Name: La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a observar eventos individuales de fusión de membrana mediados por proteínas SNARE usando microscopía TIRF polarizada. Este método permite detectar la liberación de lípidos y carga soluble con alta resolución temporal.

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Agradecemos a Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) por el diseño y construcción del microscopio polarizado TIRF, a David Baddeley (Universidad de Yale) por su ayuda con la instrumentación de detección de dos colores, y a James E. Rothman (Universidad de Yale) y Ben O'Shaughnessy (Universidad de Columbia) y a los miembros de sus grupos por estimular las discusiones. EK cuenta con el apoyo de un premio Kavli Neuroscience Scholar Award de la Fundación Kavli y la subvención 1R01GM108954 de los NIH.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La implementación exitosa del ensayo de fusión SUV-SBL descrito aquí depende críticamente de varios pasos clave, tales como la reconstitución funcional de las proteínas en liposomas, obteniendo SBLS de buena calidad, y la elección de los parámetros de imagen adecuados para detectar moléculas individuales. Aunque puede tomar algún tiempo y esfuerzo para tener éxito, una vez que el ensayo se lleva a cabo con éxito, proporciona una gran cantidad de información sobre el proceso de fusión no disponible en cualquier otro ensa...

La fusión de membranas es un proceso biológico universal, necesaria para el tráfico intracelular de lípidos y proteínas, la secreción, la fertilización, el desarrollo y la envolvió entrada del virus en organismos huésped 1-3. Para la mayoría de las reacciones de fusión intracelular, incluida la liberación de las hormonas y los neurotransmisores a través de la exocitosis, la energía para fusionar dos bicapas lipídicas se proporciona por formación de un haz de cuatro hélices entre las proteínas N-etilmaleimida sensible receptor de la proteína factor de unión soluble cognado (SNARE), anclada en la vesícula (v-SNARE) y la membrana diana (t-SNARE) 4, respectivamente. Sináptica exocitosis de vesículas es la reacción de fusión más estrechamente regulado y se produce dentro de una milésima de segundo después de la llegada de un potencial de acción 1,4,5. El poro de fusión, la conexión inicial entre los dos compartimientos de fusión, puede parpadear abierto y cerrado varias veces antes de volver a sellar o expansión irreversible 5-7. Los resultados anterioresen transitoria, &quot;Kiss &amp; run&quot; de fusión, mientras que la segunda conduce a la fusión completa. Los factores que regulan el equilibrio entre estos dos modos de fusión y mecanismos que regulan el parpadeo de los poros no son bien entendidos 5,8. Se requieren proteínas SNARE de exocitosis; la fusión de vesículas sinápticas se suprimirán a partir de la escisión de trampas por neurotoxinas 9. Los experimentos de fusión a granel mediante pequeñas vesículas unilaminares (SUV) mostraron que SNAREs no sólo son necesarios, sino también suficiente para impulsar la fusión de membranas 10. En este ensayo mayor, SUVs reconstituyeron con v-SNARE (v-SUV) fueron dopados con fosfolípidos fluorescentes (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) y ( N -. (lisamina rodamina B sulfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) y se mezcló con vesículas que contienen no marcados t-SNARE (t-SUV) Inicialmente la fluorescencia de NBD-PE en v-SUV se extinguió mediante la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET ) a LR-PE. Como laboratorioELED v-SUVs se fusionan con no marcados camisetas SUVs, la densidad superficial fluoróforo en la membrana ahora combinada se reduce y el incremento resultante en la fluorescencia NBD-PE informa de la extensión de los lípidos de mezcla 10. A medida que el ensayo mayor es fácil de configurar y analizar, se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de fusión SNARE mediada 10-14. Sin embargo, tiene varias limitaciones, tales como una baja sensibilidad y una pobre resolución de tiempo. Lo más importante, como una medición de conjunto, el promedio es los resultados de todos los acontecimientos que hacen discriminación entre acoplamiento y de fusión, así como la detección de intermedios hemifusion difíciles. La última década varios grupos, incluido el nuestro, se han desarrollado nuevos ensayos para monitorizar los eventos de fusión a nivel de la vesícula única 15-27. Ha y sus colegas utilizaron en V SUV atados sobre una superficie y un seguimiento de su fusión con T-SUV gratuitas 18,19. la mezcla de lípidos se controló utilizando FRET entre un par de fluoróforos unidos a lípidos emcamas en el V y T-SUV, respectivamente, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) 18. Más tarde, el laboratorio de Brunger utiliza una sola especie de lípidos de la etiqueta junto con un marcador de contenidos para la detección simultánea de lípidos y mezclando 20,28. Tanto el lipídica y los marcadores de contenidos se incluyeron en altas concentraciones, auto-enfriamiento rápido; fusión con SUVs no marcados como resultado de la fluorescencia desatenuación 20,28. Otros han fusionado en V SUV de bicapas planas reconstituidos con t-SNARE 15-17,21-27,29. La geometría planar del objetivo (t-SNARE que contiene) bicapa imita mejor el proceso de fusión fisiológica de vesículas pequeñas, muy curvadas con una membrana de plasma plana. El grupo Steinem emplea membranas de poros que abarca reconstituidos con t-SNARE, suspendidos sobre un sustrato de nitruro de silicio poroso y detecta la fusión con la V-SUV individuales mediante microscopia láser confocal de barrido 23. otros fusadas en V SUV a bicapas planas reconstituidos con t-SNARE, soportados sobre un sustrato de vidrio 15-17,21,22,24-27,29. La gran ventaja de utilizar bicapas soportadas (SBLS) es que la microscopía TIRF se puede utilizar para detectar eventos de conexión y de fusión con una excelente relación señal-ruido y sin interferencia de envío V-SUV, aunque el uso de microfluidos también proporciona una resolución de un solo evento usando -campo lejano estándar microscopía de epifluorescencia 24. Una preocupación importante es si y cómo las interacciones sustrato bicapa afectar a la calidad apoyados bicapa y el proceso de fusión. Los primeros trabajos hizo uso de SBLS planas que fueron apoyados directamente sobre un sustrato de vidrio o cuarzo 15-17. Estos SBLS se hicieron por adsorción, el estallar, la difusión y la fusión de las membranas t-SUV en el sustrato. Pronto se advirtió, sin embargo, que la omisión de un componente clave t-SNARE, SNAP25, desde SBLS preparados de esta manera resultó en v-SUV de atraque y fusión de cinética indistinguisHable de los obtenidos utilizando la completa t-SNARE 17. Debido SNAP25 es absolutamente necesaria para la fusión in vivo 30,31, la relevancia fisiológica de estos primeros intentos se puso en tela de juicio. El grupo de Tamm superó este desafío mediante la formación de bicapa controla mejor el apoyo 21. Se utiliza la deposición de Langmuir-Blodgett por primera valva libre de proteínas de la SBL, seguido de la fusión de esa monocapa con t-SUVs 21. Esto dio lugar a la fusión SNAP25-dependiente. Para evitar artefactos potenciales asociados con una bicapa soportada directamente sobre un sustrato de vidrio sin necesidad de utilizar métodos de Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. Introdujo un poli hidratado (etilenglicol) (PEG) amortiguador suave, entre la bicapa y el sustrato 24. Esta modificación también resultó en la fusión SNAP25 dependiente 24. Bicapas acolchados en una capa de polímero blando habían sido conocidos para conservar mejor transmembranala movilidad y función de proteínas de 32 años, y habían sido utilizados en estudios de fusión con virus 33. Además, bicapas PEGilados parecen conservar cierta capacidad de auto-sanar y son muy robustos 34,35. En primer lugar, una fracción de cadenas de PEG, de lípidos ligado disponibles comercialmente están incluidos en la membrana de t-SUV. Cuando estas camisetas SUVs se rompen y forman una bicapa planar sobre un sustrato de vidrio, un cepillo de PEG cubre ambas valvas de la bicapa planar. Debido a la formación de bicapa planar es impulsado por la adhesión de las cadenas de PEG que rodean camisetas SUVs sobre la superficie de cristal hidrófilo, estallido liposoma y formación de bicapa planar son relativamente insensibles a la composición lipídica utilizada. Sin embargo, cuando se incluyen grandes cantidades de colesterol, aumentando las propiedades de cohesión de los SUV, las SUVs no pueden estallar de forma espontánea. Si este es el caso, los iones de choque o divalentes osmóticos pueden ser empleados para ayudar a la formación de bicapa planar 25. Como se mencionó anteriormente, en este apabordaje un cepillo de PEG cubre ambos lados de la planar, bicapa compatible. El cepillo de cara al canal de flujo de microfluidos ayuda a evitar la adhesión no específica de entrantes v-SUVs que también suelen estar cubiertas de una capa de PEG. La formación de complejos v-t-SNARE y comienza a partir de la membrana distal-N-terminales y procede por etapas hacia los dominios de la membrana proximal-36. Para el V-SUV para interactuar con el t-SBL, horizontal y vertical necesidad t-SNARE N-terminales para sobresalir por encima de los cepillos de PEG, que parece ser el caso en las condiciones del ensayo. Altura del cepillo puede adaptarse para estudiar las proteínas distintas de SNAREs variando la densidad de los lípidos PEGilados y la longitud de la cadena PEG 37,38. Otro de los beneficios de los cepillos de PEG que cubren las superficies proximales de las bicapas de fusión es que se mimetizan con el entorno lleno de las membranas biológicas que están llenas de 30.000-40.000 proteínas integrales de membrana por cuadrado micras 39. Al igual que las cadenas de PEG en este ensayo, la repucapa de proteína lsive que cubre las membranas biológicas necesita ser empujado a un lado para permitir el contacto entre las dos bicapas de fosfolípidos para la fusión que se produzca. canales de flujo de microfluidos se utilizan en este ensayo, ya que ofrecen ventajas únicas. En primer lugar, el flujo de microfluidos permite una mayor deposición uniforme de t-SUV a extenderse y se fusionan para formar el t-SBL. En segundo lugar, el volumen del canal pequeña (&lt;1 l), se reduce el consumo de muestra. En tercer lugar, los pequeños volúmenes requeridos permiten todo el experimento que se llevó a cabo bajo un flujo constante. Flujo elimina débilmente, presumiblemente de forma no específica, se adhirieron en V SUVs de la SBL 16. También mantiene una densidad constante de v-SUV por encima de la t-SBL, lo que simplifica el análisis cinético 17. Por último, vesículas se acopló se distinguen fácilmente de los libres llevadas por el flujo 25. En cuarto lugar, varios canales de microfluidos pueden ser utilizados en el mismo cubreobjetos, cada sondeo de una condición diferente. Esto permite la comparación de las condiciones Duriendo la misma corrida experimental. Un enfoque similar ha sido utilizado por el grupo van Oijen para estudiar la fusión entre el virus de la gripe y SBLS acolchados 33. En la microscopía TIRF, el decaimiento exponencial del campo evanescente (con una constante de ~ 100 nm) descomposición confines de fluorescencia de excitación a aquellas moléculas que se encuentran en una proximidad muy cercana de la interfaz de la memoria intermedia de cristal. Esto minimiza la contribución de moléculas fluorescentes que están más lejos, aumenta la relación señal-ruido, y permite que la sensibilidad de una sola molécula con tiempos de exposición marco de 10 a 40 mseg. El campo evanescente también conduce a un aumento de la señal en fusión: como la transferencia de lípidos marcados desde el SUV en el SBL, se encuentran, en promedio, en un campo de excitación más fuerte. Este aumento de la fluorescencia es más fuerte para los liposomas más grandes. Si la luz polarizada se usa para generar el campo evanescente, efectos adicionales contribuyen a los cambios en la fluorescencia tras la tRANSFERENCIA de las etiquetas de los SUV en el SBL. Algunos tintes de lípidos tienen un dipolo de transición orientada con un ángulo medio preferido con respecto a la bicapa en el que están inmersos. Esto crea una diferencia en la cantidad de fluorescencia emitida por los fluoróforos cuando están en la SUV frente a la SBL, ya que el haz polarizado excitará colorantes en las dos membranas de manera diferente. En el primer caso, el haz de excitación va a interactuar con dipolos de transición orientadas alrededor de la camioneta esférica, mientras que para este último, las orientaciones del dipolo se limitarán por la geometría plana SBL. Por ejemplo, cuando se utiliza luz polarizada s incidente (polarizado normal al plano de incidencia), la excitación es más eficiente cuando el colorante se encuentra en el SBL que en el SUV para un orientado paralelo colorante lípidos transición de dipolo a la membrana 29,40 (como la de Dil o DiD 41-43). Un SUV dopado con un fluoróforo tal está atenuada cuando se acopla sobre el SBL (Figura 7, representat<html> ive Resultados). Como un poro de fusión se abre y conecta las membranas SUV y SBL, sondas fluorescentes se difunden en la SBL y se vuelven más probabilidades de ser excitada por el campo evanescente polarizada s 25,27,29. En consecuencia, la señal de fluorescencia integrado alrededor del sitio de fusión aumenta bruscamente durante la transferencia de colorantes de la SUV en el SBL 27 (Figura 3 y Figura 7). Un factor adicional que contribuye a indicar los cambios que acompañan a la fusión se desatenuación de marcadores fluorescentes a medida que se diluyen cuando se transfiere en el SBL. La contribución de desatenuación suele ser menor en comparación con deterioro del campo de polarización y efectos evanescentes en el ensayo descrito aquí, ya que sólo una pequeña fracción ( <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) De los lípidos están etiquetados. El aumento de la señal en fusión puede ser explotado para deducir las propiedades de poro de fusión mediante la comparación del tiempo,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, requerido para un lípido escape a través de un poro que es completamente permeable a los lípidos al tiempo real de la liberación, <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Si las dos escalas de tiempo son comparables, sería concluir que el poro presenta poca resistencia al flujo de los lípidos. Sin embargo, si el tiempo de liberación real es significativamente más largo que el tiempo para la liberación de difusión limitada, esto indicaría un proceso, tales como el parpadeo de los poros, que retarda la liberación de los lípidos. El tiempo de liberación de difusión limitada, <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Depende del tamaño del liposoma de fusión y lípidos difusividad; su estimación requiere que estos dos parámetros que se deben cuantificar. La sensibilidad única molécula del ensayo permite la difusividad de lípidos que se mide mediante el seguimiento de varios fluoróforos única de lípidos después de su liberación en el SBL para cada evento de fusión 26. El tamaño de cada vesícula fusionandopuede estimarse a 27 mediante la combinación de (i) la intensidad de un solo colorante de los lípidos, (ii) el cambio en la fluorescencia total alrededor de un sitio de acoplamiento después de que todos los fluoróforos se transfieren a la SBL en fusión, (iii) el conocido densidad etiquetado de SUV lípidos, y (iv) la superficie por los lípidos. Para muchos eventos de fusión, se encontró que los tiempos reales de liberación de lípidos a ser mucho más lento de lo esperado por la liberación controlada por difusión 27, como se ha señalado anteriormente suponiendo tamaño SUV uniforme 44. Suponiendo retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo, un modelo cuantitativo permite la estimación de la &quot;apertura de poros&quot;, la fracción de tiempo que el poro se mantiene abierto durante la fusión 27. Siempre que sea posible, es importante para poner a prueba los mecanismos de fusión utilizando tanto los lípidos y las etiquetas de contenidos solubles. Por ejemplo, la liberación de lípidos podría retardarse por procedimientos distintos de parpadeo de poros, tales como la restricción de la difusión de lípidos por las proteínas SNARE que surround camisetasél poro. Si este fuera el caso, entonces la liberación del contenido precedería retira de las etiquetas de lípidos, siempre y cuando el poro es lo suficientemente grande como para permitir el paso de sondas solubles. Un defecto más fundamental en el enfoque podría ser en el supuesto de que la transferencia de lípidos marcados a la SBL se produce a través de un poro de fusión estrecho que conecta el SBL a una vesícula que se ha conservado en gran medida su forma pre-fusión. Transferencia de lípidos en el SBL también podría ser el resultado de una rápida dilatación del poro de fusión con una concomitante, extremadamente rápido colapso de la camioneta en la membrana SBL, como sugerido anteriormente sobre la base de datos de liberación de lípidos solo 29. Seguimiento tanto de lípidos y contenido liberar de forma simultánea, se encontró que muchos poros volvieron a sellar después de soltar todas sus etiquetas de lípidos, pero conserva algunos de su carga soluble 27. Esto indica que al menos algunos liposomas no se colapsan en el SBL después de la fusión, y que la transferencia de colorante de los lípidos en el SBL se produce a través de un poro de fusión. Además, lIPID y contenidos de liberación se produjo de forma simultánea 27, por lo que es poco probable que el retraso de la liberación de lípidos era debido al impedimento de la difusión de lípidos por las proteínas SNARE que rodean el poro 45. Un protocolo de fusión SUV-SBL que no Liberar la monitorización de contenidos solubles se publicó anteriormente por Karatekin y Rothman 25. Aquí, los desarrollos más recientes se incluyen, seguimiento a saber simultánea de lípidos y liberan los contenidos y la estimación de las propiedades de SUV, lípidos, y poro de fusión 27. El protocolo comienza con instrucciones para la preparación de las células de microfluidos, hechos por la unión de un poli (dimetil siloxano) ranuras (PDMS) de elastómero de bloques que contienen con un cubreobjetos de vidrio 25. A continuación, se explica la preparación de V-SUVs tanto con lípidos y marcadores de contenido. Las secciones 4 y 5 proporcionan instrucciones para el montaje de las células de microfluidos, formando los SBLS in situ y la comprobación de defectos y la fluidez, la introducción de los Servicios VeterinariosUVS en las células de flujo y la detección de eventos de fusión. Sección 6 proporciona instrucciones para el análisis de datos.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ)</td><td>agua Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 190 Proof</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Sodio (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hidroxietil] piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>Tampón HEPES-KOH (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp; mM KCl, 100&nbsp; &mu; M EGTA, 1&nbsp; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4"><solventes>fuertes</cloroformo fuerte></td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>en frasco de vidrio, PRECAUCIÓN, use EPI</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>en frasco de vidrio, PRECAUCIÓN, use PPE</td></tr><tr><td colspan="4">Preparación de liposomas</fuerte></td></tr><tr><td>Hermético al gas Jeringa Hamilton</td><td></td><td>Hamilton var. tamaños</td><td>solo use aringa de vidrio con solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Tubos de vidrio Pyrex Vista 11 ml, tapón de rosca de 16x100 mm tubo de cultivo</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>limpiar a fondo, enjuagar con cloroformo</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Los lípidos polares Avanti</td><td>850457</td><td>Los lípidos vienen disueltos en CHCl3 o como polvo liofilizado en viales sellados. Alícuota en la apertura. Almacene el excedente en forma de películas lipídicas secas en atmósfera inerte a -20 °C. Mantenga las existencias en CHCl3/MeOH (2:1, v/v) a -20 °C. deje llegar a RT antes</td></tr><tr><td>de abrir 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sodio), 18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>igual que el anterior.</td></tr><tr><td>1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850804</td><td>igual que el anterior.</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cerebro, cerdo) (sal de amonio), PI (4,5)P2</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>840046</td><td>igual que los anteriores.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>810145</td><td>igual que el anterior.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>Igual que el anterior.</td></tr><tr><td>colesterol (lana ovina, >98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Igual que el anterior.</td></tr><tr><td>Aceite DiD'; Aceite DiIC18(5) (1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina Perclorato)</td><td>Sondas moleculares</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>baño de calor por encima de Tm de lípidos usados</td></tr><tr><td>OG n-Octyl-&beta;-D-Glucopiranoside</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>tienda a -20 &deg; C, vamos a RT antes de abrir</td></tr><tr><td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze Casetes de diálisis, 20k MWCO, 3&nbsp; ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbentes</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp; Medio de gradiente de densidad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrifugación, pared delgada, ultratransparente, 13.2&nbsp; ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti</td><td></td><td></td><td></td></tr> rotor <tr><td>SuflorhodaminaB</td><td>Sondas moleculares</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Columna&nbsp; Columnas de cromatografía, 2,5 y veces; 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Tinción de Gel de Proteína</td> de <td>Naranja Sondas Moleculares</td><td>S-6650</td><td>5,000x Concentrado en DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio Pyrex, 150 x 20 mm, completa con tapa</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Perforadora - Punzón de biopsia reutilizable, 0,75&nbsp; mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Punzonadora de orificios manual&nbsp;</td><td>Taladro SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>.035 x .026 x 1.5 304 SS Punzón redondo recubierto de TiN</td> Diámetro de la broca <td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>: 0,9 mm, tamaño del orificio del punzón: 0,74 mm</td></tr><tr><td>Tubo Tygon Microbore de 0,25 mm de diámetro interior, 0,76 mm de diámetro exterior</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0,010" de diámetro interior, 0,030" de diámetro exterior</td></tr><tr><td>Tubo de silicona (0,51 mm de diámetro interior, 2,1 mm de diámetro exterior</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0,020" de diámetro interior, 0,083" de diámetro exterior</td></tr><tr><td colspan="4">Cubreobjetos - limpieza de sala limpia</fuerte></td></tr><tr><td>Schott Nexterion cubreobjetos de vidrio D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>limpiador de plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF configuración y accesorios</td></tr><tr><td>IX81 cuerpo de microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM Cámara CCD</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate, etapa de microscopio calefactada</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>1 ml jeringas de vidrio hamilton (4x)</td><td>bomba</td> de jeringa Hamilton <td>81365</td><td></td></tr><tr><td></td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

la fusión mediada por snare de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía tirf polarizada

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

En el proceso omnipresente de fusión de la membrana de la apertura de un poro de fusión establece la primera conexión entre dos compartimentos separados anteriormente. Durante neurotransmisor o la liberación de hormonas a través de la exocitosis, el poro de fusión puede abrir y cerrar transitoriamente en varias ocasiones, la regulación de la cinética de liberación de carga. la dinámica de los poros también determinan el modo de reciclaje de vesículas; resellado resultados irreversibles en la fusión transitoria, &quot;kiss-and-run&quot;, mientras que la dilatación conduce a la fusión completa. Para entender mejor los factores que gobiernan la dinámica de los poros, hemos desarrollado un ensayo para monitorizar la fusión de membranas mediante microscopía de fluorescencia polarizada de reflexión interna total (TIRF) con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución en un bioquímicamente bien definidas sistema in vitro. La fusión etiquetada de manera fluorescente pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas v-SNARE (V-SUV) con una doble capa de apoyo plana t-SNARE, apoyado en un cojín de polímero blando (t-SBL, bicapa t-apoyado), Se controla. El ensayo utiliza canales de flujo de microfluidos que garantizan un mínimo consumo de muestra, mientras que el suministro de una densidad constante de los SUV. La explotación de la mejora rápida de la señal después de la transferencia de las etiquetas de lípidos de la SUV de la LPS durante la fusión, la cinética de la transferencia de colorantes de lípidos se controla. La sensibilidad de la microscopía TIRF permite el seguimiento de las etiquetas de lípidos fluorescentes individuales, de los cuales difusividad de lípidos y tamaño SUV se puede deducir por cada evento de fusión. Los tiempos de liberación de colorante de lípidos pueden ser mucho más de lo esperado para el paso sin obstáculos a través de los poros abiertos de forma permanente. El uso de un modelo que asume el retraso de la liberación de lípidos se debe a poros parpadeo, un poro &quot;apertura&quot;, la fracción de tiempo que el poro se mantiene abierto durante la fusión, puede ser estimado. Un marcador soluble puede ser encapsulada en los terrenos para el seguimiento simultáneo de los lípidos y la liberación de la carga soluble. Estas mediciones indican algunos poros pueden volver a cerrar después de perder una fracción de la carga soluble.

Calidad SBL Es crucial para verificar la calidad y fluidez de la SBL antes del experimento de fusión. La fluorescencia en el lado inferior, de vidrio de un canal microfluídico debe ser uniforme, sin defectos evidentes. Si una burbuja de aire pasa a través del canal, se suele dejar cicatrices visibles en el SBL. Si hay tan grandes cicatrices escala / defectos, no use ese canal. A veces los SUV puede adherirse a...

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

El objetivo general de este ensayo es observar eventos individuales de fusión de membranas impulsados por proteínas SNARE neuronales y exocitóticas para comprender los mecanismos fundamentales de la liberación de neurotransmisores y hormonas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fusión de membranas, como cómo ocurre la liberación de carga a través de un poro de fusión dinámico y el destino del poro después de la fusión. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden observar, para eventos individuales y en entornos bioquímicamente definidos, las distintas etapas del anclaje de vesículas, la fusión para la apertura y la cinética de liberación de la carga.Aunque este método puede proporcionar información sobre la exocitosis, también puede aplicarse a otras reacciones de fusión de membranas, como la fusión de virus con envoltura con membranas celulares diana durante la infección. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque deben dominar muchas etapas diferentes, desde la microfabricación hasta la purificación de proteínas y el análisis de imágenes. Para comenzar, prepare un molde matriz de silicona utilizando técnicas estándar de fotolitografía y la plantilla mostrada aquí.A continuación, agregue 100 mililitros de la base de PDMS y 10 mililitros del agente de curado en un vaso plástico desechable, y mezcle bien la mezcla. Luego, coloque el vaso en un desecador al vacío. Aplique vacío, pero obsérvelo cuidadosamente para evitar que la mezcla rebose.Una vez desgasificado, vierta una gota grande de la mezcla de PDMS desgasificada en una placa de Petri de vidrio e presione el molde sobre el PDMS con el lado de la plantilla hacia arriba para evitar atrapar burbujas debajo del oblea. A continuación, vierta PDMS desgasificado sobre la plantilla hasta que quede cubierta por cinco a ocho milímetros del polímero. Si aparece una burbuja de aire, retírela suavemente con la punta de una pipeta.Coloque la plantilla recubierta con PDMS sobre la superficie nivelada de un horno y hornee durante tres horas a 60 grados Celsius. Luego, utilice una hoja nueva de bisturí para recortar un bloque de PDMS que contenga las estructuras del canal moldeado. Tenga en cuenta que el bloque recortado debe caber sobre un cubreobjetos.A continuación, coloque el lado de las ranuras del canal hacia arriba y utilice un perforador para taladrar a través del bloque en un movimiento continuo. Asegúrese de retirar el trozo perforado de cada una de las ocho ubicaciones de los orificios. Una vez finalizado, pegue las ranuras del bloque hacia abajo sobre un trozo limpio de papel de aluminio.Ahora, corte el tubo de modo que tenga una ligera inclinación en un extremo, y utilice un par de pinzas para introducir el tubo aproximadamente un tercio del camino dentro de los orificios perforados. Corte los tubos de manera que puedan alcanzar el depósito de tampón y la bomba de jeringas. Para conectar el tubo a las jeringas de la bomba de jeringas, corte un trozo corto de un tubo de silicona más grande, e inserte el tubo más delgado en uno de sus extremos.Este bloque de PDMS listo para usar se puede conservar durante unos pocos meses. Primero, coloque el bloque de PDMS bajo vacío elevado durante al menos 20 minutos para eliminar los gases disueltos y reducir el riesgo de burbujas de aire en los canales microfluídicos durante el experimento de fusión. A continuación, asegúrese de que la zona del portaobjetos del microscopio esté ajustada a la temperatura deseada.Mientras la temperatura se equilibra, prepare vesículas unilaminares pequeñas marcadas fluorescentemente con NBD-PE que contengan proteínas t-SNARE, o controles libres de proteínas, diluyendo 30 microlitros de las vesículas con 60 microlitros de tampón. Luego, aspire la solución en una jeringa de tres mililitros. Exprese la mayor parte del aire sobre la muestra mientras sostiene la jeringa en posición vertical.Luego, selle la punta utilizando una película de parafina y cree un vacío tirando del émbolo. Mientras se aplica el vacío, golpee suavemente el cuerpo de la jeringa para acelerar la desgasificación de la solución. Repita este proceso varias veces hasta que no aparezcan más burbujas de aire al aplicar el vacío.A continuación, utilice una aguja hipodérmica con un diámetro ligeramente mayor que el del tubo microfluídico para perforar un orificio en la tapa de un tubo de microcentrifugado. Llene el tubo de microcentrifugado con vesículas unilaminares pequeñas desgasificadas, colóquelo en el soporte sobre la platina del microscopio y deje que la solución se equilibre a la temperatura establecida. Coloque un cubreobjetos limpio en un limpiador de plasma y aplique plasma de aire sobre el cubreobjetos durante aproximadamente cinco minutos.A continuación, retire el cubreobjetos y colóquelo, con el lado tratado hacia arriba, sobre unos pocos tejidos libres de pelusa que sirvan como cojín. Luego, coloque el bloque de PDMS, con el lado grabado mirando hacia abajo, encima del cubreobjetos. Utilice un par de pinzas para presionar suavemente el bloque, pero sin ejercer tanta presión como para romper el vidrio.Coloque la celda de flujo ensamblada sobre la platina del microscopio. A continuación, conecte los tubos a los reservorios de vesículas unilaminares pequeñas y a la bomba de jeringa. Comience a aspirar las vesículas unilaminares pequeñas a tres microlitros por minuto hasta que la solución llene completamente los canales.Cuando las soluciones en todos los canales comiencen a moverse hacia arriba por el tubo en el lado de salida, reduzca el flujo a 0,5 microlitros por minuto e incube durante 30 a 45 minutos. El tiempo entre el tratamiento con plasma del cubreobjetos de vidrio y el paso de las SUV al canal no debe exceder los 10 minutos, ya que el efecto del tratamiento con plasma es transitorio. Revise los canales en busca de fugas utilizando imágenes de fluorescencia con un objetivo de baja magnificación y, luego, enjuague todos los canales con tampón desgasificado para eliminar las vesículas no unidas.A continuación, cambie al objetivo de inmersión en aceite de alto aumento para microscopía TIRF y asegure la celda de flujo fijándola con cinta adhesiva sobre la platina del microscopio. Cierre el diafragma de campo hasta un diámetro de aproximadamente 40 micrómetros y ajuste la intensidad de la luz de excitación de 488 nanómetros mediante el software, con el fin de bleanquear significativamente, pero no completamente, la fluorescencia en el área expuesta. La intensidad de fluorescencia en el centro del área expuesta debe ser menor que en los bordes, ya que las moléculas intactas de NBD-PE entran y difunden una cierta distancia antes de ser bleanqueadas.Sin embargo, si las SUV adhesivas a la superficie no estallan, todos los fluoróforos en el área expuesta deben desvanecerse. Para verificar los resultados de las mediciones del estado del estudio, detenga la iluminación y reiníciela unos minutos después para observar si la fluorescencia se ha recuperado. Desgasifique el tampón de reconstitución y úselo para diluir la solución stock de vesículas unilamelares pequeñas reconstituidas con v-SNARE, de modo que la solución resultante produzca de 10 a 100 eventos de fusión en el campo de visión durante un período de 60 segundos.Demasiados eventos de fusión aumentan la fluorescencia de fondo y dificultan la detección y el análisis de los eventos. En contraste, una tasa de fusión demasiado baja puede dar lugar a estadísticas deficientes. Fluya las vesículas unilamelares pequeñas reconstituidas con v-SNARE hacia el canal a una velocidad de flujo de dos microlitros por minuto, y cambie a la configuración de excitación y emisión adecuada para monitorear la mezcla de lípidos.A continuación, ajuste el ángulo y la polarización de la microscopía de fluorescencia por reflexión total interna (TIRF) según se describe en el protocolo de texto adjunto. Excite continuamente y supervise la fluorescencia de las vesículas utilizando un láser de 561 nanómetros. A medida que las vesículas llegan al canal de flujo y se anclan y fusionan con la bicapa soportada, la señal de fluorescencia de fondo comienza a acumularse.Ajuste la intensidad del láser de excitación mediante el software para blanquear continuamente la fluorescencia de fondo, de modo que puedan observarse fácilmente nuevos eventos de acoplamiento y fusión. Adquiera varias películas en diferentes posiciones dentro de un canal determinado. Verifique la fluorescencia de NBD-PE para confirmar que la bicapa soportada no presenta defectos en estas posiciones.La recuperación de la fluorescencia tras el blanqueo fotónico se muestra aquí para una bicapa soportada reconstituida con t-SNARE que era relativamente libre de defectos y fluida. El área se imagina con baja exposición a la luz para seguir la recuperación de la fluorescencia mediante la difusión de lípidos marcados con NBD. Es más fácil observar los eventos de anclaje y fusión mientras se monitorea la fluorescencia procedente únicamente de los marcadores lipídicos.En la secuencia de imágenes mostrada aquí, se registró un cuadro cada 18 milisegundos. Tras la fusión, las etiquetas lipídicas se transfieren a la bicapa soportada y difunden alejándose del sitio de fusión. En algunos casos, es deseable monitorear simultáneamente la mezcla de lípidos y la liberación de carga soluble.Se muestra aquí un evento representativo que describe la mezcla de lípidos y la liberación de carga soluble simultáneas. En las altas concentraciones utilizadas para la encapsulación, la fluorescencia del contenido soluble representada en rojo se encuentra inicialmente autoinhibida. Un aumento brusco en la fluorescencia de los lípidos, representada en azul, indica la mezcla de lípidos debido a un evento de fusión, como en la monitorización de un solo color de las etiquetas lipídicas mostrada anteriormente.La apertura de los poros libera el colorante del contenido soluble y alivia el apagado inicial del colorante en la luz de la vesícula. Esto provoca un aumento de la señal de la carga soluble, representada en rojo. Curiosamente, la fluorescencia de la carga alcanzó una meseta estable.Esto indica que el poro se volvió a sellar después de liberar todas las etiquetas lipídicas y una fracción de la carga soluble. Al final, la señal del contenido soluble, representada en rojo, disminuye muy rápidamente. Esto probablemente se deba a una fusión completa rápida o a la ruptura del liposoma.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una celda de flujo microfluídica a partir de una bicapa soportada reconstituida con proteínas t-SNARE, y cómo monitorear y analizar eventos individuales de fusión de vesículas utilizando microscopía de fluorescencia por reflexión interna total (TIRF). Gracias por verlo, y buena suerte con sus experimentos.

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