Protocolo para el aislamiento del Círculo de Willis Ratón

El objetivo general de este procedimiento de disección es aislar el círculo murino de Willis para facilitar el estudio de los grandes vasos de la vasculatura cerebral del ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la expresión génica cerebrovascular en diversas enfermedades que afectan a los vasos cerebrales, como la enfermedad de Alzheimer y la angiopatía ameloidea cerebral. La principal ventaja de esta técnica es que los grandes vasos pueden aislarse rápida y fácilmente sin alterar la estructura del vaso.

Comience usando tijeras de iris para hacer una incisión de cuatro centímetros de largo en la pared abdominal y el peritoneo de un ratón anestesiado letalmente justo debajo de la caja torácica. A continuación, realice una incisión de unos milímetros de largo en el diafragma, continuando la incisión a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. Levante el esternón y sujete la punta con un hemostático, apoyando el hemostático en el cuello.

A continuación, recorte con cuidado el tejido adiposo que conecta el esternón con el corazón. Ahora pase una aguja de profusión de calibre 15 a través del ventrículo izquierdo hasta el ápice del corazón, y use unas tijeras para cortar uno de los lóbulos del hígado para crear una salida para la perfusión. Perfunda al animal con 25 a 50 mililitros de PBS a una velocidad de bombeo de 2,5 mililitros por minuto durante unos diez minutos.

El hígado debe blanquearse a medida que la sangre es reemplazada por PBS. Cuando el líquido del hígado esté completamente limpio, detenga la perfusión. Para aislar el cerebro, use unas tijeras Iris para hacer una incisión en la línea media a lo largo de la piel desde el cuello hasta la nariz.

Recorta la piel con las tijeras de iris para exponer el cráneo y eliminar cualquier músculo residual y tejido adiposo. A continuación, coloque las puntas de las tijeras Iris en un lado del foramen magnum y deslice con cuidado las puntas a lo largo de la superficie interna del cráneo hasta el meato auditivo externo. Realice una incisión similar en el otro lado del agujero magno, seguida de un corte en la línea media a lo largo de la superficie interna del hueso interparietal hasta el comienzo de la sutura sagital.

Planta las tijeras de iris cerradas en el hueso frontal entre los ojos en la sutura sagital y abre las hojas para dividir el cráneo en dos. Con pinzas, agarre los bulbos olfativos y use las tijeras de iris para cortar las conexiones nerviosas en la superficie ventral del cerebro. A continuación, sumerge el cerebro en una placa de Petri de 60 milímetros de PBS helado.

Para aislar el círculo de Willis, transfiera el plato a una bolsa de hielo bajo un microscopio de disección y gire el cerebro sobre su superficie dorsal para visualizar el círculo de Willis. Utilice las pinzas pequeñas para agarrar las arterias cerebrales anteriores en la base de los lóbulos olfativos y ejerza presión para disociar las arterias del continuo de los vasos. Corta las arterias cerebrales medias de la misma manera.

A continuación, utilice los extremos afilados de las pinzas para agarrar las arterias cerebrales medias y levantar el comienzo de las arterias comunicantes posteriores, desconectando ambos conjuntos de arterias del cerebro. A continuación, levante las arterias anteriores, tirando de ellas suavemente sobre el quiasma óptico en dirección dorsal anterior. Extirpar las arterias cerebelosas superior y posterior de la misma manera, seguido del desplazamiento de la arteria basilar.

Finalmente, use las pinzas para transferir suavemente todo el círculo de Willis a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga PBS helado, y fije los vasos en su lugar con pequeños alfileres, usando dos pinzas para eliminar con cuidado cualquier tejido cerebral restante. El círculo de Willis debe salir en una sola pieza, y debe ser ligeramente transparente debido a la ausencia de sangre residual en la vasculatura. El círculo limpio de Willis debe expresar específicamente los marcadores de células del músculo liso vascular, como la actina del músculo liso, la cadena pesada del músculo liso-miosina y la lisela.

Por el contrario, los marcadores neuronales, como la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina o la proteína 2 asociada a microtúbulos, deberían ser apenas detectables en el círculo de Willis. Además, la expresión del marcador endotelial, E-Selectina, en el tejido neural no circular de Willis, es muy similar a la obtenida para las muestras de círculo de Willis, posiblemente reflejando la existencia de una red capilar cerebral. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los vasos cerebrales del ratón son muy finos y se rompen fácilmente. Por lo tanto, la disección debe realizarse con mucho cuidado, sin prisas, para asegurarse de que toda la estructura se coseche de una sola pieza. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad neural inflamatoria exploren el trastorno vascular cerebral en modelos murinos de Alzheimer y enfermedades relacionadas como la angiopatía amiloide cerebral.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el círculo de Willis de un ratón.