Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de Drosophila En un olfatómetro de cuatro cuadrantes

El objetivo general de esta configuración es analizar los comportamientos olfativos de las moscas en un olfatómetro de cuatro cuadrantes utilizando un script de software de seguimiento de moscas automatizado proporcionado. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave sobre cómo los sistemas neuronales olfativos detectan el mundo externo y cómo el cerebro decodifica y dirige las decisiones de comportamiento. La principal ventaja de esta técnica es que es versátil y robusta, y permite repetir las pruebas de las respuestas olfativas de la población de moscas en un gran campo experimental.

Para este protocolo, prepare cinco cámaras de odorante que constan de un recipiente exterior de plástico, un recipiente interior de vidrio y un inserto de tapa de PTFE hecho a medida. El inserto es una tapa de contenedor original con la parte central quitada y dos válvulas unidireccionales adjuntas. Use cuatro de las cámaras de odorante para los controles de solvente y una cámara para un odorante de prueba.

Asegúrese de que cada cámara esté limpia y luego cargue un recipiente de odorante con un mililitro de dilución de solvente u odorante. Luego, verifique la posición del recipiente en la cámara de plástico y asegúrese de que no se haya derramado líquido. Asegure la tapa con el tapón de rosca y una junta tórica en el inserto de PTFE para evitar fugas.

Cría las moscas en un medio estándar de harina de maíz. En una botella estándar, coloque 30 machos y 30 hembras, y deje que los huevos se pongan durante cinco días a temperatura ambiente. De tales botellas, recoja moscas recién cerradas.

Para cada cohorte experimental, recoja 25 moscas macho y 25 hembras bajo anestesia breve con dióxido de carbono y deje que la cohorte envejezca en un medio de mosca estándar durante dos a cuatro días. De 40 a 42 horas antes del experimento, transfiera la cohorte a un vial con aproximadamente 10 mililitros de gel de agarosa al uno por ciento para la humedad sin alimentos. La inanición ayuda a aumentar todo el movimiento, y más del 90% de las moscas deberían sobrevivir al proceso de inanición.

Si más del 10% muere, lo que puede suceder en un genotipo débil, intente usar una inanición de un día para todas las moscas en el experimento. Con al menos cinco minutos de anticipación, encienda el controlador de temperatura y ajústelo a 25 grados centígrados. Luego, conecte las cámaras de odorante a la arena a través de un tubo de plástico.

Verifique el caudal de aire en cada cuadrante de la arena utilizando un medidor de flujo electrónico. Asegúrese de que las corrientes de aire de control y odorante funcionen a 100 mililitros por minuto. Las moscas son muy sensibles al flujo de aire, y es fundamental que el flujo de aire de cada cuadrante se verifique antes de cada experimento.

Ahora, limpie la arena y las placas de vidrio con etanol al 70%. Limpie todas las piezas dos o tres veces y deje que se sequen completamente al aire antes de continuar. A continuación, sujete las placas de vidrio a la arena.

Luego, transfiera las moscas a la arena sin anestesia. Usando la gravedad, déjelos entrar a través del orificio en una de las placas de vidrio y luego cubra el orificio con una malla circular. Ahora, coloque la arena cargada de moscas en la cámara hermética a la luz.

Luego, conecte las cuatro corrientes de aire de control a cada esquina de la arena. Cierre la puerta de la cámara y deje que las moscas se aclimaten al nuevo entorno durante 10 a 15 minutos. Después del período de aclimatación, realice un experimento de control de cinco a 10 minutos en el que las moscas se exponen a cuatro corrientes de aire de control.

Ahora es esencial analizar los datos de inmediato. Si las moscas no se distribuyen uniformemente en la arena, la arena debe reiniciarse. Es fundamental probar el comportamiento de las moscas de control para limpiar el aire.

Esto verificará rápidamente que todas las condiciones de fondo sean normales. Las fugas de luz, el desequilibrio de temperatura, la inclinación de la arena o la contaminación por olores pueden causar problemas. Si es necesario, desecha las moscas y vuelve a limpiar la arena.

Si se sospecha de una contaminación por odorante, reemplace todos los tubos. Continúe repitiendo la prueba de control con nuevas cohortes hasta que los animales no muestren preferencia por ninguno de los cuatro cuadrantes. Luego, conecte la cámara de odorante de prueba a la configuración usando una válvula de tres vías, o vuelva a conectar el tubo y ejecute un experimento de prueba durante cinco a 10 minutos.

Para grabaciones experimentales más largas, detenga y reinicie rápidamente el programa de seguimiento cada 20 minutos, o los archivos de datos serán demasiado grandes. Entre las pruebas, deseche las moscas, limpie la arena y las placas de vidrio con etanol al 70% y reemplace los tubos conectores. Mantenga el flujo de aire seco en marcha para lavar continuamente el sistema.

Para mayor eficiencia, es bueno tener dos arenas para que la limpieza se pueda realizar durante las carreras. Si varios experimentos son incorrectos el mismo día, tenga mucho cuidado para asegurarse de que no quede olor en el sistema de una ejecución anterior. Normalmente, esto no es un problema con bajas concentraciones de odorante o con CO2, pero para estímulos altamente concentrados, puede ser necesario un intervalo de hasta 24 horas entre las ejecuciones del experimento.

Para el análisis de datos, utilice la rutina de Matlab personalizada proporcionada para convertir los datos a un formato de Matlab. Cargue el archivo de datos en bruto creado en tiempo real por el software de seguimiento y cree una máscara espacial que siga los contornos de la arena. Aplique la máscara a los datos sin procesar para eliminar todos los puntos de datos que caigan fuera de la arena, ya que representan ruido.

A continuación, elimine todos los puntos de datos que se muevan a menos de 0,163 centímetros por segundo durante más de tres segundos. Es probable que estos datos sean ruido o moscas que no se mueven. Ahora, visualice los puntos de datos restantes trazándolos todos a través de los períodos de registro.

Los datos también se pueden ver como trayectorias individuales. Los límites de olor se pueden estimar rápidamente en función de los datos de comportamiento de la mosca. A continuación, calcule el índice de atracción y realice pruebas estadísticas como se describe en el protocolo de texto.

Se probaron 25 moscas macho y 25 hembras en el aparato conductual. En respuesta al aire seco, las moscas exploraron toda la arena sin preferencia por ningún cuadrante. La línea muestra la trayectoria de una mosca.

Cuando se introdujo vinagre de sidra de manzana en la corriente de aire del cuadrante superior izquierdo, la mayoría de las moscas se sintieron atraídas por ese cuadrante de olor. Cuando se introdujo un odorante repelente, propionato de etilo al 10%, en el cuadrante superior izquierdo, se evitó ese cuadrante. El índice atractivo de ese cuadrante obtuvo una puntuación de 0,68.

Un índice atractivo es el índice más utilizado en la medición de la respuesta olfativa. Un valor por encima o por debajo de cero indica atracción o repulsión. El guión compensaba las ligeras variaciones en la posición de la arena entre pruebas.

Se eliminaron los puntos de datos que podrían haber sido ruido o moscas que no se movían. Si bien la prueba se puede ejecutar durante cualquier duración, es interesante ver los cambios en los movimientos de la cohorte a través de intervalos de 10 segundos para apreciar la habituación de olores y otros fenómenos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ejecutar y analizar de manera efectiva los comportamientos olfativos en un ensayo de cuatro campos.

Una vez dominado, cada experimento olfativo se puede completar en aproximadamente una hora, y rutinariamente realizamos de cuatro a seis experimentos durante un día.