La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

El objetivo general de este procedimiento es disociar las neuronas que expresan Fos del tejido cerebral de rata adulta fresco o congelado para la posterior clasificación de células activadas por fluorescencia, o FACS. Este método se puede utilizar para aislar células neuronales de interés para identificar la neuroadaptación molecular única de las neuronas activadas por el comportamiento. La principal ventaja de esta técnica es que permite el uso de tejido congelado, facilitando el aislamiento de células de múltiples áreas cerebrales en diferentes días.

Para procesar este tejido cerebral fresco, inserte dos o más hojas de afeitar preenfriadas en las ranuras de una matriz de corte de cerebro helada para cortar cortes coronales de uno a dos milímetros que contengan las regiones cerebrales de interés, colocando las secciones en una placa de vidrio enfriada a medida que se cortan. Primero, diseccione la región del cerebro de interés, descarte las otras áreas y elimine la materia blanca. Para congelar el tejido, transfiera las muestras a un microtubo y sumerja el tubo en isopentano a 40 grados centígrados negativos durante 20 segundos para almacenarlo a 80 grados centígrados bajo cero hasta su posterior procesamiento.

Para picar el tejido, deje que las muestras se descongelen en una placa de vidrio fría durante no más de un minuto antes de cubrir las muestras con una o dos gotas de solución tampón A. A continuación, sosteniendo una hoja de afeitar completamente vertical a la placa, pica el tejido 100 veces en cada dirección ortogonal. Para picar completamente el tejido, es fundamental mantener el tejido húmedo con el tampón A y seguir los tiempos y las instrucciones de picado especificados.

Es fundamental eliminar la mayor parte de la materia blanca durante la disección del tejido y mantener el tejido cubierto de tampón A para mejorar la eficiencia de la picadura y mantener la salud de las células. Cuando el tejido se haya procesado completamente, use la hoja de afeitar para transferir las piezas a un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de tampón A frío, e invierta el tubo de tres a cinco veces para sumergir todo el tejido picado en la solución. Para disociar los fragmentos de tejido en una suspensión unicelular, granule las muestras por centrifugación.

Deseche el sobrenadante. Luego, agregue lentamente un mililitro de solución enzimática fría y recién descongelada por la pared interna del microtubo. Y use una pipeta de gran diámetro de punta para aspirar y dispensar inmediatamente la totalidad de cada gránulo cuatro veces para dispersar los trozos de tejido picado.

A continuación, invierta rápidamente el microtubo para evitar que los gránulos se peguen al fondo del tubo e incube la muestra mezclándola de extremo a extremo durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la digestión, vuelva a centrifugar el tubo y añada 0,6 mililitros de tampón A frío a las células. Con la misma punta de pipeta, aspire y dispense inmediatamente los gránulos cinco veces.

A continuación, seleccione una pipeta de vidrio de 1,3 milímetros y utilícela para triturar suavemente las muestras 10 veces. Coloque la muestra en hielo durante dos minutos para permitir que los desechos y las células no disociadas se depositen en el fondo del tubo. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros.

A continuación, añada 600 microlitros de solución tampón A al pellet restante y utilice una pipeta de 0,8 milímetros de diámetro para triturar la muestra 10 veces más. Después de dejar que los tejidos se asienten como se acaba de demostrar, agrupe el sobrenadante con la primera suspensión celular y agregue otros 600 microlitros de tampón al pellet. A continuación, utilice una pipeta de 0,4 milímetros para triturar la muestra y coloque el tubo en hielo durante dos minutos para permitir que los tejidos se asienten.

Seguir los pasos de trituración mecánica del protocolo es importante para una clasificación exitosa. A continuación, agrupe el sobrenadante con las células disociadas. A continuación, añada 600 microlitros de tampón A a la muestra y repita la trituración con pipeta de 0,4 milímetros tres veces más.

Coloque los tubos en hielo durante dos minutos para permitir que las células se asienten. Y luego, agrupa el sobrenadante en un segundo tubo de 15 mililitros. Repetir el proceso de trituración tres veces más, utilizando la pipeta de vidrio más pequeña, aumenta significativamente el rendimiento de las celdas para su posterior clasificación.

Después de que se hayan recolectado todos los sobrenadantes, agregue 800 microlitros de etanol 100% negativo a 20 grados Celsius a cuatro mirotubos en hielo. Luego, transfiera 800 microlitros de células del primer tubo de sobrenadante recolectado a cada uno de los dos primeros tubos de etanol y 800 microlitros de células del segundo tubo de sobrenadante a cada uno de los dos últimos tubos de etanol. Invierta los tubos para mezclar las muestras.

Luego, coloque las muestras en hielo durante 15 minutos, mezclando por inversión cada cinco minutos. Al final de la incubación, centrifugar las células. Luego, tocando solo la pared del microtubo, use una micropipeta para eliminar lentamente todos los microlitros de cada sobrenadante, excepto los últimos 50.

Filtre cada una de las dos suspensiones celulares por separado usando dos pares diferentes de filtros celulares. A continuación, las células están listas para el marcaje con anticuerpos frente a los marcadores celulares de interés y la clasificación por citometría de flujo. El análisis de muestras de tejido cerebral fresco y congelado revela la presencia de pequeñas poblaciones homogéneas de células neuronales con un tamaño y granularidad similares.

Las pequeñas poblaciones homogéneas se pueden compuerta para excluir cualquier agregado celular, y las neuronas se pueden identificar por su positividad de NeuN y DAPI. Tanto en las muestras de tejido fresco como en las congeladas, los niveles de ARNm de NeuN también son significativamente mayores en las poblaciones positivas para NeuN que en las poblaciones negativas. Por el contrario, los niveles de ARNm de los marcadores celulares gliales y olidogodendrocitos son mayores en la población NeuN negativa que en la población NeuN positiva.

Se observa una tendencia similar de niveles más altos de ARNm de marcadores de células microgiales en la población NeuN negativa, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Además, los niveles de ARNm de Fos son mayores en las neuronas Fs positivas que en las neuronas negativas, con un aumento de tres veces del ARNm de Fos en las neuronas positivas de Fos de tejido fresco, y un aumento de once veces del ARNm de Fos en las neuronas positivas de Fos de tejido congelado, lo que confirma la validez del método para identificar genes específicos de interés a partir de células clasificadas por flujo tanto en condiciones de tejido fresco como congelado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir los pasos críticos de prevención de la lisis celular.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la clasificación de células activadas por fluorescencia, para aislar los subconjuntos de células de interés para su posterior análisis molecular. El uso de tejido congelado permite clasificar las muestras en días separados, lo que es fundamental para los experimentos que implican procedimientos largos y complicados de recolección y preparación de tejidos. Esta técnica también se puede utilizar para preparar muestras de cerebro humano congeladas post mortem almacenadas durante varios meses o años para su clasificación por citometría de flujo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los mecanismos moleculares que subyacen al comportamiento de las neuronas que expresan Fos u otras células de tipo salvaje inmunomarcadas de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo disociar células de tejido cerebral de rata fresco o congelado para la clasificación de células activadas por fluorescencia de neuronas o tipos de células de interés.