Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de

El objetivo general de este montaje es analizar los comportamientos olfativos de moscas en un olfactómetro de cuatro cuadrantes utilizando un script de software automatizado para el seguimiento de moscas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los sistemas neuronales olfativos detectan el mundo externo y cómo el cerebro descifra y dirige las decisiones conductuales. La principal ventaja de esta técnica es que es versátil y robusta, y permite realizar pruebas repetidas de respuestas olfativas en poblaciones de moscas dentro de un área experimental amplia.

Para este protocolo, prepare cinco cámaras de odoríferos que consten de un recipiente exterior de plástico, un recipiente interior de vidrio y un inserto de tapa de politetrafluoroetileno (PTFE) fabricado a medida. El inserto es una tapa de recipiente original con la parte central eliminada y dos válvulas unidireccionales adjuntas. Utilice cuatro de las cámaras de odoríferos como controles de disolvente y una cámara para un odorífero de prueba.

Asegúrese de que cada cámara esté limpia y luego cargue un recipiente de odorante con un mililitro de disolvente o dilución de odorante. A continuación, verifique la posición del recipiente en la cámara de plástico y asegúrese de que no se haya derramado líquido. Fije la tapa utilizando la rosca y una junta tórica en la inserción de PTFE para evitar fugas.

Criar las moscas en un medio estándar de harina de maíz. En un frasco estándar, colocar 30 machos y 30 hembras, y permitir que pongan huevos durante cinco días a temperatura ambiente. De estos frascos, recolectar moscas recién emergidas.

Para cada cohorte experimental, recolecte 25 moscas macho y 25 hembras bajo una breve anestesia con dióxido de carbono y deje que la cohorte envejezca en medio estándar para moscas durante dos a cuatro días. De 40 a 42 horas antes del experimento, transfiera la cohorte a un vial con aproximadamente 10 mililitros de gel de agarosa al uno por ciento para mantener la humedad sin alimento. La inanición ayuda a aumentar el movimiento general, y más del 90 % de las moscas debería sobrevivir al proceso de ayuno.

Si mueren más del 10%, lo cual puede ocurrir en un genotipo débil, intente utilizar un ayuno de un día para todas las moscas del experimento. Al menos cinco minutos con anticipación, encienda el controlador de temperatura y ajústelo a 25 grados Celsius. Luego, conecte las cámaras de odorante al área experimental mediante un tubo de plástico.

Verifique la tasa de flujo de aire en cada cuadrante del área utilizando un medidor electrónico de flujo. Asegúrese de que las corrientes de aire de control y del odorizante funcionen ambas a 100 mililitros por minuto. Las moscas son muy sensibles al flujo de aire, y es fundamental verificar el flujo de aire de cada cuadrante antes de cada experimento.

Ahora, limpie el área y las placas de vidrio utilizando etanol al 70%. Pase un paño por todas las piezas de dos a tres veces y déjelas secar completamente al aire antes de continuar. A continuación, sujete las placas de vidrio al área con abrazaderas.

Luego, transfiera las moscas al recinto sin anestesia. Mediante la gravedad, permita que entren a través del orificio en una de las placas de vidrio, y luego tape el orificio con una malla circular. Ahora, coloque el recinto cargado con moscas en la cámara opaca a la luz.

A continuación, conecte los cuatro flujos de aire de control a cada esquina del área. Cierre la puerta de la cámara y deje que las moscas se aclimaten al nuevo entorno durante 10 a 15 minutos. Tras el período de aclimatación, realice un experimento de control de cinco a 10 minutos en el que las moscas se expongan a cuatro flujos de aire de control.

Es esencial analizar ahora inmediatamente los datos. Si las moscas no están distribuidas uniformemente en la arena, debe reiniciarse la arena. Es fundamental probar el comportamiento de las moscas control frente al aire limpio.

Esto verificará rápidamente que todas las condiciones de fondo sean normales. La filtración de luz, el desequilibrio de temperatura, la arena inclinada o una contaminación por olores pueden causar problemas. Si es necesario, deseche las moscas y limpie la arena nuevamente.

Si se sospecha una contaminación por odorante, reemplace todo el tubo. Continúe repitiendo la prueba de control con nuevos grupos hasta que los animales no muestren preferencia por ninguno de los cuatro cuadrantes. Luego, conecte la cámara del odorante de prueba al montaje utilizando una válvula de tres vías, o reconecte el tubo y realice un experimento de prueba durante cinco a 10 minutos.

Para grabaciones experimentales más largas, detenga y reinicie rápidamente el programa de seguimiento cada 20 minutos, ya que los archivos de datos serán demasiado grandes. Entre pruebas, deseche las moscas, limpie la arena y las placas de vidrio con etanol al 70 %, y reemplace los tubos conectores. Mantenga el flujo de aire seco para purgar continuamente el sistema.

Por eficiencia, es recomendable contar con dos arenas para poder realizar la limpieza durante los experimentos. Si varios experimentos presentan errores el mismo día, tome extremas precauciones para asegurarse de que no quede ningún olor en el sistema proveniente de una ejecución anterior. Normalmente esto no representa un problema con concentraciones bajas de odorante o con CO2, pero para estímulos altamente concentrados, puede ser necesario dejar un intervalo de hasta 24 horas entre experimentos.

Para el análisis de los datos, utilice la rutina personalizada proporcionada en Matlab para convertir los datos a un formato de Matlab. Cargue el archivo de datos brutos generado en tiempo real por el software de seguimiento y cree una máscara espacial que siga los contornos de la arena. Aplique la máscara a los datos brutos para eliminar todos los puntos de datos que caen fuera de la arena, ya que representan ruido.

Luego, elimine todos los puntos de datos que se mueven a menos de 0,163 centímetros por segundo durante más de tres segundos. Es probable que estos datos sean ruido o moscas inmóviles. Ahora, visualice los puntos de datos restantes graficando todos ellos a lo largo de los periodos de grabación.

Los datos también pueden visualizarse como trayectorias individuales. Los límites del olor pueden estimarse rápidamente basándose en los datos conductuales de la mosca. Luego, calcule el índice de atracción y realice las pruebas estadísticas según se describe en el protocolo del texto.

Se probaron 25 moscas macho y 25 hembras en el aparato conductual. En respuesta al aire seco, las moscas exploraron toda la arena sin mostrar preferencia por ningún cuadrante. La línea muestra la trayectoria rastreada de una mosca.

Cuando se introdujo vinagre de manzana en la corriente de aire del cuadrante superior izquierdo, la mayoría de las moscas fueron atraídas hacia ese cuadrante olfativo. Cuando se introdujo un odorante repelente, propionato de etilo al 10%, en el cuadrante superior izquierdo, dicho cuadrante fue evitado. El índice de atracción de ese cuadrante fue de 0,68.

El índice de atracción es el índice más utilizado en la medición de la respuesta olfativa. Un valor por encima o por debajo de cero indica atracción o repulsión. El script compensó las ligeras variaciones en la posición de la arena entre los ensayos.

Se eliminaron los puntos de datos que podrían haber sido ruido o moscas inmóviles. Aunque la prueba puede realizarse durante cualquier duración, resulta interesante observar los cambios en los movimientos del grupo en intervalos de 10 segundos para apreciar la habituación al olor y otros fenómenos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar y analizar eficazmente los comportamientos olfativos en un ensayo de cuatro campos.

Una vez dominado, cada experimento olfativo puede completarse en aproximadamente una hora, y habitualmente realizamos de cuatro a seis experimentos durante un día.