De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

El objetivo general de esta técnica de microarrays poliméricos es identificar polímeros sintéticos capaces de modular la unión de bacterias a superficies abióticas. Este método puede ayudar a acelerar el progreso en el descubrimiento de biomateriales simples y rentables que inhiben la adhesión bacteriana a los dispositivos médicos. La principal ventaja de esta técnica en comparación con la investigación convencional de biomateriales de prueba de un material a la vez es su capacidad para cribar cientos de polímeros simultáneamente en un solo activo.

Para comenzar, prepare soluciones de polímeros y agréguelas a los pocillos de una placa de 384 pocillos, de acuerdo con el protocolo de texto. Cree una rutina para imprimir polímeros en cuadruplicado que consta de 1536 puntos, dispuestos en 48 filas y 32 columnas, imprimiendo 32 soluciones de polímeros a la vez para que la impresora pueda detenerse después de imprimir cada sección para permitir la limpieza de los pines. Ahora coloque los portaobjetos recubiertos de agarosa en la plataforma y asegúrese de un buen sellado al vacío para mantener los portaobjetos en su posición.

Para ajustar el cabezal de impresión de modo que todos los pines estén a la misma altura, baje manualmente el cabezal sobre una corredera de vidrio y confirme que los pines se mueven hacia arriba al mismo tiempo. Coloque la placa de pocillos en el soporte de la placa con el pocillo A1 en la parte superior derecha del soporte y asegúrese de que la placa de pocillos esté firmemente fijada. Confirme que la corredera y la placa de pocillos estén en posición cuando se le solicite.

Imprima una sección a la vez, lo que permite la limpieza de los pines entre secciones. Luego, use una toalla de papel humedecida en acetona para limpiar los alfileres a fondo. Seguido de papel de seda seco para asegurarse de que los alfileres estén completamente secos.

Cuando los microarrays estén completamente impresos, colóquelos en un soporte de portaobjetos y transfiéralos a un horno de vacío, ajustado a 40 grados centígrados para que se sequen, para eliminar el N y P en las manchas de polímero. A continuación, utilice luz ultravioleta para esterilizar las placas durante 30 minutos. Antes de inocular portaobjetos con bacterias, tome una medida de fluorescencia de fondo de acuerdo con el protocolo de texto.

Después de cultivar y preparar los inóculos para los microarrays, de acuerdo con el protocolo de texto, coloque los microarrays de polímeros esterilizados con UV en placas rectangulares de cuatro pocillos y agregue seis mililitros de cultivos bacterianos mixtos. Incubar las placas a 37 grados centígrados con una suave agitación durante cinco días. Después de la incubación, use PBS para enjuagar suavemente los microarrays dos veces.

A continuación, añadir un microgramo por mililitro de DAPI en PBS e incubar durante 30 minutos. A continuación, transfiera los microarrays a una placa nueva de cuatro pocillos, cubra los microarrays con PBS y luego gírelos suavemente. A continuación, cambie el PBS una vez y repita el lavado.

Después de enjuagar, seque los microarrays bajo un flujo de aire, luego aplique una película de sellado y pegue los deslizamientos de la cubierta de vidrio a los portaobjetos de los microarrays. Cuando el pegamento esté seco, use etanol al 70% para esterilizar la superficie exterior. Usando un microscopio de fluorescencia, equipado con un subjetivo de 20x, capture imágenes individuales para cada punto de polímero en canales de campo claro y tracas.

Para recubrir los cubreobjetos con polímeros, prepare soluciones de polímeros HIT en tetrahidrofurano u otro solvente apropiado. Usando un recubridor giratorio, centrifuga los deslizamientos de cubierta de vidrio circular de tamaño adecuado con las soluciones de polímero a 2000 RPM durante diez segundos. Seque los cubreobjetos recubiertos en un horno de convección a 40 grados centígrados durante la noche.

Y use luz ultravioleta para esterilizar los cubreobjetos durante 30 minutos antes de inocular con bacterias. Coloque los cubreobjetos esterilizados con rayos UV en una placa estándar de 12 o 24 pocillos e incube con bacterias como se demostró anteriormente en este video. Después de la incubación, use tampón de cacodilato molar de 0,1 molar para lavar los deslizamientos de la cubierta recubierta dos veces y luego con glutaraldehído de 2,5% de peso por volumen y tampón de cacodilato molar de 0,1 molar, fije las muestras durante dos horas.

Fije los cubreobjetos con tetróxido de osmio al 1% durante una hora a temperatura ambiente. Antes de deshidratarlos en una serie de etanol durante 30 minutos a cada concentración. Luego, con un recubridor por pulverización catódica y una mezcla de aleación de 60 a 40% de oro a platino, cubra las muestras usando una corriente de 30 miliamperios y un vacío de 0.75 torr.

Después de tomar imágenes con SEM, compare visualmente las imágenes de los cubreobjetos sin recubrimiento y los recubiertos con agarosa o los polímeros HIT para confirmar las capacidades de unión o repelencia bacteriana de los polímeros. Para evaluar la compatibilidad de varios solventes con la parte de pozo, así como su capacidad para disolver el polímero HIT, sumerja las piezas del catéter en los solventes e incube durante 12 horas antes de evaluar visualmente la integridad del catéter y la claridad del solvente. Para analizar la unión bacteriana en los catéteres mediante SEM, prepare una solución de polímero al 10% en acetona.

Presione una punta de micropipeta de 200 microlitros en la parte media de la pieza cortada del catéter para sujetarla y pegar la pieza en la solución de polímero durante aproximadamente 30 segundos. Seque la pieza recubierta en condiciones ambientales durante 30 minutos, luego aplique una segunda capa sumergiendo la pieza del catéter nuevamente en la solución de polímero y seque durante la noche en condiciones ambientales. Después de incubar las piezas de catéter recubiertas y no recubiertas en LB inoculado, de acuerdo con el protocolo de texto, use un mililitro de PBS para lavar los catéteres.

Luego use 10% de paraformaldehído en PBS para fijar las bacterias durante 30 minutos. Después de un lavado con PBS, use DAPI para teñir las bacterias en las piezas del catéter durante 20 minutos. Antes de lavar con un mililitro de PBS.

Observe la disposición de las muestras en la cámara. Con los siguientes ajustes, tome imágenes confocales de las piezas del catéter. Complete la imagen confocal apilando en Z 50 imágenes a lo largo de una longitud de 100 micrómetros del catéter.

Después del tratamiento UV y la incubación con bacterias, use un mililitro de PBS para lavar las piezas dos veces y transfierirlas a placas de 48 pocillos que contengan 10% de formaldehído en PBS durante 30 minutos. Después de fijar las muestras, realice otro lavado con PBS y seque durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, móntelo en muñones con discos de carbono conductores y utilice un recubridor de pulverización catódica para aplicar una capa de oro.

Antes de la toma de imágenes, utilizando un microscopio electrónico de barrido. Esta figura muestra la unión bacteriana a una serie de polímeros según lo determinado por el análisis de microarrays. Las manchas impresas sin polímero actúan como control negativo, ya que la agarosa resiste fuertemente la unión bacteriana y, por lo tanto, la fluorescencia es muy baja.

Los polímeros mostrados son aglutinantes de aleaciones, aunque en la mayoría de los casos, las propiedades repelentes de un polímero varían significativamente entre las especies bacterianas probadas. Esto refleja las grandes diferencias entre los mecanismos de apego entre las diferentes especies. Los polímeros de baja unión se identifican fácilmente en comparación con la agarosa.

Es probable que los polímeros de alta unión se identifiquen en una matriz y se puedan utilizar como controles positivos para experimentos posteriores. En el caso de los polímeros que no muestran autofluorescencia en el canal DAPI, se puede realizar visualmente una comparación cualitativa de las imágenes puntuales. Se realizaron experimentos a escala para probar el recubrimiento de superficies más grandes para confirmar las propiedades repelentes de bacterias de 22 polímeros apropiados identificados.

Aquí se muestran las muestras de mejor rendimiento utilizadas para recubrir los deslizamientos de cubierta de vidrio según lo analizado por SEM. Estas figuras muestran cortes de catéter analizados por microscopía confocal y SEM. Ambos métodos microscópicos tienen la ventaja de permitir recuentos directos de células en la superficie, proporcionando datos inequívocos, ya que la reducción de la adhesión celular es fácilmente visible.

Después de este procedimiento, se podrían analizar los componentes séricos o sanguíneos para determinar su impacto en la unión bacteriana. Se podría utilizar un modelo animal para evaluar el potencial de los recubrimientos poliméricos para uso clínico. No olvide que trabajar con productos químicos y organismos patógenos puede ser peligroso.

Y se deben implementar los controles necesarios durante la manipulación y eliminación para mitigar los riesgos personales y ambientales.