Name: Protocolo para el aislamiento del Círculo de Willis Ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprende a aislar el círculo de Willis en ratones para estudiar la expresión génica cerebrovascular. Este método permite obtener vasos grandes sin alterar su estructura, facilitando investigaciones sobre enfermedades como el Alzheimer.

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Este trabajo fue apoyado por la Universidad de París VI y una donación de Pierre Fabre Innovación.

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las normas de la Comunidad Europea para el cuidado y uso de animales de laboratorio, con la aprobación del comité de ética local de la experimentación con animales (Ile de France-Paris-Comité, Autorización 4270). 1. anestesia <ol><li> Infundir una dosis letal de pentobarbital (hasta 1 mg / 10 g de peso corporal) (aguja de calibre 27 y una jeringa de 1 ml) por vía intraperitoneal en ratones adultos antes de la cirugía. </li></ol> La perfusión 2. Embarcación NOTA: No hay necesidad de aplicar el ungüento veterinario para los ojos durante la perfusión del vaso. Este procedimiento es rápido (5-10 minutos) y termina en la muerte del animal. Confirmar la falta de respuesta con una pizca dedo del pie. <ol><li> Usando tijeras iris, hacer una incisión, de aproximadamente 4 cm de longitud, en la pared abdominal y el peritoneo, justo debajo de la caja torácica. </li><li> Hacer una pequeña incisión (unos pocos milímetros de largo) en el diafragma y luego continue la incisión de la membrana a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. </li><li> Levantar el esternón y la abrazadera de distancia de la punta del esternón con la pinza hemostática; colocar la pinza hemostática en el cuello. Con cuidado, recortar el tejido adiposo que conecta el esternón hasta el corazón. </li><li> Pasar la aguja de perfusión de calibre 15 a través del ventrículo izquierdo en el vértice del corazón. </li><li> Por último, utilizar tijeras para cortar uno de los lóbulos del hígado para crear una toma de corriente. NOTA: Una salida alternativa se puede crear mediante el uso de tijeras iris para crear una incisión en la aurícula derecha. </li><li> Perfundir el animal con 25 a 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una bomba que funciona a una velocidad de 2,5 ml / min. El hígado debe Blanch como la sangre se sustituye con PBS. </li><li> Después de aproximadamente cinco minutos, una vez que el fluido desde el hígado está completamente claro, detener la perfusión. </li><li> Si se planea inmunotinción o tinción regular, perfundir el animal con 50 ml de paraformaldehído(PFA; 4% en PBS) durante 15 min. NOTA: Precaución, humos PFA son tóxicos. La perfusión del animal con PFA debe llevarse a cabo en una campana de humos ventilada. </li></ol> 3. El aislamiento del cerebro y el Círculo de Willis <ol><li> Aislamiento del cerebro <ol><li> Retire la cabeza con un par de tijeras quirúrgicas. </li><li> Hacer una incisión en la línea media con tijeras iris, a lo largo de la piel desde el cuello hasta la nariz. </li><li> Se quita la piel para exponer el cráneo y eliminar los músculos y los tejidos adiposos residuales con unas tijeras iris. </li><li> Coloque el extremo agudo de la tijera iris en el foramen magnum en un lado y deslice con cuidado a lo largo de la superficie interna del cráneo al meato auditivo externo (también conocido como el canal auditivo). </li><li> Reproducir la incisión se describe en 3.1.4 en el lado contralateral y hacer un corte a lo largo de la línea media de la superficie interior del hueso inter-parietal del inicio de la sutura sagital. </li><li> Plantar el iristijeras en el hueso frontal, justo entre los ojos, en la sutura sagital y luego abrirlas para dividir el cráneo en dos. </li><li> Levante el cerebro, el acaparamiento de los bulbos olfatorios y el uso de las tijeras iris para cortar las conexiones nerviosas en su superficie ventral. </li><li> Retire el cerebro y lo coloca en una placa de Petri de 60 mm que contenía PBS helado para el aislamiento de vaca. Sumerja por completo el cerebro en el PBS. Si el cerebro se fijó con PFA al 4% (para la sección posterior y la inmunotinción o manchas regular), guardarlo en un baño de PFA al 4% a 4 ° C durante 24 horas. </li></ol></li><li> El aislamiento del polígono de Willis NOTA: Se requiere un microscopio de disección para el aislamiento de vaca. El cerebro debe mantenerse a 4 ° C durante todo el procedimiento. <ol><li> Ponga el cerebro al revés (es decir, en su superficie dorsal) para visualizar la vaca. </li><li> Utilizar unas pequeñas pinzas para agarrar las arterias cerebrales anteriores (ACA) en la base de los lóbulos olfativos ( <strong&gt; a, Figura 1) y ejercer presión para disociarlos del continuo buque. Utilice el mismo procedimiento para cortar las arterias cerebral media (MCA) en B (figura 1). </li><li> Usa los extremos afilados de las pinzas para levantar y quitar las arterias principales que forman la vaca de la corteza. </li><li> Levantar el inicio de las arterias comunicante posterior (PCA) para desconectarlos de cerebro, sujetando las arterias cerebrales medias (MCA) con los fórceps. Recoger las arterias anterior (ACA y MCA) y tirar de ellos suavemente sobre el quiasma óptico en una dirección anterior-dorsal. Para evitar la interrupción de la vaca, interrumpir el procedimiento para hacer frente a las otras arterias. </li><li> Repetir los pasos 3.2.2 y 3.2.3 de las arterias cerebelosas superior y posterior (SCA) / (PCA) (C, figura 1) y para la arteria basilar (BA) (d, Figura 1), tirando de ellos en un dorsal- dirección anterior. Detener al final del procedimiento descrito in 3.2.4. </li><li> Retire toda la vaca por tirando suavemente con las pinzas. Coloque la vaca en un plato de 60 mm de Petri llena de helado de PBS y remover el tejido cerebral unida restante con dos pinzas, la celebración de la vaca en su lugar con pequeños alfileres. </li><li> Mantenga el CoW cosechado a -80 ° C para su posterior procesamiento para la purificación de ARN (rendimientos de extracción de ARN de grandes cantidades de ARN - aproximadamente 500 ng) o la extracción de proteínas. Nota: La vaca se puede mantener ex vivo durante 24 horas, adaptando el sistema de baño de órganos desarrollado por la arteria olfativa aislada del ratón 7. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama esquemático de una vista ventral del cerebro de ratón Destacando Comité de lo que la vaca se forma a partir de las dos arterias carótidas internas (MCA), que se derivan de las dos arterias cerebrales anteriores (ACA);. la basilararteriales (BA) se ramifica en el posterior (ACP) y superior (SCA) arterias cerebrales, y dos arterias vertebrales (VA).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe aquí un protocolo reproducible para el aislamiento del círculo de Willis. Los trastornos cerebrovasculares más comunes que implican el CdT son vasculopatías CAA-asociado, aterosclerosis intracraneal y aneurisma intracraneal, todos los cuales afectan a las paredes de los vasos arteriales. Los factores de riesgo son bien conocidos, pero la patogénesis molecular de estos trastornos cerebrales sigue siendo poco conocida y los marcadores biológicos específicos para predecir su ocurrencia son insuficientes. Existe...

El círculo arterial cerebral (circulus arterioso cerebri), también conocido como el polígono de Willis (vaca), el lazo de Willisor Willis polígono) fue descrito por primera vez por Thomas Willis en 1664. Es una anastomosis circulatorio situado alrededor del quiasma óptico y el hipotálamo que pueden ser considerado como un eje central el suministro de sangre al cerebro y las estructuras circundantes. La sangre entra en esta estructura a través de la carótida interna y las arterias vertebrales y fluye fuera del círculo a través de la mitad interior y las arterias cerebrales posteriores. Cada una de estas arterias ha ramas izquierda y derecha de cada lado del círculo. El basilar, puesto comunicación, y la comunicación de las arterias completa el círculo anterior (Figura 1 y Figura 2). El riesgo de alteración del flujo sanguíneo en cualquiera de las arterias de salida de flujo se reduce al mínimo por la fusión de sangre que entra en el círculo de la carótida y las arterias cerebrales, garantizando de este modo que la sangre suficiente se suministra a la blluvia. Esta estructura también sirve como la principal vía de flujo sanguíneo colateral en enfermedades oclusivas graves de la arteria carótida interna. Existen varios tipos de trastornos cerebrovasculares tienen su origen en la vaca. Los más comunes son la angiopatía amiloide cerebral (CAA) -asociado vasculopatías, la aterosclerosis intracraneal y los aneurismas intracraneales. 1, 2, 3 Estos trastornos pueden conducir a la hipoperfusión debido a la vasodilatación, e intracerebral y / o hemorragias subaracnoideas en última instancia se traduce en accidentes cerebrovasculares hemorrágicos o isquémicos o , a lo sumo, un ataque isquémico transitorio. Los recientes avances en los procedimientos de diagnóstico, incluyendo neuroimagen, posiblemente combinado con la angiografía, han hecho posible diagnosticar estas enfermedades cerebrovasculares importantes clínicamente, sin la necesidad de una biopsia cerebral. Sin embargo, los tratamientos eficaces y específicos (farmacológicos o endovasculares) la actualidad se carece y por lo tanto hay una necesidad de definir nuevosdianas moleculares. La identificación de nuevos objetivos de medicamentos para la prevención de estas enfermedades en los seres humanos requerirá modelos animales y formas de aislar el cerebro-vascular incluyendo la vaca. Estos modelos deben proporcionar evidencia de pistas y de los cambios específicos, incluyendo los cambios inflamatorios, que se producen en las paredes de los grandes vasos en modelos animales de aneurisma de la arteria intracraneal, AAC o aterosclerosis intracraneal. 4, 5, 6 Hemos establecido un método para el aislamiento CdT ratón para facilitar los estudios de inflamación de los vasos en la enfermedad de Alzheimer (AD) y enfermedades relacionadas, tales como la CAA. Este método para el aislamiento de la CoW ratón fue desarrollado para la evaluación de la expresión génica inflamatoria cerebrovascular durante la progresión de la enfermedad. Junto con la detección de la deposición de amiloide beta dentro de las paredes de las arterias y leptomeníngeo pial, este método podría hacer más fácil para disuadirmina de la posible relación entre la expresión de genes inflamatorios en la pared cerebro-vascular y acumulación de Aß-péptido. La red vascular del cerebro, incluyendo el leptomeníngeo y pial en el espacio subaracnoideo, es una extensión de las grandes arterias que forman el círculo de Willis. El método descrito aquí podría ser utilizado para aislar el CoW de cualquier linaje de ratón y podría ser utilizado para todo tipo de detección (por ejemplo, la expresión génica, la producción de proteínas y las modificaciones postraduccionales de proteínas) en los grandes vasos del ratón cerebro-vascular.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris finas endurecidas&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras - Rectas / Afiladas / Afiladas&nbsp; &nbsp; 16,5 cm</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de #7b Dumont&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con zoom</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Superficie 60mm Placa de cultivo Corning</td><td></td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para el aislamiento del círculo de willis ratón

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

El círculo arterial cerebral (circulus arterioso cerebral) o círculo de Willis (vaca) es una anastomosis circulatorio que rodea el quiasma óptico y el hipotálamo que suministra sangre al cerebro y las estructuras circundantes. Se ha implicado en varios trastornos cerebrovasculares, incluyendo angiopatía cerebral amiloide (CAA) vasculopatías -asociado, aterosclerosis intracraneal y aneurismas intracraneales. Los estudios de los mecanismos moleculares que subyacen a estas enfermedades para la identificación de nuevas dianas farmacológicas para su prevención requieren modelos animales. Algunos de estos modelos puede ser transgénico, mientras que otros implican el aislamiento del cerebro-vascular, incluyendo el método CoW.The descrito aquí es adecuado para el aislamiento de vaca en cualquier linaje de ratón y tiene un potencial considerable para el cribado (expresión de genes, la producción de proteínas, proteínas modificaciones posteriores a la traducción, análisis secretoma, etc.) los estudios sobre los grandes vasos del cerebro-ratónvasculatura. También se puede utilizar para estudios ex vivo, mediante la adaptación del sistema de baño de órganos aislados desarrollado para arterias olfativas ratón.

<html> El ratón perfundidos con PBS se mata y se aísla la vaca como se describe en la sección 3.2 del protocolo. Cuando la disección se realiza correctamente, la vaca debe salir en una sola pieza y debe ser ligeramente transparente debido a la ausencia de sangre residual en la vasculatura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Figura 2: La vaca del ratón después del ais...

Describimos aquí un protocolo reproducible para aislar el círculo del ratón de Willis.

Protocolo para el aislamiento del Círculo de Willis Ratón

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

El objetivo general de este procedimiento de disección es aislar el círculo arterial de Willis en ratones para facilitar el estudio de los vasos sanguíneos grandes de la cerebrovasculatura murina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la expresión génica cerebrovascular en diversas enfermedades que afectan a los vasos cerebrales, como la enfermedad de Alzheimer y la angiopatía amiloide cerebral. La principal ventaja de esta técnica es que los vasos grandes pueden aislarse rápida y fácilmente sin alterar la estructura vascular.Comience utilizando tijeras de iris para hacer una incisión de cuatro centímetros de largo en la pared abdominal y el peritoneo de un ratón letalmente anestesiado justo debajo de la caja torácica. A continuación, realice una incisión de unos pocos milímetros de largo en el diafragma, continuando la incisión a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. Levante el esternón y sujete la punta con una pinza hemostática, colocando la pinza sobre el cuello.Luego, corte cuidadosamente el tejido adiposo que conecta el esternón con el corazón. A continuación, pase una aguja de perfusión de calibre 15 a través del ventrículo izquierdo hasta el ápice del corazón, y use tijeras para cortar uno de los lóbulos del hígado y crear una salida para el perfusado. Perfunda al animal con 25 a 50 mililitros de PBS a una velocidad de bomba de 2,5 mililitros por minuto durante aproximadamente diez minutos.El hígado debe palidecer a medida que la sangre se reemplaza con PBS. Cuando el líquido que sale del hígado esté completamente claro, detenga la perfusión. Para aislar el cerebro, use tijeras de iris para hacer una incisión media a lo largo de la piel desde el cuello hasta la nariz.Retire la piel con las tijeras de iris para exponer el cráneo y eliminar cualquier tejido muscular y adiposo residual. A continuación, coloque las puntas de las tijeras de iris en un lado del foramen magno y deslice cuidadosamente las puntas a lo largo de la superficie interna del cráneo hasta el meato acústico externo. Realice una incisión similar en el otro lado del foramen magno, seguida de un corte medio a lo largo de la superficie interna del hueso interparietal hasta el inicio de la sutura sagital.Coloque las tijeras de Iris cerradas en el hueso frontal entre los ojos, en la sutura sagital, y abra las hojas para dividir el cráneo en dos. Con pinzas, sostenga los bulbos olfatorios y use las tijeras de Iris para cortar las conexiones nerviosas en la superficie ventral del cerebro. Luego sumerja el cerebro en una placa de Petri de 60 milímetros con PBS frío con hielo.Para aislar el círculo de Willis, transfiera el platillo a una bolsa de hielo bajo un microscopio de disección y gire el cerebro hacia su superficie dorsal para visualizar el círculo de Willis. Utilice la pinza pequeña para sujetar las arterias cerebrales anteriores en la base de los lóbulos olfatorios y ejerza presión para disociar las arterias del continuo vascular. Corte las arterias cerebrales medias de la misma manera.Luego, use los extremos afilados de la pinza para sujetar las arterias cerebrales medias y levantar el inicio de las arterias comunicantes posteriores, desconectando ambos pares de arterias del cerebro. A continuación, levante las arterias anteriores, tirando de ellas suavemente por encima del quiasma óptico en dirección anterior dorsal. Retire las arterias cerebelosas superiores y posteriores de la misma manera, seguido del desplazamiento de la arteria basilar.Finalmente, use la pinza para transferir suavemente todo el círculo de Willis a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga PBS frío con hielo, y fije los vasos en su lugar con alfileres pequeños, utilizando dos pinzas para retirar cuidadosamente cualquier tejido cerebral residual. El círculo de Willis debe salir en una sola pieza y debe ser ligeramente transparente debido a la ausencia de sangre residual en la vasculatura. El círculo de Willis limpio debe expresar específicamente marcadores de células musculares lisas vasculares, como la actina de músculo liso, la cadena pesada de miosina de músculo liso y la smoothelina.Los marcadores neuronales, como la proteína mielina oligodendrocito glicoproteína o la proteína 2 asociada a microtúbulos, por el contrario, deberían ser apenas detectables en el círculo de Willis. Además, la expresión del marcador endotelial, E-selectina, en tejido neural fuera del círculo de Willis, es muy similar a la obtenida en muestras del círculo de Willis, lo que posiblemente refleje la existencia de una red de capilares cerebrales. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos horas si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los vasos cerebrales del ratón son muy finos y se rompen fácilmente. Por lo tanto, la disección debe llevarse a cabo con mucha precaución, sin apresurarse, para asegurar que toda la estructura se obtenga en una sola pieza. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades neurológicas inflamatorias exploren los trastornos vasculares cerebrales en modelos de ratón de Alzheimer y enfermedades relacionadas, como la angiopatía amiloide cerebral.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el círculo arterial de Willis de un ratón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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Aprende a aislar el círculo de Willis en ratones para estudiar la expresión génica cerebrovascular. Este método permite obtener vasos grandes sin alterar su estructura, facilitando investigaciones sobre enfermedades como el Alzheimer.

Protocolo para el aislamiento del Círculo de Willis Ratón

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