.000 neuronas. Existen poderosas técnicas genéticas para manipular el genoma de Drosophila, y miles de líneas transgénicas que se han generado de forma selectiva y reproducible etiquetar los mismos subconjuntos de neuronas 10-13. Estas líneas transgénicas se pueden utilizar para manipular selectivamente la actividad de las neuronas marcadas (activar o inhibir), y estas manipulaciones se pueden utilizar para investigar cómo neural comportamientos funciones de guía. Ensayos de comportamiento múltiples se han desarrollado para el estudio de diversos comportamientos de Drosophila. Drosophila, al igual que muchos animales, usan su sentido del olfato para guiar muchas opciones de comportamiento, tales como la búsqueda de alimentos, la búsqueda de compañeros, y evitar peligros. Por lo tanto, el olfato es un buen sistema sensorial para investigar cómo se detectan e interpretados por el sistema nervioso de un animal para guiar las decisiones adecuadas estímulos externos. Como tal, un número de ensayos han sido desarrollados para Investigalarvario Ting y comportamientos olfativas adultos. Tradicionalmente, los comportamientos olfativas en Drosophila se ensayaron mediante un paradigma laberinto en T de dos elección, que se puede utilizar para ensayar innata y los comportamientos aprendidos olfativas 3. En este ensayo, alrededor de 50 moscas se les da a elegir entre dos tubos: uno de los tubos contiene el olor en cuestión y la otra contiene un odorizante de mando (generalmente el disolvente olor). Las moscas se les da un período determinado de tiempo para tomar una decisión, y después se contó el número de moscas que se encuentran en las diferentes cámaras. Aunque el T-laberinto es un ensayo simple para muchos experimentos, hay varias limitaciones. Por ejemplo, los comportamientos olfativas se miden en un solo punto del tiempo, y diferentes elecciones realizadas antes de este punto de tiempo se descartan. Del mismo modo, los comportamientos individuales de las moscas dentro de la población se descuidan. Además, el laberinto en T requiere conteo manual de las moscas, que puede introducir errores. Finalmente, puesto que sólo hay dos opciones de medición, estereduce la potencia estadística a menudo requerido para detectar sutiles cambios de comportamiento. Una alternativa a una elección de dos T-laberinto es un olfatómetro de cuatro cuadrantes (de cuatro campos) 14-18. En este ensayo, los animales exploran un escenario en el que cada una de las cuatro esquinas de la arena se llena con una posible fuente de aire olorizado. La arena tiene una forma de estrella fruncido para maximizar la formación de cuatro cuadrantes de olor definidos experimentalmente. Si el olor se suministra en una de las esquinas entonces se incluirá solamente en que un cuadrante. Los comportamientos de los animales pueden ser rastreados a medida que entran y salen del cuadrante olor, y fácilmente en comparación con su comportamiento en los tres cuadrantes de control. Así, el ensayo olfatómetro de cuatro cuadrantes registros de respuesta de comportamiento espacial y temporal de los estímulos de olor más de un gran estadio experimental. El olfatómetro de cuatro cuadrantes fue desarrollado por primera vez por Pettersson et al. 15 y Vet et al. 17 para investigar el ollas respuestas de comportamiento de fábrica de los himenópteros parásitos individual. Faucher et al. 18 y 16 Semmelhack y Wang adaptaron la configuración para supervisar las respuestas olfativas de Drosophila individuo. El olfatómetro de cuatro cuadrantes es igualmente sensible a las respuestas de atracción y repulsión, lo que permite una amplia gama de odorantes y condiciones de ensayo. Software de seguimiento de mosca por encargo por escrito, desarrollado por Alex Katsov 19 y actualmente mantenido por Julian Brown (se detalla en Materiales), presentó ventajas adicionales para las implementaciones más recientes del olfatómetro de cuatro cuadrantes 14,20-23. Ahora es posible ensayar hasta 100 moscas simultáneamente en alta resolución espacial (27,5 píxeles / cm) y temporales (30 cuadros por segundo) de resolución, que permite extraer varios parámetros, tales como posición, velocidad y aceleración de las moscas en cualquier punto de tiempo. Esto permite que las investigaciones sobre la dinámica de las respuestas de comportamiento de las moscas a los olores 20 </sarriba&gt;. Cabe señalar, sin embargo, que la identidad de moscas individuales dentro de la población durante todo el período de seguimiento no se mantiene. En su lugar, cada pista mosca se registra durante el tiempo de dos pistas de la mosca no se cruzan. Momento en el cual, las nuevas pistas se les asignan después de las moscas divergen. Mediante la incorporación de otro software de captura de vídeo (que se detallan en la Tabla Materiales), la misma configuración permite que los períodos de seguimiento flexible y se podría utilizar para realizar un seguimiento de las moscas para un máximo de 24 h por la toma de imágenes a una velocidad inferior. Esta opción se utiliza para estudiar los comportamientos que ponen huevos de moscas y comparar sus posiciones corporales con las preferencias de oviposición 14. El olfatómetro de cuatro campos también se puede utilizar para estudiar las respuestas a multimodal (por ejemplo, olfativos y visuales) estímulos, o para combinar optogenético 9 o 21 thermogenetic estimulación con presentaciones de estímulos sensoriales. Además, la alta resolución temporal permite la extracción de trayectorias for cada una mosca individual en el conjunto de datos de conjunto. Por lo tanto, el método permite la investigación en comportamientos de la población-olfativas guiadas y las interacciones sociales individuales. Los datos generados por este ensayo son robustos y altamente reproducible, lo que permite el uso del olfatómetro de cuatro campos para pantallas de comportamiento. Se describe aquí el conjunto de configuración para un olfatómetro de cuatro cuadrantes. Además, demuestran su uso en el ensayo de atracción olfativa en respuesta a vinagre de manzana y repulsión en respuesta a propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, describimos y proporcionamos código de ejemplo para el análisis de los datos de seguimiento mosca grabados.

<table><tbody><tr><td><fuerte>sistema de suministro de aire&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td><fuerte>(Cantidad necesaria)</td></tr><tr><td>Tubos y conectores</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termoplástico NPT(F) Colectores</td><td>Cole-Parmer, IL, EE. UU</td>. <td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>Boquilla reductora hexagonal (1/4MNPT->1/8MNPT)</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td>. <td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>Tubería ( ID:1/8)</td><td>McMaster-Carr, Illinois, EE. UU</td>. <td>5108K43</td> Tubería de <td>50 pies</td></tr><tr><td>(ID:1/16)</td><td>McMaster-Carr, Illinois, EE. UU</td>. <td>52355K41</td> Accesorios de tubo de púas de <td>100 pies</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU.</td><td>5117K71</td><td>1 paquete</td></tr><tr><td>de accesorios de tubo de conexión a presión</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td>. <td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>accesorios de tubo de púas (1/4MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU.</td><td>5463K439</td><td>1 paquete (10)</td></tr><tr><td>Accesorios de tubo de púas (1/8MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td>. <td>5463K438</td><td>paquete de 2 (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Accesorios de tubo de púas (1/8MNPT->1/16BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td><td>. 5463K4</td><td>paquete de 2 (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Accesorios de tubo de púas (1/4MNPT->1/4BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU.</td> <td>5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>tapón de cabeza hexagonal</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td><td>. 48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>Regulador de presión de aire, filtro de aire y caudalímetros</td><td></td><td></td><td>(Cantidad necesaria)</td></tr><tr><td>Unidad de secado de gas de laboratorio</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, EE. UU</td>. <td>Modelo: L68-NP-303; código RS #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>Bastidores multitubo para tubos de flujo de 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, EE. UU</td>. <td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>Bastidores multitubo para tubos de flujo de 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, EE. UU</td>. <td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>Tubos de flujo de 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, EE. UU</td>. <td>R-03217-15</td><td>Cartucho de 9</td></tr><tr><td>válvulas</td><td>Cole-Parmer, IL, EE. UU</td>. <td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>Regulador de aire de precisión</td><td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td><td>. 6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>Válvulas soleniadas</td><td>Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>Controlador de válvula solenoide</td><td>ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr><tr><td>Medidor de flujo electrónico</td><td>Honeywell</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ (NI USB-6009, National Instruments) y a&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>Cámaras de olor Frasco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>de<td>polipropileno de boca ancha 2 oz; 60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>Se requieren al menos 5 por experimento, pero se requiere una cámara separada para cada dilución de cada odorante. Disponible en Container Store, parte # 635114)</td></tr><tr><td>Cámara de olor de vidrio, 0.25 oz</td><td>Sunburst Bottle</td><td>LB4B</td><td>Se requieren al menos 5 por experimento&nbsp;</td></tr><tr><td>Válvula de "entrada" para cámara de olores</td><td>Smart Products, Inc., CA, EE. UU</td>. <td>214224PB-0011S000-4074</td><td>1 de estas piezas se usa por cámara de olor, pero deben reemplazarse con frecuenciaVálvula</td></tr> <tr><td>de salida para cámara de olores</td><td>Smart Products, Inc., CA, EE. UU</td>. <td>224214PB-0011S000-4074</td><td>1 de estas piezas se usa por cámara de olor, pero deben reemplazarse con frecuencia</td></tr><tr><td>Junta tórica</td><td>RT Dygert International, MN, EE. UU</td>. <td>AS568-029 Buna-N O-R</td><td>1 paquete (100)</td></tr><tr><td>Fly arena, cámaras y cajas de comportamiento</td><td></td><td></td><td>(Cantidad necesaria)</td></tr><tr><td>Behavior y material de la caja de la cámara</td><td>Interstate plastics, CA, EE. UU.</td><td>Abs negro extruido (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td><td>1803 pulgadas</td></tr> <tr><td>cuadradasTeflón para inserciones de arena de mosca y cámara de olor, 3/8" de grosor, 12" x 12"</td> <td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td><td>. 8545K27&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Placas de vidrio, 1/8" de grosor, 9" x 9"</td> <td>McMaster-Carr, IL, EE. UU</td><td>. 8476K191&nbsp;</td><td>número arábigo</td></tr><tr><td>Controlador termoeléctrico de doble acción</td><td>WAtronix Inc, CA, EE. UU</td>. <td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>matriz de LED IR</td><td>Iluminación avanzada, Rochester, VT, EE. UU</td>. <td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 matrices de LED y una fuente de alimentación</td></tr><tr><td>Unidad de aire acondicionado Melcor</td><td>Store</td><td>&nbsp; MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>Imaging system</td><td></td><td></td><td>(Cantidad necesaria)</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) Lente con montura C</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EE. UU.</td> PEC21211 <td>KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N Cable de interconexión</td><td>B Y H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EE. UU</td><td>. SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>Adaptador de cámara DC-700</td><td>B Y H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EE. UU</td><td></td>. <td>SODC700 1</td></tr><tr><td>B+W 40,5 093 Filtro IR</td><td>B Y H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EE. UU</td>. <td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>TiFFEN 40.5 mm Polarizador circular</td><td>Amazon</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>Cámara de video IR</td><td>Industrial Vision Source, FL, EE. UU</td>. <td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)</td><td>1</td></tr><tr><td>Convertidor de vídeo USB</td><td>The Imagingsource, NC, EE. UU.</td><td>DFG/USB2-It</td><td>1</td></tr><tr><td>iFlySpy2 (software de seguimiento de moscas)</td><td>Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com</td><td>iFlySpy2</td><td>1</td></tr><tr><td>IC Capture 2.2</td><td>software The Imagingsource, NC, EE. UU. (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscelánea</td><td></td><td></td><td>(Cantidad necesaria)</td></tr><tr><td>Dremel herramienta rotativa</td><td>Dremel, Racine, WI, USA</td><td>Dremel 8000-03&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Brocas con recubrimiento de diamante para el corte de vidrio</td><td>Disponible de varios proveedores; MSC industrial Supply Co, Melville, NY</td><td>90606328</td><td>1</td></tr></tbody></table>

comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de<em&gt; drosophila</em&gt; en un olfatómetro de cuatro cuadrantes

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Un desafío clave en la neurobiología es entender cómo los circuitos neuronales funcionan para guiar los comportamientos adecuados con animales. Drosophila melanogaster es un excelente sistema modelo para este tipo de investigaciones, debido a sus comportamientos complejos, técnicas genéticas de gran alcance, y el sistema nervioso compacto. Ensayos de comportamiento de laboratorio han sido utilizados con Drosophila para simular propiedades del entorno natural y estudiar los mecanismos neurales que subyacen a los comportamientos correspondientes (por ejemplo fototaxis, quimiotaxis, el aprendizaje y la memoria sensorial) 1-3. Con la reciente disponibilidad de grandes colecciones de líneas transgénicas de Drosophila que etiquetan subconjuntos neuronales específicas, ensayos de comportamiento han asumido un papel destacado para vincular las neuronas con comportamientos 4-11. paradigmas versátiles y reproducibles, junto con las rutinas computacionales para el análisis de datos subyacentes, son indispensables para pruebas rápidas de líneas de vuelo con varios candidatos GenotypES. Particularmente útiles son las configuraciones que son flexibles en el número de animales sometidos a ensayo, la duración de los experimentos y la naturaleza de los estímulos presentados. El ensayo de elección también debería generar datos reproducible que es fácil de adquirir y analizar. A continuación, presentamos una descripción detallada de un sistema y el protocolo para ensayar las respuestas de comportamiento de moscas Drosophila en un gran estadio de cuatro campos. La configuración se utiliza aquí para probar las respuestas de las moscas a un único estímulo olfativo; sin embargo, la misma configuración puede modificarse para poner a prueba olfativa múltiple, los estímulos visuales o optogenética, o una combinación de estos. La configuración olfatómetro registra la actividad de las poblaciones de moscas que responden a los olores, y se aplican métodos de análisis computacionales para cuantificar los comportamientos de moscas. Los datos recogidos son analizados para obtener una lectura rápida de una prueba experimental, que es esencial para la recopilación de datos eficiente y la optimización de las condiciones experimentales.

Los cuatro cuadrantes olfactometer registros de ensayo y análisis de las actividades de senderismo de muchas moscas sobre un espacio de comportamiento grande. Odorantes pueden introducirse en los acondicionadores de corrientes de entrada de uno, dos, tres, o los cuatro cuadrantes. En ausencia de olores, las moscas se mueven libremente entre los cuatro cuadrantes. Este comportamiento es crucial para observar ya que indica que los sesgos no intencionales no se han introducido en el ensayo....

Describimos aquí una configuración conductual y un método de análisis de datos para analizar las respuestas olfativas de hasta 100 moscas del vinagre (Drosophila melanogaster). Este sistema puede ser utilizado con estímulos olfativos únicos o múltiples, y adaptable para la activación optogenética o el silenciamiento de subconjuntos neuronales.

Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de<em&gt; Drosophila</em&gt; En un olfatómetro de cuatro cuadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

El objetivo general de este montaje es analizar los comportamientos olfativos de moscas en un olfactómetro de cuatro cuadrantes utilizando un script de software automatizado para el seguimiento de moscas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los sistemas neuronales olfativos detectan el mundo externo y cómo el cerebro descifra y dirige las decisiones conductuales. La principal ventaja de esta técnica es que es versátil y robusta, y permite realizar pruebas repetidas de respuestas olfativas en poblaciones de moscas dentro de un área experimental amplia.Para este protocolo, prepare cinco cámaras de odoríferos que consten de un recipiente exterior de plástico, un recipiente interior de vidrio y un inserto de tapa de politetrafluoroetileno (PTFE) fabricado a medida. El inserto es una tapa de recipiente original con la parte central eliminada y dos válvulas unidireccionales adjuntas. Utilice cuatro de las cámaras de odoríferos como controles de disolvente y una cámara para un odorífero de prueba.Asegúrese de que cada cámara esté limpia y luego cargue un recipiente de odorante con un mililitro de disolvente o dilución de odorante. A continuación, verifique la posición del recipiente en la cámara de plástico y asegúrese de que no se haya derramado líquido. Fije la tapa utilizando la rosca y una junta tórica en la inserción de PTFE para evitar fugas.Criar las moscas en un medio estándar de harina de maíz. En un frasco estándar, colocar 30 machos y 30 hembras, y permitir que pongan huevos durante cinco días a temperatura ambiente. De estos frascos, recolectar moscas recién emergidas.Para cada cohorte experimental, recolecte 25 moscas macho y 25 hembras bajo una breve anestesia con dióxido de carbono y deje que la cohorte envejezca en medio estándar para moscas durante dos a cuatro días. De 40 a 42 horas antes del experimento, transfiera la cohorte a un vial con aproximadamente 10 mililitros de gel de agarosa al uno por ciento para mantener la humedad sin alimento. La inanición ayuda a aumentar el movimiento general, y más del 90 % de las moscas debería sobrevivir al proceso de ayuno.Si mueren más del 10%, lo cual puede ocurrir en un genotipo débil, intente utilizar un ayuno de un día para todas las moscas del experimento. Al menos cinco minutos con anticipación, encienda el controlador de temperatura y ajústelo a 25 grados Celsius. Luego, conecte las cámaras de odorante al área experimental mediante un tubo de plástico.Verifique la tasa de flujo de aire en cada cuadrante del área utilizando un medidor electrónico de flujo. Asegúrese de que las corrientes de aire de control y del odorizante funcionen ambas a 100 mililitros por minuto. Las moscas son muy sensibles al flujo de aire, y es fundamental verificar el flujo de aire de cada cuadrante antes de cada experimento.Ahora, limpie el área y las placas de vidrio utilizando etanol al 70%. Pase un paño por todas las piezas de dos a tres veces y déjelas secar completamente al aire antes de continuar. A continuación, sujete las placas de vidrio al área con abrazaderas.Luego, transfiera las moscas al recinto sin anestesia. Mediante la gravedad, permita que entren a través del orificio en una de las placas de vidrio, y luego tape el orificio con una malla circular. Ahora, coloque el recinto cargado con moscas en la cámara opaca a la luz.A continuación, conecte los cuatro flujos de aire de control a cada esquina del área. Cierre la puerta de la cámara y deje que las moscas se aclimaten al nuevo entorno durante 10 a 15 minutos. Tras el período de aclimatación, realice un experimento de control de cinco a 10 minutos en el que las moscas se expongan a cuatro flujos de aire de control.Es esencial analizar ahora inmediatamente los datos. Si las moscas no están distribuidas uniformemente en la arena, debe reiniciarse la arena. Es fundamental probar el comportamiento de las moscas control frente al aire limpio.Esto verificará rápidamente que todas las condiciones de fondo sean normales. La filtración de luz, el desequilibrio de temperatura, la arena inclinada o una contaminación por olores pueden causar problemas. Si es necesario, deseche las moscas y limpie la arena nuevamente.Si se sospecha una contaminación por odorante, reemplace todo el tubo. Continúe repitiendo la prueba de control con nuevos grupos hasta que los animales no muestren preferencia por ninguno de los cuatro cuadrantes. Luego, conecte la cámara del odorante de prueba al montaje utilizando una válvula de tres vías, o reconecte el tubo y realice un experimento de prueba durante cinco a 10 minutos.Para grabaciones experimentales más largas, detenga y reinicie rápidamente el programa de seguimiento cada 20 minutos, ya que los archivos de datos serán demasiado grandes. Entre pruebas, deseche las moscas, limpie la arena y las placas de vidrio con etanol al 70 %, y reemplace los tubos conectores. Mantenga el flujo de aire seco para purgar continuamente el sistema.Por eficiencia, es recomendable contar con dos arenas para poder realizar la limpieza durante los experimentos. Si varios experimentos presentan errores el mismo día, tome extremas precauciones para asegurarse de que no quede ningún olor en el sistema proveniente de una ejecución anterior. Normalmente esto no representa un problema con concentraciones bajas de odorante o con CO2, pero para estímulos altamente concentrados, puede ser necesario dejar un intervalo de hasta 24 horas entre experimentos.Para el análisis de los datos, utilice la rutina personalizada proporcionada en Matlab para convertir los datos a un formato de Matlab. Cargue el archivo de datos brutos generado en tiempo real por el software de seguimiento y cree una máscara espacial que siga los contornos de la arena. Aplique la máscara a los datos brutos para eliminar todos los puntos de datos que caen fuera de la arena, ya que representan ruido.Luego, elimine todos los puntos de datos que se mueven a menos de 0,163 centímetros por segundo durante más de tres segundos. Es probable que estos datos sean ruido o moscas inmóviles. Ahora, visualice los puntos de datos restantes graficando todos ellos a lo largo de los periodos de grabación.Los datos también pueden visualizarse como trayectorias individuales. Los límites del olor pueden estimarse rápidamente basándose en los datos conductuales de la mosca. Luego, calcule el índice de atracción y realice las pruebas estadísticas según se describe en el protocolo del texto.Se probaron 25 moscas macho y 25 hembras en el aparato conductual. En respuesta al aire seco, las moscas exploraron toda la arena sin mostrar preferencia por ningún cuadrante. La línea muestra la trayectoria rastreada de una mosca.Cuando se introdujo vinagre de manzana en la corriente de aire del cuadrante superior izquierdo, la mayoría de las moscas fueron atraídas hacia ese cuadrante olfativo. Cuando se introdujo un odorante repelente, propionato de etilo al 10%, en el cuadrante superior izquierdo, dicho cuadrante fue evitado. El índice de atracción de ese cuadrante fue de 0,68.El índice de atracción es el índice más utilizado en la medición de la respuesta olfativa. Un valor por encima o por debajo de cero indica atracción o repulsión. El script compensó las ligeras variaciones en la posición de la arena entre los ensayos.Se eliminaron los puntos de datos que podrían haber sido ruido o moscas inmóviles. Aunque la prueba puede realizarse durante cualquier duración, resulta interesante observar los cambios en los movimientos del grupo en intervalos de 10 segundos para apreciar la habituación al olor y otros fenómenos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar y analizar eficazmente los comportamientos olfativos en un ensayo de cuatro campos.Una vez dominado, cada experimento olfativo puede completarse en aproximadamente una hora, y habitualmente realizamos de cuatro a seis experimentos durante un día.

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Aquí se describe cómo optimizar la imagen de vídeo adquirido por un olfato magnético de sujeción (OMT) aparato. También describe dos protocolos de la muestra experimental para el estudio visual-olfativa de fusión.

Seguimiento visual mediada olor durante el vuelo en Drosophila

Las moscas de la fruta tienen un sistema olfativo complejo, pueden discriminar cientos de odorantes y utilizan su sentido del olfato para dirigir las decisiones de comportamiento. Este video describe el ensayo del olfatómetro de cuatro vías, un método para estudiar las respuestas del comportamiento olfativo en moscas. El clip de protocolo presentado muestra cómo manejar las moscas de prueba y cuáles son los pasos críticos mientras se realiza el ensayo.

Ensayo de olfatómetro de cuatro vías: un método para evaluar las respuestas de olor en Drosophila

Este video describe un método para probar el comportamiento exploratorio olfativo en la mosca de la fruta, llamado el laberinto Y. El clip de protocolo destacado muestra cómo configurar y realizar el ensayo.

Drosophila Ensayo de laberinto en Y: un método para evaluar las respuestas olfativas en moscas

En este artículo de vídeo, se describe un ensayo automatizado para medir el efecto del hambre o la saciedad en el comportamiento de búsqueda de comida dependiente olfativo en la mosca adulta fruta Drosophila melanogaster.

Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en Drosophila

Se presenta una prueba de elección para revelar la influencia de sustancias odoríferas en el comportamiento de Drosophila utilizando un ensayo del laberinto.

Pruebas<em&gt; Drosophila</em&gt; El olfato con un ensayo del laberinto

El Flywalk automatizado sistema de seguimiento se utiliza para la alta resolución de la cuantificación del comportamiento de olor guiada en Drosophila melanogaster.

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uso de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) se asocia con un deterioro del comportamiento social y comunicativo y la aparición de comportamientos repetitivos. Para estudiar la interrelación entre los genes del TEA y los déficits conductuales en el modelo de Drosophila , en este artículo se describen cinco paradigmas conductuales para analizar el espaciamiento social, la agresión, el cortejo, el acicalamiento y el comportamiento de habituación.

Paradigmas para la evaluación conductual en el modelo de Drosophila del trastorno del espectro autista

Procedimientos para la grabación de alta densidad de datos de EEG y la mirada en equipo basado en juego de las tareas cognitivas se describen. El uso de un juego de vídeo para presentar las tareas cognitivas mejora validez ecológica sin sacrificar el control experimental.

La combinación de PC del juego basado en experimentos del comportamiento de alta densidad de seguimiento de mirada EEG e infrarrojo

Aprende a evaluar comportamientos olfativos en Drosophila melanogaster mediante un olfatómetro de cuatro cuadrantes con seguimiento automatizado. Este método versátil permite estudiar respuestas de poblaciones grandes y explorar bases neuronales del procesamiento sensorial.

Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de

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