Name: Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a aislar células inmunes renales mediante centrifugación en gradiente de densidad para análisis por citometría de flujo multicolor. Este método eficiente permite obtener suspensiones celulares viables para estudiar funciones inmunológicas en enfermedades renales.

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Este trabajo está respaldado por una beca de investigación de Dialysis Clinics Inc. y de la beca de la Junta de Investigación de la Universidad de Missouri.

Todos los pasos del protocolo realizadas fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Missouri Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ACUC). Para este protocolo, se utilizaron ratones C57BL / 6 macho mayores de 15 semanas, aunque en teoría cualquier roedor a cualquier edad se puede utilizar para los experimentos. Puesto que, esta es una cirugía no la supervivencia, la eutanasia se consigue por desangrado y neumotórax bilateral. 1. La perfusión de los riñones Nota: La perfusión de órganos tales como corazón, hígado y riñón elimina la sangre que pueden interferir con la interpretación de los datos. Por lo tanto, si es posible, siempre perfundir los órganos. <ol><li> Coloque el ratón en un isoflurano (3 ml / min) cámara de inducción hasta que es inmóvil. A continuación, retire el ratón fuera de la cámara, dorsalmente ponerla sobre la mesa de disección y colocar el cono de isoflurano en la nariz del ratón y empuje isoflurano a razón de 1,5 ml / min a través del regulador. </li><li> Compruebe los respons dedo de arrastree con pinzas para evaluar si el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia. Limpiar el abdomen ventral con solución salina y cortar el abdomen con unas tijeras y empujar los órganos abdominales (fuera del campo quirúrgico) en el lado izquierdo del ratón. </li><li> Recoger la sangre de la vena cava inferior con un calibre 25-aguja fijo a una jeringa de 1 cc y añadirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 10 l de 0,5 M EDTA. Nota: La colección de sangre es opcional. El plasma puede ser usado para mediciones bioquímicas. Los leucocitos se pueden usar para ensayos de citometría de flujo. </li><li> Con unas tijeras, hacer un pequeño corte en la aurícula derecha para dejar salir la mezcla de sangre y PBS desde el siguiente paso. </li><li> Tome una jeringa de 50 cc y rellenar con helado de PBS (20-30 cc). A continuación, conecte una aguja 21-25 G a la jeringa, la punción del ventrículo izquierdo en su ápice (mientras se mantiene el corazón suavemente entre fórceps) y lentamente perfundir el ventrículo izquierdo con solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 (PBS) en el transcursode 1 a 2 min. Nota: El corazón blanquea inmediatamente después de los primeros mililitros de perfusión. Observar el hígado para escaldar, ya que esto indica que la perfusión está drenando la sangre desde el hígado a través del retorno venoso a través de la vena cava. Además, asegúrese de que los pulmones no se expanden durante la infusión ya que esto indica la punción del ventrículo derecho. Si los pulmones fueron a expandirse, retirar la aguja ligeramente hacia atrás en el ventrículo izquierdo y continuar la perfusión. El tiempo transcurrido desde la primera incisión hasta que se logra la eutanasia es menos de 2 minutos </li></ol> 2. La disección de los Riñones <ol><li> Después de la perfusión se ha completado, utilizar tijeras y pinzas para diseccionar el riñón derecho de sus adherencias (vasos sanguíneos, la grasa y las glándulas suprarrenales) y los impuestos especiales. </li><li> Retire con cuidado la cápsula que cubre el riñón por el corte y disección con una pinza. Pesar el riñón. Nota: Con un peso del riñón es opcional. Sin embargo, algunos experimentospuede resultar en cambios en el tamaño / peso que puede ser utilizado para normalizar el rendimiento de células por gramo de tejido renal. </li><li> Después de pesar el riñón, colocarlo en 1 ml de RPMI-1640 que contenía FBS al 0,5% o citometría de flujo solución tampón de tinción (50 ml tubo de tapón de rosca cónica) y colocar el tubo en hielo hasta su utilización posterior. Nota: Para facilitar la descripción, se describirá el resto del aislamiento de las células inmunes en la citometría de flujo solución de tampón de tinción. Además, vamos a describir el aislamiento de las células inmunes de un solo riñón, aunque ambos riñones o 1 + 1 / 3º de los riñones pueden ser utilizados en función de los experimentos posteriores (opcionales). 1/3 rd del riñón podría ser congelado para la proteína experimentos / ARN y 1/3 rd se puede colocar en tampones para microscopía inmunohistoquímica o la transmisión de electrones. </li></ol> 3. Homogeneización de Riñones <ol><li> Etiquetar una bolsa de homogeneización capacidad 5-80 ml con información de identificación de la muestra,quitar el embudo provisto en (STR) y desecharlo. Llene la bolsa con 5 ml de solución de tinción de citometría de flujo de tampón enfriado con hielo y transferir riñón a la memoria intermedia. Repita este proceso para una segunda muestra o más muestras que necesitan procesamiento. </li><li> Doble la bolsa homogeneización en medio, de manera que una media tiene el riñón sumergido en la solución de citometría de flujo de tinción Buffer y la otra mitad está simplemente plegada sobre ella. </li><li> Encienda el homogeneizador de tejidos y la puso a rpm rápida (ajuste). Coloque la bolsa plegada homogeneización con el riñón frente a la paleta, cerca del borde inferior, pero asegúrese de que el extremo inferior de las bolsas no se desliza por debajo del borde inferior de las paletas. <ol><li> Procesar la segunda muestra de forma simultánea, ya que hay 2 paletas. Seleccionar tiempo que 120 seg. Tenga en cuenta las paletas se mueven hacia atrás y hacia delante para homogeneizar los riñones. Nota: Mientras tanto, este tiempo de inactividad se puede utilizar para preparar 2 riñón más (o de otro tejido) muestras, mientras que las dos primeras están procesando. </li></ol&gt; </li><li> Después de terminar con el primer conjunto de homogeneización, transferir las bolsas de hielo y volver a cargar el homogeneizador de tejidos con el siguiente conjunto de muestras y así sucesivamente. Visualmente asegurar que los riñones son adecuadamente homogeneizada y no hay grandes trozos son visibles. Nota: En general, 2 min en el homogeneizador de tejidos en rpm rápido es adecuado para el riñón. </li><li> Colocar un filtro de células de 100 micras en el tubo cónico de 50 ml en hielo. A continuación, pipetear el homogeneizado completamente en el filtro de células. Establecer una centrífuga de suelo en 50 xg durante 1 min a 4 ° C y la carga de las muestras en la centrífuga. Nota: La centrifugación se asegurará de que todos los (las células que contienen homogeneizado) ha pasado a través del filtro de células. </li><li> Retire los tubos de la centrífuga y colocarlos de nuevo en hielo. Desechar los filtros celulares y mantener el homogeneizado. Añadir un volumen igual (~ 6 ml) de tampón de lisis 1x RBC al sedimento celular / sobrenadante y la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para hacer una suspensión celular uniforme. visuaLLY, observar algo del color rojo en la disminución de la suspensión inmediatamente. Dejar los tubos en hielo durante 5 min para lograr la máxima lisis RBC. Nota: la etapa de lisis de glóbulos rojos puede ser omitido si el investigador está convencido de la perfusión renal y se desea una menor manipulación celular. Hemos observado un aumento significativo en el rendimiento de células de riñón de no someter a la suspensión celular a RBC de lisis. </li><li> Girar los tubos en la centrífuga que se ha establecido a 500 xg, 4 ° C durante 5 min para formar un sedimento celular. Nota: Durante los pasos 3.6 y 3.7, se preparan para la sílice coloidal (Percoll) basado centrifugación en gradiente de densidad. <ol><li> Tomar 10 ml de polipropileno de fondo redondo tubos y etiquetarlos con el número de muestras correspondientes y colocarlas en un bastidor de tubo. Nota: A continuación se describe cómo hacer suficientes reactivos de gradiente de densidad para 4 muestras de riñón. </li><li> Tome 7 ml de solución tampón de tinción de citometría de flujo y la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1 ml de sacarosa 2 M apreparar 0,25 M de sacarosa. </li><li> A continuación, tomar 7,2 ml de reactivo de gradiente de densidad y la pipeta en otros 15 ml tubo cónico. Añadir 1,55 ml de solución tampón de tinción de citometría de flujo y 1,25 ml de sacarosa 2 M para preparar el 72% de reactivo gradiente de densidad y 0,25 M de sacarosa. </li><li> Pipetear 1 ml de reactivo de gradiente de densidad de 72% en un solo tubo redondo de polipropileno de fondo para cada muestra. </li></ol></li></ol> 4. centrifugación en gradiente <ol><li> Después del paso 3.7, llevará a cabo los tubos y suavemente se decanta el sobrenadante con un movimiento suave y decantar la siguiente gota de líquido que se forma mientras que el tubo está boca abajo. Nota: Este paso es importante, ya dejando atrás el exceso de líquido puede cambiar el gradiente de densidad suficiente como para crear una variación en los rendimientos. Cuando el tubo está situado detrás en posición vertical, ~ 200-300 l de líquido permanece en el sedimento celular. </li><li> Pipeta de 1 ml de 0,25 M de sacarosa en el sedimento celular y suavemente pero vigorosamente pipeta hacia arriba y hacia abajo para bring las células a una suspensión uniforme. A continuación, añadir la suspensión de células al reactivo de gradiente de densidad de 1 ml 72% (3.7.4) y una vez más la pipeta vigorosamente para mezclar las células para formar un reactivo en gradiente de densidad 36%. </li><li> Tomar 1 ml de reactivo de gradiente de densidad de 72% en una pipeta Pasteur de polipropileno (de transferencia). Con la presión incluso en el bulbo (mantiene la columna de líquido en la punta y evita la formación de burbujas), insertar la pipeta Pasteur a la parte inferior de la suspensión de células (reactivo de gradiente de densidad 36%) suavemente y descargar el reactivo de gradiente de densidad de 72% para formar una capa más pesada distinta. </li><li> Recoger los tubos de muestra ligeramente la placa y en la centrífuga, que es a temperatura ambiente durante este paso. Centrifugado durante 20-30 minutos a 500 x g. </li><li> Mientras tanto, preparar otros dos conjuntos de tubos de centrífuga de polipropileno redonda de fondo con los identificadores de muestra correspondientes. </li><li> Después del paso 4.4, retire la muestra que contiene tubos de polipropileno con suavidad, con agitación mínima y la pondráen la rejilla del tubo. </li><li> Recoger el primer tubo de muestra y su correspondiente tubo vacío. Con una pipeta Pasteur de polipropileno, suave pero completamente con succión medido, eliminar la &quot;capa de basura&quot; superior o &quot;materia pegajosa&quot; y ponerla en el tubo de centrífuga de fondo redondo vacío. <ol><li> Proceder de retirar la parte superior del gradiente hasta el &quot;capa leucocitaria&quot; se alcanza (puede aparecer de color blanquecino con un tinte rojizo [glóbulos rojos]). Detener la aspiración si una altura de ~ 3 mm se alcanza a partir de la &quot;capa leucocitaria&quot;. Nota: asegúrese de que esta materia ha desaparecido por completo de la parte superior de la pendiente antes de continuar con la succión. </li></ol></li><li> Tomar una pipeta Pasteur fresco y un tubo de centrífuga de fondo redondo, fresco y eliminar suavemente la capa leucocitaria. Continuar para succionar 3 - 5 mm por debajo de la capa leucocitaria, para asegurar que la mayoría de las células se recogen y se añadieron al tubo de fondo redondo de 2 nd nuevo con el identificador de muestra apropiado. </li><li> Añadir 1-2 ml de of solución de Citometría de Flujo La tinción de búfer al tubo 2º y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo. </li><li> Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Una etapa de lavado con solución 2º Citometría de Flujo La tinción de búfer es opcional. Volver a suspender en 500 l de solución tampón de tinción de citometría de flujo y procederán al recuento de células usando un hemocitómetro. </li></ol> 5. Opcional (marcado de la célula) <ol><li> Alícuota de cada muestra por el mismo número de células. Añadir el anticuerpo de bloqueo a una dilución de 0,5 g por 10 6 células (CD16 anti- / CD32 FcR) e incubar en hielo durante 15 min. </li><li> Añadir el cóctel deseada de anticuerpos primarios (conjugados con los diferentes fluoróforos) que están determinadas a trabajar bien con los demás por el investigador, antes de los experimentos reales. Incubar en hielo durante 30 min. Se lavan las células con PBS. Nota: Para la demostración de marcaje de las células inmunes del riñón de este manuscrito, se utilizó una T-lymphocyte y un panel de células macrófagos / dendrítica. El panel de linfocitos T consistió en corregible Viabilidad de la mancha FVS510, anti-CD45 (clon: 30-F11) BV421, anti-Foxp3 (Clon: FJK de 16 años) de APC, anti-CD127 (Clon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (clon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (clon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Clon: 53-6,7) BV785. El panel consistió en macrófagos corregible Viabilidad de la mancha FVS510, anti-CD45 (clon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clon: 1A8) FITC, anti-CD11b (Clon: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- APC, anti-CD11c (Clon: N418): F4 / 80 (BM8 Clon) BV785. </li><li> Añadir la corregible Viabilidad de la mancha y dejar actuar de sobremesa durante 5 minutos. Se lavan las células con solución de tinción de citometría de flujo tampón para eliminar el exceso de la viabilidad de la mancha corregible. </li><li> Añadir el reactivo de fijación / permeabilización e incubar durante la noche a 4 ºC. Lavar con solución de permeabilización. </li><li> Para tinción intracelular, bloquear de nuevo con anti-CD16 / 32 FcR durante 10 min. Añadir las manchas intracelulares e incubar durante 20-30 minutos. Lavar 2x en PErmeabilization solución. </li><li> Resuspender en muestras de solución y ejecutar Citometría de Flujo La tinción de búfer a través de la máquina de FACS 3,9. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos presentado aquí una metodología para obtener células inmunes desde el riñón de una manera fiable y eficiente. La principal modificación en la etapa de digestión de colagenasa ampliamente utilizado (disrupción mecánica de tejido) ahorra aproximadamente 30 min y el aislamiento de un gran número de células inmunes viables toma menos de dos horas para 4 muestras de riñón. Por otra parte, dependiendo de nuestra pregunta de investigación, que ahora sólo se utiliza un único riñón (el otro riñón se puede utilizar para el ...

Activación del sistema inmune se produce en múltiples enfermedades renales y procesos fisiopatológicos 6,10,11,13. Las posibles áreas de investigación activa abarcan los diversos factores desencadenantes de la activación del sistema inmune, varios tipos de células implicadas, el patrón de citoquinas / quimioquinas en un entorno enfermedad en particular, la modulación de todos los procesos antes mencionados por un medicamento en particular etc. Para ejemplificar, en la isquemia-reperfusión lesión (un modelo para la lesión renal aguda), hay un aumento en las células inmunes o derivadas de médula ósea las células hematopoyéticas o células CD45 + en unas pocas horas, que se mantiene durante todo el período de la reparación o fibrosis (6 semanas después) 5, 12. Estas células inmunes secretan ambas citocinas y quimiocinas proinflamatorias y antiinflamatorias para orquestar el proceso de reparación de 5,12. Actualmente, la capacidad de utilizar múltiples fluoróforos simultáneamente para etiquetar las poblaciones de células en una suspensión de células individuales se ha incrementado con el anuncioventilación de flujo moderna citometría de máquinas con cuatro a cinco láseres. Esto ha añadido sustancialmente a la capacidad de discriminar las poblaciones de células en función de su estado funcional 3,7. Por ejemplo, para etiquetar con precisión un macrófago como F4 / 80 bajo CD11b alto alto CD206 Ly6b baja, sería necesario al menos 3 más fluoróforos en el mismo volumen de muestra a la puerta de células vivas, CD45 + (leucocitos) y Ly6G- (neutrófilos) y esto es muy posible con la nueva citómetros de flujo 3. Sin embargo, los ensayos de aguas abajo para la secreción de citoquinas, la proliferación celular, la citotoxicidad, la activación de macrófagos y la cuantificación de números de varios subconjuntos de linfocitos y monocitos no sólo las necesidades de buena calidad (células vivas, singletes), pero un número adecuado de células. El sistema inmune en el riñón se compone de dos componentes de adaptación y innatas y múltiples tipos de células 1,7,13. Por ejemplo, en ratones a los dos niñoneys juntos se dice que contiene 2-17% (28,000-266,000) CD45 + células de las células inmunes total de riñón aislado (1,4 x 10 6 células) y alrededor de 5-15% (1,400-4,200) de éstas son las células CD4 + 1 , 5,12. Un pequeño porcentaje (5-15%, 70-630) de estas células CD4 + son FoxP3 + células (Figura 1) 1. Debido a estas reducciones paso prudente en porcentajes de células, a veces la población celular de interés (en este caso CD45 + CD4 + FoxP3 + células) está representada por un simple ~ 100 células. El pequeño número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + hace que sea imperativo que un gran número de células totales son aisladas y las células son de buena calidad para los estudios posteriores, como los ensayos de secreción de citoquinas. Por otra parte, puede ser necesario combinar riñones 2-3 ratones ya que las subpoblaciones no están representados en números suficientemente altas para llevar a cabo ensayos cuantificables. Por lo tanto, el aislamiento fiable y eficaz de las poblaciones de células mononucleares de riñón es deseable con el fin de tachonary el espectro inmunológica asociada con enfermedades renales. Tradicionalmente, para el aislamiento de células mononucleares de riñón, los investigadores han usado una variedad de digestiones enzimáticas tales como la colagenasa 1A o II incluyendo DNasa 1 1,5,12. Es bien sabido que las colagenasas tienen actividad enzimática que varía con los números de lote y por la compañía de fabricación, lo que exige de titulación para la concentración óptima y la duración de la incubación 4,14,15. Además, la digestión con colagenasa añade tiempo para picar el riñón en trozos pequeños, hace necesario la incubación de las piezas de riñón en un baño caliente (37 ° C) y tiempo adicional para la incubación en EDTA para parar la reacción. Además, menos esterilidad puede conseguirse, por algunos de los procedimientos aguas abajo que necesitan cultivo celular. Más importante aún, dependiendo del investigador y todas las variables implicadas, conduce a la variabilidad en los datos y la interpretación a través de los laboratorios. Recientemente, con ladesarrollo de tejido disruptores / homogeneizadores mecánicos 16, la etapa de digestión con colagenasa se ​​evita completamente y reemplazado por un simple rotura mecánica de los riñones 2. En este documento, se demuestra un método simple pero eficiente para el aislamiento de células inmunes del riñón para las extracciones de células inmunes de todos los días. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar a otros tejidos blandos y no fibrosos, tales como el hígado y el cerebro 16.

<table><tbody><tr><td>Sistema de laboratorio Stomacher 80 Biomaster</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Bolsas clásicas</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend XFR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo analítico</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno, sin tapa</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de viabilidad fijable BD</td><td>Biosciences&nbsp;</td><td>FVS510,&nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clon: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clon: 30-F11)&nbsp; BV421&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clon: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clon: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clon: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clon: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clon: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clon: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clon: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clon: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clon: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clon: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clon: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Filtro M&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubos 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos Fisherbrand 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia punta fina</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución tampón de tinción por citómetro de flujo</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Tampón de lisis RBC</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes



Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

La activación del sistema inmunológico ocurre en múltiples enfermedades renales y procesos fisiopatológicos. El sistema inmunitario consta de componentes adaptativos e innatos y de múltiples tipos de células. A veces, el tipo de célula de interés está presente en números muy bajos entre el gran número de células totales aisladas del riñón. Por lo tanto, el aislamiento confiable y eficiente de las poblaciones de células mononucleares renales es importante para estudiar los problemas inmunológicos asociados con las enfermedades renales. Tradicionalmente, el aislamiento tisular de las células mononucleares renales se ha realizado mediante digestiones enzimáticas utilizando diferentes variedades y concentraciones de colagenasas/ADNasas, lo que produce un número variable de células inmunitarias viables. Recientemente, con el desarrollo de los disruptores mecánicos de tejidos para el aislamiento de células individuales, se evita el paso de digestión de la colagenasa y se reemplaza por una simple interrupción mecánica de los riñones después de la extracción del ratón. Aquí, demostramos un método simple pero eficiente para el aislamiento de células mononucleares renales para las extracciones diarias de células inmunitarias. Además, demostramos un ejemplo de análisis de subconjuntos de células inmunitarias en el riñón. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar a otros tejidos blandos y no fibrosos como el hígado y el cerebro.

El número de paneles que se pueden ejecutar depende del número de células inmunes que se pueden extraer de forma fiable de los riñones. En este documento, se demuestra la capacidad de ejecutar 2 paneles, uno para los linfocitos T y uno de los macrófagos / células dendríticas. En el panel de linfocitos T, lo primero que mira en la dispersión frontal (FSC) y patrón de dispersión lateral (SSC) y delinear la población de interés, como se muestra en la Figura 1 (diagrama de p...

Se necesitan técnicas fiables y eficientes para el aislamiento de las células inmunitarias renales para aplicaciones posteriores. Esto requiere el marcaje de anticuerpos de superficie de una pequeña cantidad de células inmunitarias renales. En este artículo, describimos un método conciso para el aislamiento de células inmunitarias renales que aparentemente logra este objetivo.

Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

El objetivo general de este protocolo de aislamiento de células inmunitarias renales es extraer suspensiones celulares únicas viables de células inmunitarias renales en cantidades adecuadas para análisis posteriores mediante citometría de flujo multicolor. La principal ventaja de esta técnica, en comparación con la digestión con colagenasa, es la capacidad de aislar de forma fiable y económica un gran número de células inmunitarias renales para análisis experimentales posteriores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunobiología renal.Por ejemplo, qué subconjunto de células inmunitarias del riñón regula la secreción de citoquinas o quimioquinas en una enfermedad renal específica. Este método se demuestra para el aislamiento de las células inmunitarias del riñón. Sin embargo, puede adaptarse fácilmente para aislar las células de otros sistemas como el hígado o el cerebro.Hoy, demostraremos un procedimiento para recolectar células inmunitarias del riñón. Y el procedimiento será demostrado por Alex Meuth, un especialista en investigación de mi laboratorio. Después de confirmar la ausencia de respuesta al pellizco en el dedo del pie, use etanol al 70 % para limpiar el abdomen ventral de un ratón anestesiado.Luego, use tijeras para abrir la cavidad abdominal y refleje los órganos abdominales hacia el lado izquierdo del animal. Utilizando una jeringa de un cc equipada con una aguja doblada de calibre 25, recoja la sangre de la vena cava inferior en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que contenga 10 microlitros de EDTA potásico. A continuación, haga un pequeño corte en la aurícula derecha y use un par de pinzas para sujetar suavemente el corazón.Luego, inserte una aguja de calibre 21 a 25 conectada a una jeringa de 50 cc llena con 20 a 30 mililitros de PBS frío con hielo en el ventrículo izquierdo en su ápice, y perfunda lentamente el ventrículo durante uno o dos minutos. El corazón se volverá pálido tras los primeros mililitros de PBS. El blanqueamiento del hígado indica que la sangre está siendo expulsada a través del hígado mediante la circulación venosa a través de la vena cava.Una vez finalizada la perfusión, use tijeras y pinzas para diseccionar el riñón derecho de los vasos sanguíneos, la grasa y las glándulas adrenales adyacentes. Luego, retire suavemente la cápsula del riñón con pinzas y pese el riñón según lo requiera el experimento. A continuación, transfiera el riñón a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga un mililitro de tampón para citometría de flujo sobre hielo.Etiquete una bolsa de homogenización con capacidad de cinco a 80 mililitros con la información adecuada de identificación de la muestra y deseche el filtro interno. Llene la bolsa con cinco mililitros de tampón frío de tinción para citometría de flujo, y coloque el riñón dentro de la bolsa. Doble la bolsa de homogenización por la mitad, de modo que una mitad contenga el riñón sumergido en el tampón, y la otra mitad quede doblada sobre ella.Coloque la bolsa de homogenización doblada con el riñón orientado hacia la paleta cerca del borde inferior, teniendo cuidado de que el extremo inferior de la bolsa no se deslice por debajo del borde inferior de las paletas. Luego, verifique visualmente que los riñones estén adecuadamente homogenizados y que no sean visibles trozos grandes. Si los riñones no están suficientemente triturados por el instrumento, acerque las paletas más hacia la pared del homogenizador.Luego, coloque un filtro celular de 100 micrones en un tubo cónico individual de 50 mililitros por muestra sobre hielo, y filtre completamente los homogeneizados a través de los filtros. Cuando todas las muestras hayan sido disociadas, centrifugue los tubos con los filtros para asegurar que todos los tejidos sean filtrados completamente, y coloque los tubos nuevamente sobre hielo. A continuación, agregue un volumen igual de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada muestra, y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para obtener suspensiones celulares uniformes.Después de cinco minutos, centrifugar las células para formar un sedimento y desechar cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo de un solo movimiento, decantando la última gota de líquido que se forma mientras cada tubo aún está boca abajo. Para aislar las células inmunitarias del riñón, añadir un mililitro de reactivo de gradiente de densidad al 72 % en un tubo de polipropileno de fondo redondo por cada muestra. A continuación, triturar suave pero enérgicamente un mililitro de sacarosa 0,25 molar en cada sedimento para obtener suspensiones de células individuales, y añadir las células a las soluciones de gradiente de densidad.Luego, coloque suavemente un mililitro de reactivo de gradiente de densidad al 72 % debajo de cada suspensión celular para formar capas pesadas distintas. Confirme que las células renales estén suspendidas uniformemente en el gradiente de percoll al 36 % en cada tubo. A continuación, coloque cuidadosamente el percoll al 72 % debajo del percoll al 36 % para formar capas distintas al 36 y al 72 %.Coloque cuidadosamente los tubos en la centrífuga para la separación por gradiente de densidad. Luego, utilice una pipeta Pasteur de polipropileno para transferir suave pero completamente todos los estratos superiores de desecho, excepto aproximadamente los últimos tres milímetros, a tubos cónicos individuales vacíos. A continuación, use una pipeta Pasteur nueva para transferir suavemente las capas leucocitarias a tubos cónicos nuevos, hasta retirar entre tres y cinco milímetros por debajo de la capa leucocitaria, asegurando así que se hayan recolectado la mayor parte de las células de cada muestra.Luego, mezcle de uno a dos mililitros de tampón de tinción para citometría de flujo con las capas leucocitarias, y centrifugue las células. Re_suspenda los sedimentos en 500 microlitros de tampón de tinción para citometría de flujo para el recuento, y divida uniformemente las muestras en una placa de 96 pocillos, de fondo redondo y en oscuridad. Incube las muestras con anticuerpo bloqueante durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Luego, prepare un cóctel de anticuerpos para cada tipo de célula inmunitaria que se vaya a analizar. Por ejemplo, linfocitos, macrófagos y células dendríticas, e incube las células en el cóctel de anticuerpos adecuado durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de seleccionar la población de interés mediante dispersión directa y lateral, excluya las células no viables.De dos a 18 % de las células inmunitarias totales del riñón expresan típicamente CD45. Para aislar las células T efectoras y citotóxicas, por ejemplo, estas células hematopoyéticas derivadas de la médula ósea pueden ser seleccionadas mediante CD4 y CD8, respectivamente. La caracterización adicional de las células positivas para CD4 revela una población de aproximadamente entre ocho y 14 % de células T reguladoras positivas para FoxP3, que pueden subdividirse en poblaciones que expresan CD44 y CD127.Para evaluar el panel de células mieloides, las células positivas para CD45 pueden seleccionarse según su expresión de Ly6G para excluir primero los neutrófilos. Luego, CD11b y F4/80 pueden utilizarse para subdividir aún más las células positivas para Ly6C en las poblaciones de macrófagos infiltrantes y células dendríticas. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una a dos horas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar experimentos posteriores, como el aislamiento de células positivas para CD11b o CD4, para responder preguntas sobre la secreción de citoquinas por este subconjunto específico de células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo perfundir los riñones, generar una suspensión viable de células renales, aislar células inmunitarias renales mediante centrifugación en gradiente de densidad y etiquetar las células renales para análisis citométrico por flujo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, describimos el procedimiento para la extracción de riñón del espacio retroperitoneal del ratón. El riñón extraído se puede microdiseccionar para obtener un riñón intacto sin una cápsula renal y la capa de grasa circundante.

Extracción de riñón intacto de ratón: una técnica para obtener riñón sin cápsula renal a partir de modelos murinos

Células DNabT son raros entre las células T periféricas; sin embargo, que son abundantes en ciertos tejidos no linfoides. Dificultad de aislar las células T DN de tejidos no linfoides dificulta su análisis funcional a pesar del aumento reconocida importancia fisiopatológica. Se describe un nuevo protocolo para el aislamiento de células DN T altamente purificadas de riñón murino.

Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón

Este protocolo describe la descelularización de riñones de rata Sprague Dawley mediante perfusión anterógrada de detergentes a través de la vasculatura, produciendo matrices extracelulares renales acelulares que sirven como molde para la repoblación con células epiteliales renales humanas. La recelularización y el uso del ensayo de perfusión de resazurina para monitorear el crecimiento se realizan dentro de biorreactores de perfusión especialmente diseñados.

La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal

Aquí presentamos un método de aislamiento y de la cultura de grado clínico novela para riñón células estromales perivasculares (kPSCs) basado en perfusión de órgano entero con enzimas digestivas y células NG2 enriquecimiento. Con este método, es posible adquirir un número suficiente de células para terapia celular.

Un método de aislamiento de grado clínico novedoso para Stromal células de riñón humano perivasculares

El objetivo principal de este protocolo es eficaz aislar culturas viables glomérulos primarios con contaminantes mínimos para el uso en una variedad de aplicaciones posteriores. Los glomérulos aislados mantienen relaciones estructurales entre los tipos de componentes de la célula y pueden ser cultivadas ex vivo para un a corto plazo.

Un método eficiente de tamizado para aislar intactos glomérulos del riñón de rata adulta

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.

Detección de la expresión de microARN en los riñones de ratones nefropáticos de inmunoglobulina A

Después de la infección viral, el riñón alberga un número relativamente grande de células CD8+ T y ofrece la oportunidad de estudiar las células TRM no mucosas. Aquí, describimos un protocolo para aislar linfocitos renales de ratón para el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de alta calidad de riñones de ratones congelados que mejoran la representación de los tipos de células renales medulares y evitan los artefactos de expresión génica de la disociación enzimática del tejido.

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

Aquí se presenta un protocolo para la ablación selectiva de macrófagos renales con el fin de estudiar su regeneración utilizando la herramienta de ablación celular CD59/intermedilisina humana. Este método también es aplicable para estudiar la función y la regeneración de las otras poblaciones celulares en el riñón, el hígado y el tejido graso.

Agotamiento rápido de macrófagos renales utilizando la herramienta de ablación celular humana CD59/Intermedilysin

Este estudio desarrolló un protocolo optimizado para el aislamiento de células mesangiales murinas (MCs) y su cultivo celular ex vivo . Estas células pueden pasar varias veces, congelarse, revivirse y cultivarse sin comprometer el crecimiento celular o la expresión de proteínas.

Optimización del aislamiento y la purificación de las células mesangiales glomerulares murinas

Aprende a aislar células inmunes renales mediante centrifugación en gradiente de densidad para análisis por citometría de flujo multicolor. Este método eficiente permite obtener suspensiones celulares viables para estudiar funciones inmunológicas en enfermedades renales.

Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes

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