La excitación externa de neuronas usando campos eléctricos y magnéticos en culturas de una y dos dimensiones

El objetivo general de este protocolo para la estimulación eléctrica y magnética de cultivos unidimensionales y bidimensionales es utilizar los cultivos neuronales de manera eficiente como un modelo reducido para la estimulación cerebral del que podemos extraer información y parámetros importantes. El uso de nuestro protocolo de estimulación eléctrica con cultivos unidimensionales nos permite medir parámetros específicos relacionados con la excitación neuronal, por ejemplo, cronaxia y reobase en diferentes compartimentos de la neurona. La técnica de estimulación magnética permite comparar el efecto de los campos magnéticos frente a los eléctricos en los cultivos neuronales.

Este modelo también nos permite diagnosticar y tratar mejor los trastornos cerebrales. Proponemos un método eficaz y fácil para cultivar redes neuronales de patrones en cualquier patrón de diseño, incluso redes unidimensionales. A continuación, podemos orientar los campos eléctricos y magnéticos variables en el tiempo con respecto a estas redes para separar y observar las contribuciones de los diferentes compartimentos de la neurona.

La principal ventaja de esta técnica es que no requiere sujetos humanos ni modelos animales, lo que permite una búsqueda extensa y exhaustiva de los parámetros adecuados para la estimulación neuronal. Yuri Burnishev, un técnico de mi laboratorio, y Ami Eisen, una estudiante de doctorado en el laboratorio, demostrarán el procedimiento. Para empezar, prepare cultivos neuronales con patrones mediante la siembra de células neuronales en cubreobjetos de vidrio parcialmente recubiertos con una capa de biorrechazo.

Para ello, limpie los cubreobjetos de 25 milímetros. Y usando una máquina de pulverización catódica, cubra el cubreobjetos con una capa de biorrechazo. Ajuste los parámetros para el proceso de deposición para crear una capa que consta de una película delgada de cromo de seis a 10 angstroms, que garantiza la estabilidad del recubrimiento y una capa de oro de 30 angstrom de espesor que proporciona al recubrimiento reactividad al tiol.

Una vez finalizado el proceso, retire el cubreobjetos de la máquina pulverizadora y examine el recubrimiento obtenido. A continuación, ensamble un sistema de trazador de bolígrafos modificado reemplazando la punta de tinta de un bolígrafo de plotter por una aguja de grabado de metal afilada. Coloque una lámina de caucho pegada a una placa rígida en el plotter para garantizar una superficie resistente y de alta fricción durante el grabado.

A continuación, ajuste la posición de la hoja pulsando los botones previstos en el trazador. Una vez que la lámina de goma esté en su lugar, pipetee una pequeña gota de agua sobre su superficie y coloque el cubreobjetos prerrecubierto sobre la gota. A continuación, con el plotter, graba las capas metálicas mediante un rayado repetitivo generando líneas de 200 micrómetros de grosor para crear los patrones deseados.

Antes de una estimulación eléctrica, coloque el cubreobjetos sembrado en una cámara de imágenes. Para estimular las células con un campo eléctrico de dirección constante, utilice dos electrodos paralelos separados por 11 milímetros y situados en lados opuestos del cultivo chapado en los cubreobjetos de 13 milímetros. A continuación, ensamble la cámara de imágenes del cultivo y el soporte de electrodos correspondiente de modo que los electrodos de alambre se sumerjan en el medio extracelular y se coloquen un milímetro por encima del cultivo.

A continuación, conecte el par de electrodos individuales al amplificador operacional que amplifica la señal del generador. Aplique un solo pulso de onda cuadrada bipolar con un ciclo de trabajo del 50% y una amplitud de 22 voltios. Utilice una onda bipolar sin componente de CC para evitar la electrólisis que puede producirse en los electrodos.

Aplique el pulso que dura de 10 microsegundos a cuatro milisegundos para garantizar una estimulación efectiva pero prevenir lesiones celulares. Para estimular las células con campos eléctricos de dirección variable, utilice dos pares de electrodos perpendiculares. Asegúrese de que los dos pares de electrodos, así como sus terminales de alimentación y monitoreo, estén completamente aislados eléctricamente entre sí y estén flotando desde tierra.

Para cambiar la orientación del campo eléctrico, varíe la amplitud del voltaje aplicado a los dos pares de electrodos. A continuación, determine la intensidad y la dirección del campo resultante mediante la suma de vectores. Para generar un campo giratorio de amplitud fija, aplique una onda sinusoidal a un par de electrodos mientras alimenta el otro par con una onda de coseno.

Para comenzar la estimulación magnética, coloque un cultivo neuronal, cultivado en un patrón circular, bajo el microscopio. Estimule el cultivo utilizando una bobina de estimulación magnética circular estándar y un estimulador de soporte que están disponibles comercialmente. Para estimular los cultivos con intensidades de campo magnético no estándar, conecte una bobina de estimulación magnética hecha a medida al estimulador hecho a medida.

Luego, con la ayuda de un puntero láser, alinee el centro del cultivo con el centro de la bobina para asegurar una estimulación exitosa. Ajuste las posiciones de la bobina para que permanezca aproximadamente cinco milímetros por encima del centro del cultivo. Una vez que la bobina de estimulación esté colocada correctamente, cargue el estimulador a un potencial de hasta cinco kilovoltios.

Luego, usando un interruptor de alta corriente y alto voltaje, descargue la corriente de alto voltaje a través de la bobina de estimulación para generar un pulso magnético que estimula la actividad de las neuronas cultivadas. Por último, monta una bobina en la misma posición que el cultivo neuronal y mide la intensidad del campo magnético generado. Este esquema muestra que al aplicar diferentes amplitudes de pulsos de voltaje a los dos pares de electrodos, los campos eléctricos se pueden orientar a todos los ángulos sin la necesidad de girar manualmente el cultivo.

Aquí están los ejemplos de registros de transitorios de calcio con estimulación eléctrica a diferentes voltajes aplicados. Cuando se aplica una duración constante de campo eléctrico, el número de neuronas que se disparan y responden al campo eléctrico muestra una distribución gaussiana acumulativa en función de la amplitud del voltaje. Y este es un ejemplo de una curva de fuerza-duración obtenida al emplear este protocolo.

Para los cultivos en anillo que responden al campo magnético, la tasa de éxito de la estimulación crece con el radio de cultivo. Este gráfico muestra la relación entre el tamaño del anillo y la intensidad del campo magnético. La mayoría de las excitaciones exitosas de los cultivos se encuentran en la superposición entre el espacio de la fase experimentalmente accesible y la región de alta probabilidad.

Una vez dominado, la preparación de cultivos unidimensionales se puede realizar en tres o cuatro horas. Al realizar la estimulación eléctrica y magnética, es importante recordar permitir la recuperación completa del cultivo de la etapa de estimulación y asegurarse de que todo el equipo esté flotando con respecto a la tierra eléctrica. Siguiendo este procedimiento, se pueden abordar otras cuestiones como el cultivo de neuronas de diferentes áreas del cerebro, la medición de estadísticas, por ejemplo, de las neuronas corticales.

Otra posibilidad es medir los parámetros de cualquier neurona modelo de enfermedad. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para la optimización de la fuerza y las duraciones necesarias para una estimulación cerebral efectiva y segura. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo crear cualquier patrón deseado de cultivos neuronales y poder estimularlos eléctrica o magnéticamente para el estudio de las interacciones de las neuronas con los campos electromagnéticos.