Name: De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprende a identificar polímeros sintéticos que reducen la adherencia bacteriana en dispositivos médicos mediante microarrays de alto rendimiento. Este método permite evaluar cientos de polímeros simultáneamente, acelerando el descubrimiento de biomateriales efectivos.

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Los autores agradecen a EASTBIO (la Asociación de Formación Doctoral en Biociencias del Este de Escocia financiada por el BBSRC) (S. V.) y al Consejo de Investigación Médica (P.J.G) por su financiación.

<ol><li>Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Polymer+Microarrays%3A+Identifying+Synthetic+Polymers+that+Control+Human+Embryonic+Stem+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mat%22%5BJournal%5D)">High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth.</a> Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).</li>
<li>Tourniaire, G., Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+microarrays+for+cellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Polymer microarrays for cellular adhesion.</a> Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).</li>
<li>Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonising+new+frontiers-microarrays+reveal+biofilm+modulating+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers.</a> J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functionala+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).</li>
<li>Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+synthesis+of+arrayed+biomaterials+and+application+to+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).</li>
<li>Venkateswaran, S., Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+repelling+poly%28methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide%29+coatings+for+biomedical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices.</a> J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).</li>
<li>Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Giardia+lamblia+Interactions+with+Polymer+Surfaces+Using+a+Microarray+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.l+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach.</a> Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).</li>
<li>Mizomoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Synthesis+and+Screening+of+Polymer+Libraries+using+a+High+Throughput+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach.</a> , (2004).</li>
<li>How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyplexes+and+lipoplexes+for+mammalian+gene+delivery%3A+from+traditional+to+microarray+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening.</a> Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).</li>
<li>Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Evaluation+of+the+Wettability+of+Polymer+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries.</a> Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).</li>
<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+in+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts in biofilm infections.</a> Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister Cells.</a> Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).</li>
<li>Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+Displays+Multiple+Phenotypes+during+Development+as+a+Biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm.</a> J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).</li>
<li>Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+Escherichia+coli+K-12+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).</li>
<li>Watnick, P. I., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+the+development+of+a+Vibrio+cholerae+El+Tor+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm.</a> Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).</li>
<li>Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+biomaterials+technologies+for+infection-resistant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).</li>
<li>Imstar. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathfinder+Technology+for+High+Content+Cellular+Screening+in+Cell+Biology+and+Genetoxicity+Software+version%3A+6.04I%22">Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I</a>. , (2012).</li>
<li>Williams, J. R., Clifford, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+JR+%22Supercritical+Fluid+Methods+and+Protocols%22">Supercritical Fluid Methods and Protocols</a>. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).</li>
<li>Kuo, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuo%2C+J+%22Electron+microscopy+methods+and+protocols%22">Electron microscopy methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li>Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioinspired+omniphobic+surface+coating+on+medical+devices+prevents+thrombosis+and+biofouling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling.</a> Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).</li>
<li>Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+screening+anti-infective+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A new method for screening anti-infective biomaterials.</a> Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).</li>
<li>May, R. M., Magin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+micropattern+to+reduce+bacterial+colonization%2C+platelet+adhesion+and+fibrin+sheath+formation+for+improved+biocompatibility+of+central+venous+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters.</a> Clin. Transl. Med. 4, (2015).</li>
<li>Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptide+melimine+coating+for+titanium+and+its+in+vivo+antibacterial+activity+in+rodent+subcutaneous+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models.</a> Biomaterials. 85, 142-151 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que declarar.

La unión de las bacterias a una superficie es un proceso complejo determinado por una amplia gama de factores dependientes de las especies bacterianas, las propiedades de la superficie, el medio circundante y el medio ambiente físico. Aunque ciertos grupos químicos son conocidos por afectar a la unión de bacterias (poliglicoles, por ejemplo, típicamente resistir fijación 11), la correlación de los efectos biológicos de los polímeros con sus estructuras químicas, es difícil, por lo que el diseño racional de los polímeros para funciones específicas desafiantes. En ausencia de mecanismos detallados de fijación, otros estudios han tratado de imitar origen natural superficies repelentes, con largo y extenso optimización de procesos 21. El método de alto rendimiento miniaturizado que aquí se presenta supera estos retos mediante la facilitación de la detección paralela de cientos de polímeros para identificar clientes potenciales para su posterior estudio. Los resultados del método de microarray sirven principalmente para identify candidatos probables de plomo. La figura 2 ilustra 22 candidatos con baja unión de al menos una especie, mientras que la Figura 3 muestra la clara reducción de la capacidad de unión. Los 22 polímeros de unión bajas que se muestran en la Figura 2 se tomaron hacia adelante en experimentos a escala de arriba, durante los cuales el mejor (en términos de propiedades de repelencia y revestimiento) se determinó que eran PU83, PA13 y PA515 (Figuras 4 y 5). Los poliacrilatos ofrecen una mayor flexibilidad en términos de métodos de polimerización y por lo que el poliacrilato más bajo de unión, PA13, se escogió para estudios de revestimiento catéter (Figuras 6 y 7). Más trabajo más detallado sobre otros candidatos se llevó a cabo y se ha informado en otras partes 6. A través de una serie de iteraciones experimentales encontramos una serie de medidas de menor importancia fueron la clave para el éxito y la reproducibilidad. Además de facilitar la adhesión de lapolímeros a los portaobjetos de vidrio, utilizando un agarosa bajo-recubrimiento proporciona un fondo limpio, como agarosa es altamente resistente a la colonización bacteriana. De la misma manera la consistencia en el polímero de spots de sí mismos, tanto dentro de la misma matriz y entre las matrices, es vital y, por tanto, la impresión de las matrices debe ser controlada cuidadosamente. Se requiere un cuidadoso ajuste de los pernos en el cabezal de impresión y el relleno también uniforme de la placa de 384 pocillos para asegurar manchado uniforme. Como algunos de los polímeros que utilizamos exhibido un grado de autofluorescencia, tomando datos de fluorescencia de fondo para cada diapositiva antes de la incubación con bacterias era vital. Para dar cuenta de las variaciones y obtener Se aconseja a los robustos réplicas de datos de microarrays. La mancha empleado aquí (DAPI) no tiene selectividad para las especies bacterianas, de unión no específica al ADN. Por lo tanto, una buena técnica aséptica es esencial una vez que se introducen cultivos bacterianos como contaminantes pueden pasar desapercibidos, confundiendo la interpretación de los resultados. Lo mismo es cierto de posteriores experimentos utilizando microscopía electrónica de barrido, donde sólo es posible distinguir bacilos y cocos, pero no género o especie. Después de la selección de microarrays, polímeros prometedores deben ser elegidos para su posterior validación. En el ejemplo que aquí se presenta, siete polímeros de interés se identificaron por su clara reducción en la fluorescencia en el microarray y su inhibición de la unión se confirmó mediante el recubrimiento en superficies más grandes. Las Figuras 4 y 5 muestran la reducción en la unión logrado en cubreobjetos de vidrio, una medios prácticos para poner a prueba el comportamiento de los polímeros en forma de revestimientos a granel en lugar de en forma de manchas de microarrays. Posteriormente, estos polímeros se recubrieron sobre productos sanitarios para cuantificar plenamente la reducción en la adhesión bacteriana. Es importante que el disolvente elegido (véase la sección 8 de protocolo) para estos estudios de revestimiento es benigno al sustrato deseado (aquí, el catéter), mientras que retenering capacidad de disolver el polímero de interés, a fin de permitir revestimiento. Aquí, se utilizó acetona que, además de las propiedades mencionadas, tiene un bajo punto de ebullición y se evapora rápidamente para dejar un recubrimiento uniforme. Los medios de validación elegido dependerá de la aplicación específica que se estudian. Como observación de las células por microscopía electrónica y de fluorescencia permite la cuantificación directa de la unión celular individual, elegimos estas técnicas como un complemento a la ensayo de tinción de microarrays granel. Los resultados se muestran en las figuras 6 y 7, que demuestran la importancia de los métodos de validación gratuitos. Las imágenes confocales de la Figura 6 proporcionar imágenes muy claras de las células individuales, mientras que el SEM tiene el beneficio añadido de permitir una evaluación de la superficie del polímero, que es aquí suave y uniforme. Estos métodos están limitados por el campo de visión de los microscopios utilizados, y por lo tanto es important a tomar una serie de fotografías que tener confianza en los resultados. El método descrito anteriormente no puede cuantificar la adherencia bacteriana sobre toda la superficie, solamente inferir la cobertura de un número de pequeñas regiones. Creemos que esto es suficiente para la aplicación descrita. Reducción en la unión bacteriana se pudo evaluar mediante la enumeración de bacterias adheridas de la superficie sobre toda las piezas de catéteres con y sin recubrimiento, utilizando métodos como se describe en otra parte 22. Sin embargo, tales métodos requieren las superficies de biomateriales seleccionados para tener un área superficial uniforme, que es difícil de mantener cuando los ensayos se realizan con dispositivos médicos, que a menudo tienen geometría compleja. Claramente, cualquier producto destinado para su uso clínico tiene que pasar por la prueba más importante para garantizar la seguridad y la eficacia en seres humanos. El método presentado aquí representa el comienzo de este proceso y más trabajo debe incluir la confirmación de la actividad in vivo. En este caso, el estudio de c venosaatheters, el trabajo inicial podría investigar la unión de componentes sanguíneos y células enteras al polímero. El efecto de los componentes sanguíneos en la unión bacteriana también se debe considerar, posiblemente mediante la repetición de los ensayos de unión en presencia de suero inactivado o sangre fibrinated de-23. La prueba definitiva de la tecnología estará en un modelo in vivo, tal como un modelo de infección implante subcutáneo 24. Se demuestra el potencial del método para la detección de microarrays de polímero de polímeros que alteran la superficie. Tales polímeros (ambos resistentes y promueven la unión de bacterias) tienen un gran número de aplicaciones en la medicina, la industria alimentaria y la biotecnología, es decir, este método puede ser útil en muchas áreas de investigación. Aunque los trabajos aquí utiliza bacterias, el método podría adaptarse a otros tipos de células y del mismo modo otros microarrays químicos.

<html> Microarrays de polímero son miniaturizados plataformas de alto rendimiento en el que hasta 7.000 polímeros 1 se imprimen en portaobjetos de vidrio para el análisis paralelo con células procariotas o eucariotas 2. El método que aquí se presenta se basa en lo que hemos descrito por primera vez en 2010 3. Este sistema de selección se ha aplicado a numerosos tipos de células incluyendo los hepatocitos humanos 4, las células madre 5, células epiteliales tubulares renales 2, bacterias y protozoos patógenos 3,6 7. En cada caso, los polímeros que promueven o se resisten a la unión de las células bajo estudio se identificaron 8. Los complejos de DNA con polímeros policatiónicos sintéticos también se han utilizado en el formato de microarray para cribado de alto rendimiento de los candidatos de genes de transfección 9. Además de la detección de las interacciones célula-sustrato, microarrays de polímeros también se han utilizado para evaluar las propiedades del material 10. &quot;&gt; La capacidad de los polímeros sintéticos para modular la unión de las bacterias a una superficie está bien establecido 3,6,11. Numerosos factores, incluyendo carga, hidrofobicidad y rugosidad de la superficie de la superficie del polímero se sabe que afectan. Los enfoques convencionales de unión bacteriana de biomateriales descubriendo que resisten la unión de las bacterias a través secuencial o empíricamente diseñar y probar un material a la vez son de trabajo intensivo, costoso y procesos que consume tiempo. microarrays de polímero ofrecen una alternativa atractiva para eludir tales limitaciones. bacterias de superficie asociados crecen como una población compleja denomina un biofilm - tales biopelículas son altamente resistentes a muchas tensiones ambientales y antibióticos. Esto es en parte debido a su matriz extracelular densa (compuesto por proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos) 12 y en parte debido a la mayor presencia de células robustas &quot;persistor&quot; en biofilms 13. Althouf los mecanismos precisos de la asociación de la superficie y la posterior formación de biopelículas son difíciles de caracterizar, en general se cree que hay tres etapas diferentes de crecimiento de la superficie 14 - 16. , Fijación reversible inicial es seguida por una adherencia más fuerte de las células, el establecimiento de una biopelícula por la producción de una proteína extracelular y la matriz de polisacárido y la proliferación celular. Por último, las emisiones de biopelículas maduras, las células planctónicas que pueden iniciar nuevas infecciones en otras partes de vida libre. polímeros que impiden la unión inicial de las bacterias, y por lo tanto impiden que las primeras etapas de la formación de biopelículas de bacterias repelente, potencialmente representar una solución excelente para minimizar infecciones. Dado el aumento de resistencia a los antibióticos (y también la intrínsecamente mayor resistencia de las bacterias asociadas a la superficie 12), medios libres de antibióticos de la reducción de infecciones son de particular interés. En un entorno hospitalario, el polímero que repele bacteriasrevestimientos pueden tener una aplicación médica directa en la reducción de las infecciones nosocomiales, que comúnmente se forman dispositivos implantados alrededor de 17. Aquí, un método de alto rendimiento para el cribado de 381 polímeros para la actividad repelente contra una gama de bacterias patógenas asociadas con las infecciones nosocomiales, seguido de validación de golpe y posterior recubrimiento y dosificación de los materiales del catéter venoso central, se describe (Figura 1). En pocas palabras, los polímeros fueron vistos en portaobjetos de vidrio de agarosa recubiertas de por impresión por contacto y, después del secado y esterilización, las matrices miniaturizados se incubaron con cultivos bacterianos clínicamente importantes. Después de la incubación, los microarrays se lavaron suavemente y las células bacterianas adherentes se tiñeron y se visualizaron por fluorescencia. Posteriormente, polímeros que inhiben la unión bacteriana se investigaron en una escala más grande por recubrimiento sobre cubreobjetos de vidrio y se visualizaron mediante microscopía electrónica. repelen seleccionadopolímeros prestado se revistieron después en catéteres comerciales y se muestran para reducir la unión de bacterias por casi 100 veces.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>05066&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de preparación de silano</td><td>Sigma</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>Polímeros</td><td>Sintetizados internamente</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>NMP</td><td>Sigma</td><td>494496</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Caldo Oxoid</td><td>CM1018</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>(3- aminopropilo) portaobjetos de vidrio recubierto de trietoxisilano Sigma</td><td></td><td>Preparación</td><td></td>para silano</tr><tr><td>Tampón de cacodilato</td><td>Sigma</td><td>97068</td><td></td></tr><tr><td>Catéter 1</td><td>Arrow International</td><td>Catéter de CS12123E</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>Baxter Healthcare</td><td>ECS1320</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Sigma</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impresora de contacto</td><td>Genetix</td><td>Qarraymini</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Microarray IMSTAR</td><td>Pathfinder</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Speedline Technologies</td><td>6708D</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Media Cybernetics</td><td>Image-Pro Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Philips</td><td>XL30CP</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento por pulverización catódica</td><td>Bal-Tec</td><td>SCD050</td><td></td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Los dispositivos médicos a menudo se asocian con infecciones adquiridas en el hospital, lo que ejerce una enorme presión sobre los pacientes y el sistema de salud, además de contribuir a la resistencia a los antimicrobianos. Una posible vía para la reducción de las infecciones asociadas a los dispositivos es la identificación de recubrimientos poliméricos repelentes de bacterias para estos dispositivos, lo que evitaría la unión de bacterias en el paso inicial de fijación. Aquí se describe un método para la identificación de dichos polímeros repelentes, basado en el cribado paralelo de cientos de polímeros utilizando un microarray. Este método de alto rendimiento dio como resultado la identificación de una gama de polímeros prometedores que resistían la unión de varias especies bacterianas clínicamente relevantes individualmente y también como comunidades de múltiples especies. Un polímero, PA13 (poli(metilmetacrilato-co-dimetilacrilamida)), demostró una reducción significativa en la adhesión de varios aislados hospitalarios cuando se recubrió en dos catéteres venosos centrales disponibles en el mercado. El método descrito podría aplicarse para identificar polímeros para una amplia gama de aplicaciones en las que la modificación de la unión bacteriana es importante.

La Figura 2 muestra la unión bacteriana (intensidad de fluorescencia normalizada) a un número de polímeros según lo determinado por análisis de microarrays. Manchas impresas sin polímero (NMP solamente) son el control negativo, como agarosa resiste fuertemente la unión bacteriana 6 - fluorescencia grabado es muy bajo. Los polímeros que se muestran son de baja unión a pesar de que en la mayoría de los casos, las propiedades repelentes de un polímero varía significativamente entre las especies bacterianas probadas. Esto refleja las grandes diferencias entre los mecanismos de fijación a través de diferentes especies. La selección de un polímero apropiado depende, por tanto, sobre la aplicación, pero los polímeros de unión a bajas son fácilmente identificados por comparación con la agarosa. polímeros de alto de unión son susceptibles de ser identificado en una matriz, y se pueden utilizar como controles positivos para experimentos posteriores. Para los polímeros que no muestran autofluorescencia en el canal de DAPI, co cualitativamparison de las imágenes in situ se puede hacer visualmente (como se muestra en la Figura 3, destacando un polímero de alto representante de unión y tres ejemplo, polímeros de baja unión). Tal comparación, mientras que proporciona menos información que el análisis estadístico, puede ser una validación visual útil de los valores de intensidad calculados. Con 22 polímeros adecuados identificaron utilizando el microarray, experimentos a escala de arriba se llevan a cabo para confirmar su propiedad bacterias repelente cuando se utiliza para el recubrimiento de superficies más grandes. Se muestran los ejemplos de mejor desempeño, utilizados para cubrir las caídas de vidrio escudo (analizadas por SEM (Figuras 4 y 5)) y rodajas de catéter (analizadas por microscopía confocal (Figura 6) y SEM (Figura 7)). Ambos métodos microscópicos tienen la ventaja de permitir que los recuentos de células directos en la superficie, proporcionando datos inequívoca; reducción de la unión de las células es fácilmente visiblmi. Esos revestimientos que mejor conservan sus propiedades repelentes en la escala de arriba, además de ser susceptible de técnicas de recubrimiento a gran escala, se investigaron más. Los resultados mostrados ilustran los polímeros con mejores resultados de cada etapa. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig1.jpg" /> Figura 1: SEM = microscopio electrónico de barrido pasos implicados en la identificación de los polímeros repelentes de bacterias a través de microarrays de polímero para aplicaciones biomédicas.. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig2.jpg" /> Figura 2:. Bacteriana de unión en una serie de polímeros, determinado por el análisis de microarrays de baja unión bacteriana se ve en una serie de poliacrilatos / acrilamidas (PA) y poliuretanos (PU). Los resultados de los microarrays de polímero sondaron con varios s bacterianas<html> se muestran; pecies (BacMix-1 y BacMix-2 C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, y dos consorcios). La unión bacteriana expresa como corrección de fondo media DAPI intensidad de fluorescencia (normalizado). Las barras de error representan la desviación estándar. Adaptado de referencia 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig3.jpg" /> Figura 3:. Imágenes de ejemplo de puntos de polímero de fluorescencia (DAPI) y microscopía de campo claro imágenes de BacMix-2 que muestran la adhesión bacteriana en polímeros representativos. Un polímero con fuerza vinculante se incluye para la comparación de varios polímeros no vinculantes (PU-20, PA-336 y Pu-179). Barra de escala = 100 micras. Adaptado de referencia 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig4.jpg" /> Figura 4: experimentos a escala de arriba con cubreobjetos de vidrio imágenes de SEM que muestran la adhesión bacteriana sobre el vidrio revestido y vidrio recubierto con polímeros &#39;hit&#39; (ejemplos seleccionados de la Tabla 1).. Barras de escala = 20 m. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig5.jpg" /> Figura 5:. La unión bacteriana cuantificó por recuento de células a partir de imágenes de SEM Comparación de células unidas por unidad de superficie de las superficies recubiertas con los mejores polímeros &#39;hit&#39;. La agarosa se utilizó como superficie &#39;no vinculante&#39; un control, con el vidrio como una superficie de unión de control. Las barras de error representandesviación estándar. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig6.jpg" /> Figura 6: Comparación de la unión bacteriana en rodajas catéter recubierto y sin recubrir imágenes confocales que comparan catéter sin tratar (cath-1) (A) y el catéter recubierto con PA13 (B) después de la incubación con BacMix-2.. Las imágenes tomadas con un objetivo de 40X (Barra de escala = 20 micras). Adaptado de referencia 6. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig7.jpg" /> Figura 7:. Comparación de la unión bacteriana en rodajas catéter recubierto y sin recubrir imágenes de SEM muestran la comparación de catéter sin tratar (cath-1) (A) y el catéter recubierto con PA13 (B) después de la incubación con un cóctel de bacterias que consiste en BacMix-2 Scale. bares = 101; m. Adaptado de referencia 6. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Polímero </td><td> monómero 1 </td><td> monómero 2 </td><td> monómero 3 </td><td colspan="3"> Relación de monómeros </td></tr><tr><td> PA465 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> HEA </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA475 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> MiSAmA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA513 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> MMA </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA515 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> MMA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA13 </td><td&gt; MMA </td><td> DMAA </td><td> - </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> PE1 </td><td> PEG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU16 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU161 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU7 </td><td> PEG900 </td><td> BICH </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU83 </td><td> PEG900 </td><td> HMDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU227 </td><td> PPG-PEG-1900 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU129</td><td> PPG425 </td><td> BICH </td><td> DMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU10 </td><td> PTMG2000 </td><td> BICH </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU179 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> NMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU20 </td><td> PTMG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU5 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Composición de las bacterias no vinculantes &#39;golpeado&#39; polímeros en la Figura 2.

Se describe un método de microarrays de alto rendimiento para la identificación de polímeros que reducen la unión de la superficie bacteriana en dispositivos médicos.

De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

El objetivo general de esta técnica de microarreglo de polímeros es identificar polímeros sintéticos capaces de modular la adhesión de bacterias a superficies abióticas. Este método puede ayudar a acelerar el progreso en el descubrimiento de biomateriales sencillos y rentables que inhiban la adhesión bacteriana a dispositivos médicos. La principal ventaja de esta técnica en comparación con la investigación convencional de biomateriales, que prueba un material a la vez, es su capacidad para analizar cientos de polímeros simultáneamente en una sola prueba.Para comenzar, prepare soluciones poliméricas y añádalas a los pocillos de una placa de 384 pocillos, según el protocolo descrito. Cree una rutina para imprimir los polímeros en cuadruplicado, consistente en 1536 puntos, dispuestos en 48 filas y 32 columnas, imprimiendo 32 soluciones poliméricas a la vez, de modo que la impresora pueda detenerse tras imprimir cada sección para permitir la limpieza de las puntas. Ahora coloque las láminas recubiertas con agarosa sobre la plataforma y asegure un buen sellado al vacío para mantener las láminas en posición.Para ajustar la cabeza de impresión de modo que todos los pasadores estén a la misma altura, baje manualmente la cabeza sobre una lámina de vidrio y confirme que los pasadores se muevan hacia arriba al mismo tiempo. Coloque la placa de pocillos en el soporte de placas con el pocillo A1 en la esquina superior derecha del soporte y asegúrese de que la placa de pocillos esté firmemente fijada. Confirme que la lámina y la placa de pocillos estén en posición cuando se le solicite.Imprima una sección a la vez, permitiendo la limpieza de los pinchos entre secciones. Luego, use una toalla de papel sumergida en acetona para limpiar los pinchos completamente. A continuación, utilice papel de tissue seco para asegurarse de que los pinchos estén totalmente secos.Una vez que las micromatrices estén completamente impresas, colóquelas en un portaportaobjetos y transfiéralas a un horno de vacío ajustado a 40 grados celsius para secarlas y eliminar el N&P en los puntos de polímero. Luego, utilice luz UV para esterilizar las placas durante 30 minutos. Antes de inocular las laminillas con bacterias, tome una medición de la fluorescencia de fondo según el protocolo descrito en el texto.Después de cultivar y preparar los inóculos para los microarreglos, según el protocolo descrito, coloque los microarreglos poliméricos esterilizados con luz UV en placas rectangulares de cuatro pocillos y agregue seis mililitros de cultivos bacterianos mixtos. Incube las placas a 37 grados Celsius con agitación suave durante cinco días. Después de la incubación, use PBS para enjuagar suavemente los microarreglos dos veces.Luego, agregue un microgramo por mililitro de DAPI en PBS e incube durante 30 minutos. A continuación, transfiera los microarreglos a una placa fresca de cuatro pocillos, cubra los microarreglos con PBS y luego agite suavemente. Después, cambie el PBS una vez y repita el lavado.Después de enjuagar, seque los microarreglos bajo un flujo de aire, luego aplique una película selladora y fije cubreobjetos de vidrio a las laminillas de microarreglo. Cuando el pegamento esté seco, use etanol al 70 % para esterilizar la superficie externa. Utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 20x, capture una imagen individual para cada punto de polímero en los canales de campo brillante y estrápico.Para recubrir láminas con polímeros, prepare soluciones de polímeros HIT en tetrahidrofuran o un disolvente adecuado. Utilizando un espinador, aplique por centrifugación láminas de vidrio circulares de tamaño adecuado con las soluciones poliméricas a 2000 RPM durante diez segundos. Seque las láminas recubiertas en un horno de convección a 40 grados celsius durante la noche.Y utilice luz UV para esterilizar las laminillas durante 30 minutos antes de inocularlas con bacterias. Coloque las laminillas esterilizadas con UV en una placa estándar de 12 o 24 pocillos e incube con bacterias como se demostró anteriormente en este video. Después de la incubación, lave las laminillas recubiertas dos veces con tampón cacodilato 0,1 molar y luego fije las muestras durante dos horas con glutaraldehído al 2,5% peso por volumen y tampón cacodilato 0,1 molar.Postfije los cubreobjetos con tetróxido de osmio al 1% durante una hora a temperatura ambiente. Antes de deshidratarlos en una serie de etanol durante 30 minutos en cada concentración. Luego, con un evaporador de pulverización y una mezcla de aleación de oro a platino de 60 a 40%, recubra las muestras utilizando una corriente de 30 miliamperios y un vacío de 0,75 torr.Después de obtener imágenes con MEB, compare visualmente las imágenes de las cubetas sin recubrir y las recubiertas con agarosa o con los polímeros HIT para confirmar la capacidad de los polímeros de unir o repeler bacterias. Para evaluar diversos disolventes en cuanto a su compatibilidad con la parte final del catéter, así como su capacidad para disolver el polímero HIT, sumerja los fragmentos del catéter en los disolventes e incúbelos durante 12 horas antes de evaluar visualmente la integridad del catéter y la claridad del disolvente. Para analizar la adhesión bacteriana en catéteres mediante MEB, prepare una solución de polímero al 10 % en acetona.Presione la punta de una micropipeta de 200 microlitros en la porción media del trozo cortado del catéter para sostenerlo e introduzca el trozo en la solución polimérica durante aproximadamente 30 segundos. Seque el trozo recubierto en condiciones ambiente durante 30 minutos, luego aplique un segundo recubrimiento sumergiendo nuevamente el trozo del catéter en la solución polimérica y seque durante la noche en condiciones ambiente. Después de incubar los trozos de catéter recubiertos y no recubiertos en LB inoculado, según el protocolo descrito en el texto, use un mililitro de PBS para lavar los catéteres.Luego, use paraformaldehído al 10 % en PBS para fijar las bacterias durante 30 minutos. Después de un lavado con PBS, use DAPI para teñir las bacterias en los fragmentos del catéter durante 20 minutos. Antes de lavar con un mililitro de PBS.Observe la disposición de las muestras en la cámara. Utilizando los siguientes ajustes, tome imágenes confocales de los fragmentos del catéter. Complete la adquisición confocal mediante z-stacking de 50 imágenes a lo largo de una longitud de 100 micrómetros del catéter.Después del tratamiento con UV e incubación con bacterias, utilice un mililitro de PBS para lavar las piezas dos veces y transfiéralas a placas de 48 pocillos que contengan formaldehído al 10% en PBS durante 30 minutos. Tras fijar las muestras, realice otro lavado con PBS y seque durante la noche a temperatura ambiente. Luego, monte sobre platillos con discos de carbono conductor y use un cubridor por pulverización catódica para recubrir con oro.Antes de la obtención de imágenes, utilizando un microscopio electrónico de barrido. Esta figura muestra la adhesión bacteriana a varios polímeros según se determinó mediante análisis de microarreglos. Los puntos impresos sin polímero sirven como control negativo, ya que el agarosa resiste fuertemente la unión bacteriana y, por lo tanto, la fluorescencia es muy baja.Los polímeros mostrados presentan unión a aleaciones, aunque en la mayoría de los casos, las propiedades repelentes de un polímero varían significativamente entre las especies bacterianas ensayadas. Esto refleja las grandes diferencias entre los mecanismos de adhesión en distintas especies. Los polímeros de baja unión se identifican fácilmente mediante comparación con agarosa.Es probable que se identifiquen polímeros de alta unión en una matriz y se pueden utilizar como controles positivos para experimentos posteriores. Para polímeros que no muestran auto-fluorescencia en el canal DAPI, se puede realizar una comparación cualitativa de las imágenes de los puntos visualmente. Se realizaron experimentos a mayor escala para probar el recubrimiento de superficies más grandes con el fin de confirmar las propiedades repelentes de bacterias de 22 polímeros adecuados identificados.Se muestran aquí las muestras con mejor desempeño utilizadas para recubrir laminillas de vidrio, según el análisis mediante MEB. Estas figuras muestran cortes de catéter analizados mediante microscopía confocal y MEB. Ambos métodos microscópicos tienen la ventaja de permitir recuentos celulares directos sobre la superficie, proporcionando datos inequívocos, ya que la reducción en la adhesión celular es fácilmente visible.Tras seguir este procedimiento, se podrían analizar componentes del suero o de la sangre para determinar su impacto en la unión bacteriana. Se podría utilizar un modelo animal para evaluar el potencial de los recubrimientos poliméricos en aplicaciones clínicas. No olvide que trabajar con productos químicos y organismos patógenos puede ser peligroso.Y deben establecerse controles necesarios durante el manejo y la eliminación para mitigar los riesgos personales y ambientales.

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Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

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