Name: La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a disociar neuronas Fos-expresantes de tejido cerebral de rata fresco o congelado para análisis FACS. Este método permite aislar células neuronales específicas y estudiar neuroadaptaciones moleculares en neuronas activadas.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del NIDA (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. fue apoyado por un nombramiento en el Programa de Participación en Investigación del NIDA patrocinado por los Institutos Nacionales de Salud y administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación, y recibió apoyo financiero adicional de una beca Becas-Chile administrada por CONICYT y la Universidad de los Andes, Santiago de Chile. Las instalaciones centrales de Johns Hopkins FACS contaron con el apoyo de la P30AR053503 de Premios del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel del Instituto Nacional de Salud.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de laboratorio 16. Nota: Todos los pasos siguientes utilizan tubos de centrífuga de bajo vinculante que se mantuvieron en hielo a menos que se especifique lo contrario. 1. Preparación Antes de Recogida de tejido <ol><li> Establecer la centrífuga a 4 ° C </li><li> esmalte de fuego un conjunto de tres pipetas Pasteur de vidrio con diámetros decrecientes de aproximadamente 1,3, 0,8, y 0,4 mm para cada muestra. </li><li> Preparar etiquetados 1,7 ml tubos que contienen 1 ml de tampón frío A y mantener los tubos en hielo. </li><li> Preparar una bandeja de hielo que contiene el cerebro de cortar la matriz, espátulas y placas de vidrio (o placa de Petri de vidrio invertida) en los que realizar la disección. Pre-enfriamiento de dos o más hojas de afeitar en el papel placas de vidrio y tejidos de uso para secar todos los instrumentos que tocan el tproblema. </li><li> Descongelar la solución de enzima a temperatura ambiente (RT) durante 30 min antes de la recogida de tejidos. </li></ol> 2. Tejido Recogida y disección <ol><li> Iniciar el comportamiento o el tratamiento farmacológico 90 minutos antes de la recogida de tejidos. NOTA: Para obtener los resultados que se muestran aquí, inyecciones intraperitoneales agudos de 5 mg metanfetamina / kg en ratas en un ambiente nuevo (condición de prueba) y ingenuo ratas se mantienen en sus jaulas de origen (condición de control) se realizaron. </li><li> Anestesiar la rata, colocándolo en un frasco de vidrio con isoflurano desecador saturada y decapitar a la rata de 30 - 60 segundos más tarde usando una guillotina. Use las tijeras para quitar la piel y los músculos de la cabeza y exponer el cráneo. Utilice unas pinzas para cortar el cráneo y abrir el agujero occipital y quitar la parte posterior del cráneo. Utilice unas pinzas para cortar a lo largo de los bordes superiores del cráneo para exponer el cerebro. Tenga cuidado de no dañar el cerebro. Use una espátula para sacar suavemente bajo unad elevar el cerebro. Elevar el cerebro y cortar los nervios hasta el cerebro está libre 17. </li><li> Diseccionar tejido usando hojas de afeitar. NOTA: Obtener muestras de tejido utilizando cualquiera de los métodos siguientes: (2.3.1) del tejido recién disecados; (2.3.2) de tejido congelado después de la disección; o (2.3.3) de tejido congelado diseccionado de todo el cerebro congelado. Mantener la matriz de corte en rodajas de cerebro, hojas de afeitar y la placa de vidrio seco durante la disección y procesos como el agua condensada picado puede conducir a la lisis hipotónica de las células. Use lentes de aumento para garantizar la disección precisa. <ol><li> Para el tejido recién disecados, coloque el cerebro recién extraída en una matriz de corte en rodajas de cerebro (una rata en forma de cerebro-molde de metal con ranuras para las hojas de afeitar a intervalos de 1 mm) que se ha enfriado en hielo. Inserte dos o más hojas de afeitar pre-refrigerados en las ranuras para cortar rodajas coronales que contienen la región (s) de cerebro de interés. Coloque el tramo cortado en la placa de vidrio frío. Nota: diseccionar el cerebro regions de interés sobre una placa de vidrio frío. </li><li> Para tejido congelado después de la disección, la disección de la región (s) de interés cerebro de rodajas de cerebro recién extraída, similar a la descrita anteriormente en el apartado 2.3.1. Coloque el tejido diseccionado en un microtubo y rápidamente congelar el tejido sumergiendo el microtubo en -40 ºC isopentano durante 20 s. Mantener el tejido diseccionado congelado en todo momento en un congelador ºC -80 hasta su posterior procesamiento. </li><li> Para tejidos congelados, congelar inmediatamente el cerebro recién extraída de -40 ºC isopentano y guardar en una bolsa sellada a -80 ºC durante un máximo de 6 meses. <ol><li> En el día de la disección, coloque el cerebro congelado en un criostato fijada en aproximadamente -20 ºC (no más caliente que -18 ºC) durante aproximadamente 2 horas para equilibrar la temperatura. NOTA: Los cerebros se pueden cortar fácilmente a esta temperatura, mientras que las temperaturas mucho más frías hacen que el cerebro demasiado frágil para ser cortado de forma segura. </li><li> Utilice hojas de afeitar para cortar 1 - 2 mm de cortes coronaleslos cerebros congelados en un criostato. Use una aguja de 12 a 16 de calibre romo para obtener golpes de tejido de estos cortes en condiciones de congelación. Mantener el tejido diseccionado congelado en todo momento hasta su posterior procesamiento. </li></ol></li></ol></li><li> Añadir 1 - 2 gotas de tampón A para cubrir el tejido diseccionado con anterioridad al picado. Eliminar la mayor parte de la sustancia blanca del tejido utilizando dos hojas de afeitar para evitar la pérdida de las neuronas durante el resto del proceso de trituración. Si a partir de tejido congelado, y luego permitir que el tejido se descongele en la placa de vidrio en frío, por no más de 1 minuto antes de aplicar la solución tampón A. </li><li> Picar el tejido 100 veces en cada dirección ortogonal con una hoja de afeitar sobre una placa de vidrio frío. Mantenga la cuchilla de afeitar vertical a la placa de vidrio cuando picado. NOTA: picar carne a fondo es crítico para todos los pasos del protocolo. </li><li> Utilice hojas de afeitar para transferir el tejido picado en tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de tampón frío A. Invertir el tubo 3 - 5 veces para keep todo el tejido picado en la solución. </li></ol> La disociación 3. célula NOTA: El uso final suave sobre la mezcla de todas las siguientes etapas finales. No utilice un mezclador de vórtice y evitar burbujas de aire que causan daño celular. <ol><li> Centrifugar los tubos de muestras a 110 xg durante 2 min a 4 ºC. sobrenadante de descarte. Añadir lentamente 1 ml de solución de enzima recién descongelado frío (que contiene una mezcla de enzimas proteolíticas) por la pared interior del microtubo. Inmediatamente succionar todo el sedimento y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo sólo 4 veces con una pipeta moderadamente grande diámetro de la punta para dispersar el sedimento de tejido picado. </li><li> Invertir los microtubos de inmediato para evitar el sedimento se pegue a la parte inferior y se incuban las muestras con la mezcla de extremo a extremo durante 30 min a 4 ° C </li><li> Después de la digestión enzimática de tejidos, centrifugar los tubos a 960 xg durante 2 min a 4 ºC. Eliminar el sobrenadante y añadir 0,6 ml de tampón A. fría immediately después de añadir el tampón A, utilice la misma punta de la pipeta para dispersar el sedimento al absorber todo el sedimento y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 5 veces. </li><li> Mecánicamente se tritura el tejido digerido y recoger en tubos de 15 ml utilizando los siguientes pasos. Para cada muestra, utilice un conjunto separado de 3 pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego con descendiendo diámetros de aproximadamente 1,3, 0,8 y 0,4 mm unidas a las bombillas de látex. <ol><li> tritura suavemente cada muestra 10 veces con la pipeta de vidrio de 1,3 mm. Deje que la muestra se conforma con 2 minutos en hielo (los restos y células disociadas se depositan en el fondo). Recoger el sobrenadante (~ 0,6 ml) y transferir a un tubo cónico de 15 ml (tubo # 1). </li><li> Añadir 0,6 ml de tampón de una solución al sedimento restante. Se tritura la muestra 10 veces con la pipeta de vidrio 0,8 mm. Deje que la muestra se conforma con 2 minutos en hielo. Recoger el sobrenadante (~ 0,6 ml) y la transferencia de los mismos 15 ml tubo cónico # 1. </li><li> Añadir 0,6 ml de tampón A a la solución restante pellet. Se tritura la muestra 10 veces con la pipeta de vidrio 0,4 mm. Deje que la muestra se conforma con 2 minutos en hielo. Recoger el sobrenadante (~ 0,6 ml; sin tocar el pellet con las células no disociadas) y la transferencia a los mismos 15 cónica tubo # 1 ml. NOTA: Mantener la pipeta de 0,4 mm de diámetro en el tubo # 1 para las siguientes etapas de trituración. </li><li> Repita el paso 3.4.3 tres veces más utilizando la pipeta de vidrio más pequeño (~ 0,4 mm de diámetro), y recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 ml separados (tubo # 2). </li><li> Triturar las suspensiones celulares recogidas en tubos # 1 y # 2 de 10 veces más utilizando la pipeta de vidrio de 0,4 mm y mantener en hielo. </li></ol></li></ol> 4. Fijación y permeabilización de la célula <ol><li> Preparar 4 microtubos por muestra (dos microtubos de células de tubo # 1 y dos para las células de tubo # 2) mediante la adición de 800 l de etanol al 100% frío (almacenado a -20 ° C antes de su uso) en cada tubo y mantenerlos en hielo . Nota: El final de etanolconcentración será 50%. </li><li> Pipetear 800 ~ l de las suspensiones de células (de tubo # 1 y el tubo # 2) en cada uno de los 4 tubos que contenían etanol frío y invertir los tubos para mezclar las muestras. </li><li> Incubar los tubos en hielo durante 15 min mientras invirtiendo los tubos cada 5 min. </li><li> Después de la fijación / permeabilización, centrifugar los tubos a 1.700 xg durante 4 minutos a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Deja 50 l de solución para evitar la pérdida de células. NOTA: Los pellets en esta etapa son de color blanco y se adhieren menos a la pared de los tubos que antes permeabilización. Por lo tanto, eliminar el sobrenadante con cuidado al tocar la pared del microtubo donde no hay pellets y elaborar el sobrenadante lentamente utilizando una micropipeta. </li></ol> 5. La filtración de la célula <ol><li> Vuelva a suspender los pellets desde el paso 4.4 con PBS frío de la siguiente manera: <ol><li> Añadir 550 l de PBS frío a uno de los dos microtubos procedentes de tubo # 1, y el uso de un pi moderadamente diámetro grandela punta de la pipeta suavemente pette a la suspensión de células arriba y abajo 5 veces. Repetir el mismo para un microtubo que viene de tubo # 2. </li><li> Para las células de tubo # 1, utilizando la misma pipeta, transferir la primera suspensión de células a la segunda pellet. Resuspender el segundo precipitado pipeteando suavemente la suspensión celular combinada arriba y abajo 5 veces. </li><li> Para las células de tubo # 2, resuspender y combinar los gránulos (es decir, microtubos tercero y cuarto) como se describe en 5.1.2. </li></ol></li><li> Filtrar las dos suspensiones de células de los pasos 5.1.2 y 5.1.3 por separado utilizando dos pares diferentes de coladores celulares (100 micras y 40 micras tamaños de poros) como sigue: <ol><li> Pre-húmedo cada filtro de células mediante la adición de PBS en el interior del filtro. Usar una pipeta para eliminar el exceso de PBS desde el exterior del filtro. </li><li> Pipetear la suspensión de células de la etapa 5.1.2 uniformemente sobre el primer filtro de células con tamaño de poro de 100 micras. Recoger el flujo a través en un tubo de 50 ml en hielo. Utilice la pipette para recoger el Flow través adjunta en la parte inferior lado exterior del filtro de células. </li><li> Utilice la misma pipeta para transferir el flujo a través de la filtro de células 100 micras para el filtro de células 40 micras. Recoger este flujo a través de otro tubo de 50 ml en hielo. Al transferir el flujo a través del filtro de 40 micras de células, cambiar a las nuevas puntas de pipeta para evitar la contaminación del filtro de 100 micras de células. </li><li> Repita estos pasos para la suspensión de células de la etapa 5.1.3 utilizando un nuevo conjunto de filtros. </li></ol></li><li> Combinar los dos de flujo a través de cada muestra para un volumen final de aproximadamente 1 ml por muestra. </li></ol> 6. La incubación con anticuerpos NOTA: Utilice pequeñas alícuotas de las suspensiones de células del cerebro para preparar múltiples muestras de control para ajustar el flujo apropiado citómetro de configuración antes de ejecutar la muestra principal. Para cada anticuerpo etiquetado, preparar muestras de control que incluyen anticuerpos, no sólo el SEanticuerpo cundaria (u otro marcador fluorescente), y luego ambos anticuerpos primarios y secundarios (u otro marcador fluorescente). Utilice estos controles para ajustar las puertas que separan específica frente etiquetado no específica en el citómetro de flujo. Cuando sea posible, utilice fluorocromos que no requieren compensación. Aumentar el volumen final de las muestras de control gating a un volumen final de 700 l mediante la adición de PBS antes de la adición de los anticuerpos primarios. <ol><li> Preparar de dispersión de luz y DAPI muestra de control mediante la transferencia de una muestra de 100 l de las células filtradas a un microtubo de 1,7 ml. Añadir 600 l de PBS frío con 1 mg / ml DAPI para la tinción de los núcleos. Incubar durante 10 min con mezcla de extremo a extremo, y lavar (como se indica en los pasos 6.4.2 a 6.4.5) antes de pasar a través del citómetro de flujo. Nota: este ejemplo sólo se utiliza para establecer el / puerta de células núcleos antes de la clasificación de las células que quedan en la máquina de FACS. </li><li> Preparar muestras de control inmunomarcadas individuales mediante la transferencia de 100 &amp; #181; l de las células filtradas a un microtubo de 1,7 ml. Añadir 600 l de PBS frío con un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo NeuN). Añadir 600 l de PBS frío a un microtubo con otro anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo Fos). Añadir el anticuerpo secundario correspondiente si no es un anticuerpo primario directa conjugado. NOTA: Estas muestras se utilizan para determinar el voltaje del tubo fotomultiplicador apropiado (PMT), y para evaluar la superposición de las dos señales fluorescentes si es necesario. Las concentraciones de anticuerpos deben titularse para lograr la mejor relación señal-ruido en todos los canales. La superposición de señales fluorescentes también pueden ser compensadas por la calibración interna de los diferentes canales fluorescentes dentro del citómetro de flujo. </li><li> Preparar doble muestra de control negativo marcado fluorescente mediante la transferencia de 100 l de las células filtradas a un microtubo de 1,7 ml. Añadir 600 l de PBS frío con los anticuerpos secundarios por sí solos o anticuerpos primarios directa conjugados de IgG. NOTA: Thimuestra de control s se puede utilizar cada vez que antes de la clasificación para determinar la fluorescencia de fondo para cada fluoróforo. </li><li> Preparar la prueba principal para ser ordenados. <ol><li> Transferir 700 l de las células filtradas en un microtubo de 1,7 ml. Añadir 7 l (1: 100) de anticuerpo primario conjugado Fos directamente a Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) y 1,4 l (1: 500) de anticuerpo primario NeuN conjugado directamente con ficoeritrina (anti-NeuN-PE). Incubar los tubos durante 30 min a 4 ºC con mezcla de extremo a extremo. </li><li> Al final de la incubación, añadir 800 l de PBS frío a cada microtubo, incluyendo la muestra principal y las muestras de control, y mezclar por inversión. </li><li> microtubos centrifugar a 1.300 xg durante 3 min a 4 ºC. Descartar el sobrenadante, dejando 50 l sobrenadante para prevenir la pérdida de células. </li><li> Añadir 1 ml de PBS frío a las células de pellets y resuspender utilizando una pipeta con un diámetro de la punta moderadamente grande. </li><li> Centrifugar a 1300 xg durante 3 min a 4 ºC. reiscard el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el precipitado en 500 l de PBS frío (Ajustar el volumen final en función del tamaño de la pastilla). </li><li> Transferencia y filtrar la suspensión en un tubo de ensayo FACS de fondo redondo con una tapa de filtro celular (40 micras). Mantener las células immunolabeled en hielo e inmediatamente realizar FACS. Nota: Para el filtrado, toque la punta de la pipeta verticalmente en la tapa del filtro y empuje la suspensión celular a través de él. </li></ol></li><li> Establecer citómetro de flujo puertas utilizando muestras de control. <ol><li> Utilice la dispersión de la luz y DAPI muestra de control para identificar la población de células neuronales de los eventos totales y restos celulares. NOTA: Los cuerpos celulares en esta preparación son solamente 1 - 2% de los eventos totales (el resto son desechos y procesos celulares rotas). Sobre la base de la señal fluorescente DAPI (indicando núcleos) y dispersión frontal (tamaño de la celda), es posible localizar los cuerpos celulares y la puerta hacia atrás sobre la base del primero y la cara propiedades de la luz de dispersión delas células (como se muestra en la Figura 1 A, B). </li><li> Usa los individuales muestras de control inmunomarcadas para determinar los valores de voltaje PMT, y analizar desbordamiento de la emisión de un fluorocromo específico en otro filtro / canal (por ejemplo, Alexa Fluor 488 / FITC o ficoeritrina). Si las señales fluorescentes se superponen, corregir el solapamiento mediante el ajuste de los niveles de compensación manualmente. </li><li> Utilice el doble control negativo marcado con fluorescencia para establecer el umbral para la población positiva. NOTA: La señal procedente de esta muestra se piensa que es debido a la auto-fluorescencia y las células de la muestra principal situado por encima de este umbral puede ser considerado como positivo. Por lo general, los parámetros de umbral para la clasificación son más estrictos y aproximadamente 2/3 de la parte superior de las células marcadas por encima del control negativo en realidad están ordenados. </li></ol></li><li> Ordenar las neuronas de la muestra principal por FACS en microtubos de 1,7 ml. Recoger las células en 50 l de RNAtampón de extracción. Después de la clasificación, vortex y centrifugar el tubo y mezclar la suspensión con la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces para recuperar todas las células seleccionadas de las paredes del tubo. </li><li> Incubar la suspensión celular ordenada a 42 ºC durante 30 min para asegurar que todas las células se lisan antes de la extracción de ARN, y luego centrifugar a 2800 xg durante 2 min a 4 ºC. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de RNasa libre para el almacenamiento a largo plazo a -80 ºC o inmediatamente procesar la muestra para el aislamiento de ARN, síntesis de ADNc, gen diana de pre-amplificación y qPCR, como se describió anteriormente 13-15. </li></ol>

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<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> J Vis Exp. , e52537(2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

FACS se pueden utilizar para clasificar las neuronas y otros tipos de células de cualquiera de los tejidos del cerebro adulto fresca o congelada. Como se mencionó en la introducción, la capacidad de utilizar tejido congelado permite la utilización óptima de muestras de animales que han sido sometidos a procedimientos conductuales complejas y prolongadas, tales como estudios de autoadministración y la recaída en la adicción a la investigación. Estos procedimientos conductuales suele tardar 1 - 2 horas o más, y requieren ...

Durante el aprendizaje, los animales forman asociaciones entre conjuntos complejos de estímulos muy específicos. Esta información de alta resolución se cree que está codificada por alteraciones en los patrones específicos de neuronas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales. Conjuntos neuronales han sido recientemente identificado por la inducción de genes inmediatamente tempranos (IEGs) como Fos, Arco, y Zif268 y sus productos proteicos en las neuronas que se activan durante el fuerte comportamiento o exposición a estímulos. Las neuronas que expresan Fos, en particular, se ha demostrado que desempeñan un papel causal en el contexto y los comportamientos aprendidos 1-4-cue específica. Por lo tanto, neuroadaptaciones moleculares únicas dentro de estas neuronas que expresan Fos-activados son los mejores candidatos para los mecanismos neuronales que codifican las asociaciones formadas durante los trastornos de aprendizaje y aprendizaje normales, anormales, como la adicción y trastorno de estrés postraumático (TEPT) 5 aprendidas. FluoreScence de células activadas (FACS) ha permitido recientemente análisis de neuroadaptaciones moleculares únicas dentro de las neuronas que expresan Fos. La citometría de flujo y clasificación de células se desarrollaron en la década de 1960 6,7 para caracterizar y aislar células de acuerdo con sus características de dispersión de luz y de inmunofluorescencia, y han sido utilizados en la inmunología y la investigación del cáncer. Sin embargo citometría de flujo y FACS requiere células individuales disociados que son difíciles de obtener a partir de tejido de cerebro adulto. FACS se utilizó primero para aislar y analizar la proteína verde fluorescente (GFP) que expresan las neuronas del cuerpo estriado de los ratones transgénicos que no requiere etiquetado anticuerpo 8,9. Hemos desarrollado un método FACS basada en anticuerpos 10 para aislar y evaluar alteraciones moleculares en las neuronas activadas por drogas y / o señales en los animales de tipo salvaje 11-15 Fos-expresión. En este método, las neuronas se marcaron con un anticuerpo contra el marcador neuronal NeuN en general, mientras que las neuronas activado fuertementeson etiquetados con un anticuerpo contra Fos. A pesar de que nuestro método inicial necesaria puesta en común de hasta 10 ratas por muestra de tejido fresco, modificaciones posteriores del protocolo permitió el aislamiento FACS de Fos-expresión de las neuronas y de la polimerasa cuantitativa Reacción en Cadena de análisis (qPCR) de áreas discretas del cerebro a partir de una sola rata 13-15 . En general, no se encontraron alteraciones moleculares únicas en las neuronas activadas durante una variedad de comportamientos y al contexto de referencia en la investigación activados por la adicción 12,14,15 Fos-expresión. Un importante problema logístico con la realización de FACS en tejido fresco es que se necesita un día entero para disociar el tejido y el proceso por FACS. Además, sólo cuatro muestras pueden ser procesadas por día. Esto generalmente significa que sólo un área del cerebro puede ser evaluado de cada cerebro y las restantes áreas del cerebro tienen que ser desechados. Este es un problema importante para los procedimientos de comportamiento bajo rendimiento, tales como la auto-administración y trai extinciónNing que requiere cirugía y de muchas semanas de entrenamiento intensivo. Además, los procedimientos largos y complicados de comportamiento en el día de la prueba hace que sea difícil llevar a cabo FACS en el mismo día. Sería una ventaja significativa para poder congelar los cerebros de los animales inmediatamente después de las pruebas de comportamiento, y luego aislar las neuronas que expresan Fos-de una o más áreas del cerebro en diferentes momentos de la elección de los investigadores. Aquí demostramos que nuestro protocolo de FACS se puede utilizar para aislar las neuronas que expresan Fos-(y otros tipos de células) de tejido cerebral fresco y congelado. Como ejemplo, se aislaron neuronas de cuerpo estriado de rata después de las inyecciones de metanfetamina agudos y de ratas ingenuas sin inyecciones (condición control) Fos-expresión. Sin embargo, este protocolo FACS se puede utilizar después de cualquier tratamiento conductual o farmacológico. análisis de qPCR posterior de las muestras indicó que la expresión de genes a partir de estos tipos de células puede ser evaluada con similar la eficiencia a partir de tejido en fresco y congelados.

<table><tbody><tr><td>Matriz cerebral</td><td>CellPoint Scientific</td><td>69-2160-1</td><td>para obtener cortes coronales de cerebro</td></tr><tr><td>Hibernación A de baja fluorescencia</td><td>Brain Bits</td><td>HA-lf</td><td>Buffer A en el protocolo se utiliza para procesar tejidos y células desde la disociación hasta las etapas de fijación</td></tr><tr>La solución enzimática<td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td>en el protocolo se utiliza para la digestión enzimática de tejidos antes de la trituración</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1,5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>para evitar la pérdida de células durante el protocolo</td></tr><tr><td>Cell Strainer, 40 &micro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>para filtrar la suspensión de la célula</td></tr><tr><td>Cell Strainer, 100 &micro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>para filtrar la suspensión celular</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión de filtro</td><td>celular BD Bioscience</td><td>352235</td><td>para filtrar la suspensión celular antes de pasar por el citómetro de flujo</td></tr><tr><td>Pasteur Pipet, vidrio</td><td>Suministro NIH</td><td>6640-00-782-6008</td><td>para hacer trituración de tejidos</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE, clon A60 (monoclonal de ratón) anticuerpo</td><td>EMD Millipore</td><td>FCMAB317PE</td><td>anticuerpo para detectar neuronas</td></tr><tr><td>Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular&nbsp;</td><td>Anticuerpo 8677</td><td>para detectar células que expresan Fos,</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>para marcar núcleos</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN PicoPure de</td><td>Applied Biosystems.</td><td>KIT0204</td><td>El kit incluye el tampón de extracción de ARN para el paso 6.14. Se utiliza para recolectar células clasificadas</td></tr><tr><td>Superscript III sistema de síntesis de ADNc de primera cadena</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td>para sintetizar ADNc a partir de ARN</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems.</td><td>4391128</td><td>hacer la preamplificación dirigida de cDNA</td></tr><tr><td>TaqMan Advance Fast Master&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados.</td><td>4444963</td><td>hacer PCR usando sondas TaqMan</td></tr><tr><td>Fos TaqMan probe</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00487426_g1</td><td>Sonda TaqMan/cebadores</td></tr><tr><td>NeuN Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Secuencia de nucleótidos</td> <td>CACTCCAACAGCGTGAC</td> para marcador de genes neuronales</tr><tr><td>NeuN Forward primer</td><td>Applied Biosystems.</td>Secuencia de nucleótidos <td>GGCCCCTGGCAGAAAGTAG</td><td>para marcador de genes neuronales</td></tr><tr><td>NeuN Imprimación inversa</td><td>Applied Biosystems.</td>Secuencia de nucleótidos <td>TTCCCCCTGTCCTTCTGA</td><td>para marcador de genes neuronales</td></tr><tr><td>Gfap Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00566603_m1</td><td>Sonda TaqMan/cebadores para el marcador genético astrocityc</td></tr><tr><td>iba-1 Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00574125_g1</td><td>Sonda TaqMan/cebadores para marcador de genes microglya</td></tr><tr><td>Gapdh Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td>Secuencia de nucleótidos <td>CTCATGACCACAGTCCA</td><td>para referencia/mantenimiento de genes</td></tr><tr><td>Gapdh Forward primer</td><td>Applied Biosystems.</td><td>GACAACTTTGGCATCGTGGAA</td><td>secuencia de nucleótidos para gen</td></tr><tr><td>Gapdh Reverse cebador</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Secuencia de nucleótidos de</td> <td>CACAGTCTGGGGCAGTGA</td> para gen</tr><tr><td>Oligo2 Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn01767116_m1&nbsp;</td><td>Sonda TaqMan/cebadores para marcador de genes oligodendrocitos</td></tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>Rainin 17014382</td><td></td><td>Se denomina pipeta con un gran diámetro de punta en los pasos 3.1 y 3.3 para la trituración suave de tejidos y en el paso 6.7 para la resuspensión de células</td></tr><tr><td>7500 Sistema de PCR rápido en tiempo real</td><td>de Applied Biosystems.</td><td>446985</td><td>para PCR cuantitativa</td></tr><tr><td>FACSAria I Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>para la clasificación FACS</td></tr></tbody></table>

la fluorescencia de células activadas (facs) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan fos-fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

El estudio de la neuroplasticidad y alteraciones moleculares en los comportamientos aprendidos está cambiando a partir del estudio de las regiones de todo el cerebro para el estudio de un conjunto específico de neuronas activadas escasamente distribuidas llamados conjuntos neuronales que median las asociaciones aprendidas. La fluorescencia de células activadas (FACS) ha sido recientemente optimizado para el tejido de cerebro de rata adulta y se permitió el aislamiento de las neuronas activadas usando anticuerpos contra el marcador neuronal NeuN y proteínas Fos, un marcador de neuronas fuertemente activados. Hasta ahora, las neuronas que expresan Fos y otros tipos de células fueron aisladas de tejido fresco, lo que supuso el proceso de días largos y permiten un número muy limitado de muestras de cerebro para ser evaluados después de procedimientos largos y complejos de comportamiento. Aquí encontramos que los rendimientos de las neuronas y ARNm de Fos estriado dorsal Fos-expresión fueron similares entre el tejido y el tejido diseccionado recién congelado a -80 ºC durante 3 - 21 días. Además, se confirmó el fenotipode las células clasificadas NeuN-positivos y NeuN-negativas mediante la evaluación de la expresión de genes de neuronal (NeuN), astrocitos (GFAP), oligodendrocíticos (oligo2) y marcadores microgial (Iba1), lo que indica que el tejido congelado también se puede utilizar para el aislamiento FACS de tipos de células gliales. En general, es posible recoger, analizar y congelar el tejido cerebral para las sesiones múltiples de FACS. Esto maximiza la cantidad de datos obtenidos a partir de sujetos animales valiosos que a menudo han sido sometidos a procedimientos largos y complejos de comportamiento.

Clasificación de las neuronas Fos-positivos y negativos de Fos-tejido estriado dorsal frescos y congelados de ratas individuales después de las inyecciones de metanfetamina agudas. El protocolo descrito anteriormente se utiliza para ordenar las neuronas Fos-positivos y Fos-negativos de una sola rata dorsal estriado 90 min después de una inyección intraperitoneal de metanfetamina (5 mg / kg). ingenuo ratas en sus jaulas se util...

Aquí se presenta un protocolo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para estudiar las alteraciones moleculares en Fos-expresión de conjuntos neuronales a partir de tejido cerebral en fresco y congelados. El uso de tejido congelado permite el aislamiento FACS de muchas áreas del cerebro a través de múltiples sesiones para maximizar el uso de sujetos animales valiosos.

La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

El objetivo general de este procedimiento es disociar neuronas que expresan Fos a partir de tejido cerebral de rata adulta fresco o congelado para su posterior clasificación celular activada por fluorescencia, o FACS. Este método puede utilizarse para aislar células neuronales de interés con el fin de identificar las neuroadaptaciones moleculares únicas de las neuronas activadas por conducta. La principal ventaja de esta técnica es que permite el uso de tejido congelado, facilitando así el aislamiento de células de múltiples áreas cerebrales en diferentes días.Para procesar este tejido cerebral fresco, inserte dos o más cuchillas de afeitar previamente enfriadas en las ranuras de una matriz para corte cerebral enfriada con hielo, con el fin de obtener cortes coronales de uno a dos milímetros que contengan las regiones cerebrales de interés, colocando los cortes sobre una placa de vidrio fría a medida que se realizan. Primero, diseccione la región cerebral de interés, deseche las demás áreas y elimine la sustancia blanca. Para congelar el tejido, transfiera las muestras a un microtubo y sumerja el tubo en isopentano a menos 40 grados Celsius durante 20 segundos, para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius hasta su posterior procesamiento.Para picar el tejido, permita que las muestras se descongelen sobre una placa de vidrio fría durante no más de un minuto antes de cubrir las muestras con una o dos gotas de solución tampón A. A continuación, sosteniendo una cuchilla completamente vertical respecto a la placa, pique el tejido 100 veces en cada dirección ortogonal. Para picar completamente el tejido, es fundamental mantenerlo húmedo con tampón A y seguir los tiempos y direcciones de picado especificados.Es fundamental eliminar la mayor parte de la sustancia blanca durante la disección del tejido y mantener el tejido cubierto con el tampón A para mejorar la eficiencia del picado y preservar la viabilidad celular. Una vez que el tejido haya sido procesado completamente, utilice la hoja de bisturí para transferir los fragmentos a un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de tampón A frío e invierta el tubo de tres a cinco veces para sumergir completamente el tejido picado en la solución. Para disociar los fragmentos de tejido en una suspensión de células individuales, haga un pellet de las muestras mediante centrifugación.Descarte el sobrenadante. Luego, agregue lentamente un mililitro de solución de enzima fría y recién descongelada por la pared interna del microtubo. Utilice una pipeta con punta de diámetro grande para aspirar y dispensar inmediatamente la totalidad de cada pellet cuatro veces con el fin de dispersar los fragmentos de tejido picado.A continuación, invierta rápidamente el microtubo para evitar que los pellet se adhieran al fondo de los tubos e incube la muestra con mezcla de extremo a extremo durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Al finalizar la digestión, centrifugue nuevamente el tubo y agregue 0,6 mililitros del Buffer A frío a las células. Utilizando la misma punta de pipeta, aspire y dispense inmediatamente los pellet cinco veces.A continuación, seleccione una pipeta de vidrio de 1,3 milímetros y úsela para triturar suavemente las muestras 10 veces. Coloque la muestra en hielo durante dos minutos para permitir que los restos y las células no disociadas se sedimenten en el fondo del tubo. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros.A continuación, agregue 600 microlitros de solución del tampón A al pellet restante y utilice una pipeta de 0,8 milímetros de diámetro para triturar la muestra otras 10 veces. Después de permitir que los tejidos se sedimenten como se acaba de demostrar, reúna el sobrenadante con la primera suspensión celular y agregue otros 600 microlitros de tampón al pellet. Luego, utilice una pipeta de 0,4 milímetros para triturar la muestra y coloque el tubo en hielo durante dos minutos para permitir que los tejidos se sedimenten. Seguir los pasos de trituración mecánica en el protocolo es importante para un ordenamiento exitoso. Posteriormente, reúna el sobrenadante con las células disociadas. Luego, agregue 600 microlitros de tampón A a la muestra y repita la trituración con pipeta de 0,4 milímetros tres veces más.Coloque los tubos en hielo durante dos minutos para permitir que las células sedimenten. Luego, reúna el sobrenadante en un segundo tubo de 15 mililitros. Repita el proceso de trituración tres veces más, utilizando la pipeta de vidrio más pequeña, lo que aumenta significativamente el rendimiento de las células para la clasificación posterior.Después de haber recolectado todos los sobrenadantes, agregue 800 microlitros de etanol al 100% a 20 grados Celsius negativos a cuatro microtubos sobre hielo. Luego, transfiera 800 microlitros de células del primer tubo de sobrenadante recolectado a cada uno de los dos primeros tubos de etanol, y 800 microlitros de células del segundo tubo de sobrenadante a cada uno de los últimos dos tubos de etanol. Invierta los tubos para mezclar las muestras.Luego, coloque las muestras en hielo durante 15 minutos, mezclando mediante inversión cada cinco minutos. Al final de la incubación, centrifugue las células. A continuación, tocando únicamente la pared del microtubo, use una micropipeta para retirar lentamente todo el sobrenadante excepto los últimos 50 microlitros de cada uno.Filtre cada una de las dos suspensiones celulares por separado utilizando dos pares diferentes de filtros celulares. Luego, las células están listas para ser marcadas con anticuerpos contra los marcadores celulares de interés y clasificadas mediante citometría de flujo. El análisis de muestras de tejido cerebral fresco y congelado revela la presencia de pequeñas poblaciones homogéneas de células neuronales con un tamaño y granularidad similares.Las pequeñas poblaciones homogéneas pueden ser seleccionadas para excluir cualquier agregado celular, y las neuronas pueden identificarse por su positividad a NeuN y DAPI. Tanto en muestras de tejido fresco como congelado, los niveles de ARNm de NeuN también son significativamente mayores en las poblaciones positivas para NeuN que en las poblaciones negativas para NeuN. En contraste, los niveles de ARNm de los marcadores de células gliales y oligodendrocitos son mayores en la población negativa para NeuN que en la población positiva para NeuN.Se observa una tendencia similar de mayores niveles de ARNm del marcador de células microgliales en la población negativa para NeuN, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Además, los niveles de ARNm de Fos son mayores en las neuronas positivas para Fos que en las neuronas negativas para Fos, con un aumento de tres veces del ARNm de Fos en las neuronas positivas para Fos a partir de tejido fresco, y un aumento de once veces del ARNm de Fos en las neuronas positivas para Fos a partir de tejido congelado, lo que confirma la validez del método para identificar genes específicos de interés a partir de células ordenadas por flujo en condiciones tanto de tejido fresco como congelado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir los pasos críticos para prevenir la lisis celular.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la clasificación de células activadas por fluorescencia para aislar los subconjuntos celulares de interés y realizar análisis moleculares posteriores. El uso de tejido congelado permite que las muestras se clasifiquen en días diferentes, lo cual es fundamental para experimentos que implican procedimientos extensos y complejos de obtención y preparación de tejidos. Esta técnica también puede utilizarse para preparar muestras de cerebro humano postmortem congeladas, almacenadas durante varios meses o años, para su clasificación mediante citometría de flujo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los mecanismos moleculares subyacentes al comportamiento de neuronas que expresan Fos u otras células silvestres inmunomarcadas de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo disociar células a partir de tejido cerebral de rata fresco o congelado para la clasificación de células activada por fluorescencia de neuronas o tipos celulares de interés.

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Siguiendo un procedimiento optimizado para purificar la cresta neural, derivados progenitores neuronales a partir de tejidos fetales de ratón se ha descrito. Este método aprovecha de expresión de alelos reportero fluorescentes para aislar poblaciones discretas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La técnica se puede aplicar para aislar las subpoblaciones neuronales en todo el desarrollo o de tejidos adultos.

Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones

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Detección simultánea de c-Fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical Siguiendo Naive La ingestión de azúcar y grasa en ratas

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Aprende a disociar neuronas Fos-expresantes de tejido cerebral de rata fresco o congelado para análisis FACS. Este método permite aislar células neuronales específicas y estudiar neuroadaptaciones moleculares en neuronas activadas.

La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata (Video) | JoVE Journal

La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

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