De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

El objetivo general de esta técnica de microarreglo de polímeros es identificar polímeros sintéticos capaces de modular la adhesión de bacterias a superficies abióticas. Este método puede ayudar a acelerar el progreso en el descubrimiento de biomateriales sencillos y rentables que inhiban la adhesión bacteriana a dispositivos médicos. La principal ventaja de esta técnica en comparación con la investigación convencional de biomateriales, que prueba un material a la vez, es su capacidad para analizar cientos de polímeros simultáneamente en una sola prueba.

Para comenzar, prepare soluciones poliméricas y añádalas a los pocillos de una placa de 384 pocillos, según el protocolo descrito. Cree una rutina para imprimir los polímeros en cuadruplicado, consistente en 1536 puntos, dispuestos en 48 filas y 32 columnas, imprimiendo 32 soluciones poliméricas a la vez, de modo que la impresora pueda detenerse tras imprimir cada sección para permitir la limpieza de las puntas. Ahora coloque las láminas recubiertas con agarosa sobre la plataforma y asegure un buen sellado al vacío para mantener las láminas en posición.

Para ajustar la cabeza de impresión de modo que todos los pasadores estén a la misma altura, baje manualmente la cabeza sobre una lámina de vidrio y confirme que los pasadores se muevan hacia arriba al mismo tiempo. Coloque la placa de pocillos en el soporte de placas con el pocillo A1 en la esquina superior derecha del soporte y asegúrese de que la placa de pocillos esté firmemente fijada. Confirme que la lámina y la placa de pocillos estén en posición cuando se le solicite.

Imprima una sección a la vez, permitiendo la limpieza de los pinchos entre secciones. Luego, use una toalla de papel sumergida en acetona para limpiar los pinchos completamente. A continuación, utilice papel de tissue seco para asegurarse de que los pinchos estén totalmente secos.

Una vez que las micromatrices estén completamente impresas, colóquelas en un portaportaobjetos y transfiéralas a un horno de vacío ajustado a 40 grados celsius para secarlas y eliminar el N&P en los puntos de polímero. Luego, utilice luz UV para esterilizar las placas durante 30 minutos. Antes de inocular las laminillas con bacterias, tome una medición de la fluorescencia de fondo según el protocolo descrito en el texto.

Después de cultivar y preparar los inóculos para los microarreglos, según el protocolo descrito, coloque los microarreglos poliméricos esterilizados con luz UV en placas rectangulares de cuatro pocillos y agregue seis mililitros de cultivos bacterianos mixtos. Incube las placas a 37 grados Celsius con agitación suave durante cinco días. Después de la incubación, use PBS para enjuagar suavemente los microarreglos dos veces.

Luego, agregue un microgramo por mililitro de DAPI en PBS e incube durante 30 minutos. A continuación, transfiera los microarreglos a una placa fresca de cuatro pocillos, cubra los microarreglos con PBS y luego agite suavemente. Después, cambie el PBS una vez y repita el lavado.

Después de enjuagar, seque los microarreglos bajo un flujo de aire, luego aplique una película selladora y fije cubreobjetos de vidrio a las laminillas de microarreglo. Cuando el pegamento esté seco, use etanol al 70 % para esterilizar la superficie externa. Utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 20x, capture una imagen individual para cada punto de polímero en los canales de campo brillante y estrápico.

Para recubrir láminas con polímeros, prepare soluciones de polímeros HIT en tetrahidrofuran o un disolvente adecuado. Utilizando un espinador, aplique por centrifugación láminas de vidrio circulares de tamaño adecuado con las soluciones poliméricas a 2000 RPM durante diez segundos. Seque las láminas recubiertas en un horno de convección a 40 grados celsius durante la noche.

Y utilice luz UV para esterilizar las laminillas durante 30 minutos antes de inocularlas con bacterias. Coloque las laminillas esterilizadas con UV en una placa estándar de 12 o 24 pocillos e incube con bacterias como se demostró anteriormente en este video. Después de la incubación, lave las laminillas recubiertas dos veces con tampón cacodilato 0,1 molar y luego fije las muestras durante dos horas con glutaraldehído al 2,5% peso por volumen y tampón cacodilato 0,1 molar.

Postfije los cubreobjetos con tetróxido de osmio al 1% durante una hora a temperatura ambiente. Antes de deshidratarlos en una serie de etanol durante 30 minutos en cada concentración. Luego, con un evaporador de pulverización y una mezcla de aleación de oro a platino de 60 a 40%, recubra las muestras utilizando una corriente de 30 miliamperios y un vacío de 0,75 torr.

Después de obtener imágenes con MEB, compare visualmente las imágenes de las cubetas sin recubrir y las recubiertas con agarosa o con los polímeros HIT para confirmar la capacidad de los polímeros de unir o repeler bacterias. Para evaluar diversos disolventes en cuanto a su compatibilidad con la parte final del catéter, así como su capacidad para disolver el polímero HIT, sumerja los fragmentos del catéter en los disolventes e incúbelos durante 12 horas antes de evaluar visualmente la integridad del catéter y la claridad del disolvente. Para analizar la adhesión bacteriana en catéteres mediante MEB, prepare una solución de polímero al 10 % en acetona.

Presione la punta de una micropipeta de 200 microlitros en la porción media del trozo cortado del catéter para sostenerlo e introduzca el trozo en la solución polimérica durante aproximadamente 30 segundos. Seque el trozo recubierto en condiciones ambiente durante 30 minutos, luego aplique un segundo recubrimiento sumergiendo nuevamente el trozo del catéter en la solución polimérica y seque durante la noche en condiciones ambiente. Después de incubar los trozos de catéter recubiertos y no recubiertos en LB inoculado, según el protocolo descrito en el texto, use un mililitro de PBS para lavar los catéteres.

Luego, use paraformaldehído al 10 % en PBS para fijar las bacterias durante 30 minutos. Después de un lavado con PBS, use DAPI para teñir las bacterias en los fragmentos del catéter durante 20 minutos. Antes de lavar con un mililitro de PBS.

Observe la disposición de las muestras en la cámara. Utilizando los siguientes ajustes, tome imágenes confocales de los fragmentos del catéter. Complete la adquisición confocal mediante z-stacking de 50 imágenes a lo largo de una longitud de 100 micrómetros del catéter.

Después del tratamiento con UV e incubación con bacterias, utilice un mililitro de PBS para lavar las piezas dos veces y transfiéralas a placas de 48 pocillos que contengan formaldehído al 10% en PBS durante 30 minutos. Tras fijar las muestras, realice otro lavado con PBS y seque durante la noche a temperatura ambiente. Luego, monte sobre platillos con discos de carbono conductor y use un cubridor por pulverización catódica para recubrir con oro.

Antes de la obtención de imágenes, utilizando un microscopio electrónico de barrido. Esta figura muestra la adhesión bacteriana a varios polímeros según se determinó mediante análisis de microarreglos. Los puntos impresos sin polímero sirven como control negativo, ya que el agarosa resiste fuertemente la unión bacteriana y, por lo tanto, la fluorescencia es muy baja.

Los polímeros mostrados presentan unión a aleaciones, aunque en la mayoría de los casos, las propiedades repelentes de un polímero varían significativamente entre las especies bacterianas ensayadas. Esto refleja las grandes diferencias entre los mecanismos de adhesión en distintas especies. Los polímeros de baja unión se identifican fácilmente mediante comparación con agarosa.

Es probable que se identifiquen polímeros de alta unión en una matriz y se pueden utilizar como controles positivos para experimentos posteriores. Para polímeros que no muestran auto-fluorescencia en el canal DAPI, se puede realizar una comparación cualitativa de las imágenes de los puntos visualmente. Se realizaron experimentos a mayor escala para probar el recubrimiento de superficies más grandes con el fin de confirmar las propiedades repelentes de bacterias de 22 polímeros adecuados identificados.

Se muestran aquí las muestras con mejor desempeño utilizadas para recubrir laminillas de vidrio, según el análisis mediante MEB. Estas figuras muestran cortes de catéter analizados mediante microscopía confocal y MEB. Ambos métodos microscópicos tienen la ventaja de permitir recuentos celulares directos sobre la superficie, proporcionando datos inequívocos, ya que la reducción en la adhesión celular es fácilmente visible.

Tras seguir este procedimiento, se podrían analizar componentes del suero o de la sangre para determinar su impacto en la unión bacteriana. Se podría utilizar un modelo animal para evaluar el potencial de los recubrimientos poliméricos en aplicaciones clínicas. No olvide que trabajar con productos químicos y organismos patógenos puede ser peligroso.

Y deben establecerse controles necesarios durante el manejo y la eliminación para mitigar los riesgos personales y ambientales.