Name: El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a aislar complejos de ARN-proteína en células eucariotas mediante elución dirigida por oligonucleótidos. Este método permite caracterizar interacciones específicas de ARN y proteínas como DHX9/RHA en transcritos retrovirales.

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Los autores agradecen el apoyo de NIH P50GM103297, P30CA100730 y Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Las composiciones de amortiguamiento </td></tr><tr><td> Tampón de lavado: </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl 150 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> Bajo tampón salino: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 </td></tr><tr><td> NaCl 10 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> DTT 2 mM </td></tr><tr><td> 1x cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA </td></tr><tr><td> RNasa out 5 l / ml (inhibidor de RNasa) </td></tr><tr><td> Citoplasmática Tampón de lisis: </td></tr><tr><td> 0,2 M de sacarosa </td></tr><tr><td> 1,2% de Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETN-150 Tampón de lavado: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mMNaCl </td></tr><tr><td> 0,5% NP-40 </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> 10% de glicerol </td></tr><tr><td> Tampón de unión: </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES pH 7,6 </td></tr><tr><td> KCl 40 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> DTT 2 mM </td></tr><tr><td> 5% de glicerol </td></tr></tbody></table> Tabla 2: composiciones de búfer. 1. Preparación de las células y la matriz de afinidad <ol><li> Cultura una línea de células de interés para sub-confluencia (80%) en una placa de 10 cm. Utilice placas de 10 cm para las inmunoprecipitaciones independientes (IP) de una proteína de cubierta de MS2-NLS bandera de etiquetado. Realice la IP utilizando antisueros frente a la etiqueta FLAG epítopo. Cuando se expresa el plásmido de proteína de cubierta de MS2 bandera de etiquetado, las células transfectar 24-48 h antes de la cosecha 20. NOTA: Una RNP en particular puede ser enriquecida a partir nuclear o citoplasmalisados ​​ic o una preparación bioquímicamente fraccionada, tales como fracciones de un gradiente de sacarosa. Se recomienda para cosechar el lisado de células no transfectadas en paralelo para instituir un control negativo adicional. </li><li> Transferencia de 60 l por IP de la proteína G suspensión de perlas magnéticas a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. </li><li> Se coloca el tubo en un estante imán para recipientes de reacción para separar las perlas de la solución de almacenamiento. </li><li> Retire la solución de almacenamiento dibujando con cuidado con una micropipeta. </li><li> Retire el tubo del bastidor imán. </li><li> Lavar y equilibrar las perlas con 600 l (10 veces el volumen utilizado de perlas) de 1x tampón de lavado (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 3 mM MgCl 2; y NaCl 150 mM) y de extremo a extremo de rotación para 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Se coloca el tubo en el estante imán y eliminar el tampón de lavado. </li><li> Añadir 10 volúmenes (600 l) de tampón de lavado 1x y el anticuerpo FLAG immunoprecipitating a la pr equilibradaperlas magnéticas Otein G (de acuerdo con la cantidad recomendada por el fabricante para una inmunoprecipitación) y de extremo a extremo de rotación a temperatura ambiente durante al menos 30 min para conjugar el anticuerpo inmunoprecipitación. Utilice la correspondiente IgG de isotipo como control negativo de anticuerpo adecuado. </li><li> Se coloca el tubo en el estante imán para recoger las perlas y para eliminar el sobrenadante. </li><li> Retire el tubo del bastidor imán y se lavan las perlas de anticuerpo conjugado con 10 volúmenes (600 l) de tampón de lavado 1x y la rotación de 3 min a temperatura ambiente. Repita este paso dos veces. </li><li> Se coloca el tubo en el estante imán y eliminar el tampón de lavado. </li></ol> 2. La recolección de la RNP NOTA: Preparar las RNPs durante el tiempo de incubación después del paso 1.8. <ol><li> Retirar el medio de cultivo de las células mediante aspiración y se lavan las células dos veces con 1-5 ml de helado de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Use un raspador de células para desalojar húmeda,las células adherentes anteriores a la recogida por centrifugación a 226 g durante 4 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 375 l de, tampón bajo en sal enfriada con hielo (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 3 mM MgCl 2; NaCl 10 mM; DTT 2 mM; 1x cóctel inhibidor de la proteasa, libre de EDTA; y 5 l / ml RNase Inhibitor) al sedimento celular y permitir que la hinchazón colocándolo en hielo durante 5 min. NOTA: a medida que el volumen de tampón de bajo contenido de sal según el tamaño de la pella celular. Para 1,2 x 10 6 células de una placa de 10 cm, 375 l de tampón es suficiente. </li><li> Para recoger el lisado celular citoplasmática, añadir 125 l de tampón de lisis enfriado con hielo (0,2 M de sacarosa / 1,2% de Triton X-100), y luego realizar 10 golpes con un homogeneizador Dounce que fue previamente enfriado en un cubo de hielo. NOTA: Para recoger el extracto celular total, se recomienda tampón de lisis RIPA estándar para la solubilización del nucleoplasma / cromatina. </li><li> Centrifugado en una microcentrífuga a máxima velocidad (16.000 xg) durante 1 minuto; esto borrará el sobrenadante de escombros de unand núcleos. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml que ha estado en hielo. Determinar la concentración de proteína total por una norma, el método preferido de laboratorio, tales como el ensayo de Bradford 23. Reserva una alícuota de al menos 10% para un análisis de transferencia Western, para ser utilizado como un control de entrada. Utilice el lisado celular recogida inmediatamente por inmunoprecipitación o almacenarla a -80 ° C para su posterior análisis. NOTA: En nuestra experiencia, estas muestras pueden almacenarse y utilizarse varios meses más tarde para el análisis de inmunoprecipitación sin peligro para la integridad. </li></ol> 3. La inmunoprecipitación <ol><li> Añadir el volumen deseado del lisado de células cosechadas, en base a la concentración de proteína determinada en la etapa 2.5, a las perlas de anticuerpo conjugado diana. El uso de tampón de lavado 1x, llevar el volumen total de hasta 600 l y girar extremo sobre extremo durante 90 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Este período de tiempo es suficiente para generarun aislamiento sólido de complejos de RNP de alta afinidad y reducir al mínimo la unión no específica. Diluir fuentes RNP alternativos, tales como fracciones de gradiente de sacarosa, al menos 1: 1 con tampón de lavado 1x y, a continuación, se incuba con los complejos de talón-anticuerpo preparadas previamente, como se mencionó anteriormente. </li><li> Después de 90 minutos de incubación, se coloca el tubo de IP en el estante imán para recoger las perlas. Reservar el sobrenadante como de flujo continuo. NOTA: Este primer paso de flujo es una muestra de control importante para medir la eficiencia de IP. Un ensayo de inmunotransferencia proporcionará una indicación de la eficiencia de IP, así como la especificidad de las interacciones investigados. Se recomienda mantener este sobrenadante para el análisis de aguas abajo. </li><li> Lavar las perlas RNP-atado, el anticuerpo conjugado con 10 volúmenes (600 l) de NETN-150 tampón de lavado enfriado con hielo (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 150 mM; 3 mM MgCl2; NP40 al 0,5%; y 10% de glicerol) en rotación durante 3 min a temperatura ambiente. Repita el paso 3 veces. NOTA: Este tampón se diferencia del tampón de lisis y efectivamente reduce las asociaciones débiles o no específicas. </li><li> Tras el lavado final, resuspender los complejos RNP inmovilizadas en 60 l de tampón enfriado con hielo 1x de unión (HEPES 10 mM, pH 7,6; KCl 40 mM; 3 mM MgCl 2; 5% de glicerol; y DTT 2 mM) y reserva 10% de las perlas de complejo inmovilizado de Western blot y 20% para el aislamiento de ARN. </li></ol> 4. La elución <ol><li> Ajustar el volumen restante a 100 l con tampón de unión 1x enfriado con hielo y calentar el tubo a 70 ° C durante 3 min. </li><li> Para aislar los complejos de ARN-proteína afín, añadir un ~ oligonucleótido de ADN 30-nt que es complementaria a la secuencia 3 &#39;límite del ARN de interés e incubar durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave (100 nM de oligonucleótido es suficiente). NOTA: El oligonucleótido es antisentido para los residuos de nucleótidos adyacentes a la iniciación de la traducción-sitio de la construcción de PCE usado como un example en este protocolo. Apropiada complementariedad de secuencia es proporcionada por el contenido de GC ~ 40%. Diseñar el oligonucleótido antisentido para la hibridación eficiente a la región complementaria mínimo del ARN diana. </li><li> Añadir 5-10 unidades de RNasa H al tubo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr para escindir el ARN del ARN: ADN híbrido. Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,7 ml de microcentrífuga estéril; Este ejemplo contiene los complejos RNP capturados de interés. NOTA: Dependiendo de la accesibilidad de la RNA cognado, dos o más rondas de tratamiento con RNasa H pueden ser útiles para aumentar la abundancia de la muestra para el análisis aguas abajo. </li><li> Utilice 20% del eluato en un Western blot para proteínas asociadas conocidos y 20% del eluato para el aislamiento de ARN seguido por RT qPCR. El 60% restante puede ser utilizado para la espectrometría de masas o para identificar componentes de la proteína. </li><li> En paralelo, someter una parte alícuota del lisado celular reservada para el aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR. este ASSEssment proporciona una indicación de enriquecimiento de ARN dentro de un complejo de RNP. NOTA: Utilice la preparación de proteína aislada en un western blot de control para asegurarse de que la escisión de ARNasa H fue eficaz en la liberación de la RNP a partir del complejo immunuoprecipitated. </li></ol> 5. Proteína análisis de electroforesis y Western Blot <ol><li> Asunto aproximadamente 10 a 20% de la muestra total a SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia según el protocolo estándar de laboratorio. NOTA: Este paso sirve para validar la eficacia y especificidad IP antes del análisis de ARN aguas abajo. También se puede utilizar para evaluar la composición de proteínas de la aislado complejo RNP. </li></ol> 6. Recogida de la ARN inmunoprecipitado NOTA: el aislamiento de ARN se puede realizar por el método de Trizol o siguiendo el protocolo descrito. <ol><li> Volver a suspender la mitad de la muestra total de 750 l de reactivo de tiocianato de guanidinio ácido e incubar a sala de temperatura durante 5 min antes de la extracción del ARN a partir de los complejos PCE-RNP capturados. </li><li> Añadir 200 l de de cloroformo al tubo, agitar enérgicamente durante 10 segundos, y se incuba a temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Después de centrifugación a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C, recoger la fase acuosa en el tubo de nuevo y añadir un volumen igual de isopropanol. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante al menos 10 min. Añadir 1 l de azul de glicol a la muestra y almacenarlo a -20 ° C en el congelador durante la precipitación o procesamiento eficiente en una fecha futura. </li><li> Centrifugar el tubo a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recoger cuidadosamente el sobrenadante y desechar el fin de no perturbar el sedimento de ARN; Se recomienda el uso de una punta de micropipeta P-200 para facilitar este proceso. </li><li> Añadir 500 l de etanol al 75% a cada tubo, vórtice, y centrifugar los tubos a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Recoger cuidadosamente y descartar el sobrenadante como en el paso 6.4. Aire-secar el sedimento durante 2-3 min y se vuelve a suspender en 100 l de agua libre de RNasa. NOTA: No prolongar el tiempo de los aparatos de aire se seca de gránulos con el fin de evitar un problema con resuspensión. </li><li> Aplicar 100 l de muestra de ARN a una ARN columna limpieza. Procesarla utilizando el protocolo del fabricante. Eluir el ARN en 30 l de agua libre de RNasa y se almacena a -80 ° C durante un máximo de 3 meses. NOTA: Este ARN aislado es adecuado para el análisis de aguas abajo por RT-PCR en tiempo real (qPCR), microarray, y la secuencia de ARN. Dependiendo de la abundancia de la RNP y la eficiencia con la que se aísla el RNP de interés, el mismo lisado puede ser sometido a dos o más rondas de IP para generar suficiente ARN aplicable para el análisis aguas abajo. </li></ol> Transcripción 7. RNA inversa y la amplificación del ADNc por PCR <ol><li> Se somete el RNA aislado a transcripción inversa por un cebador aleatorio con una transcriptasa inversa de alta calidad (RT), de acuerdo con la manufainstrucciones del cturer. </li><li> Para amplificar el ARN de interés, diseñar un cebador antisentido de genes específicos dentro de la secuencia de escisión de ARNasa H. Usar cantidades similares del oligonucleótido antisentido, un cebador aleatorio, o un cebador oligo-dT (Ver Tabla de Materiales). NOTA: El cebador oligo-dT y el ARNm poli-adenylated proporcionan reacciones de control positivas para las reacciones de RT-PCR. </li><li> Reserva 5% de la reacción de RT (1 l) para un qPCR preparativa hecho en conjunto con el control negativo lisado IP y muestras de ADN de control positivo para definir el punto de corte y producir una curva estándar. Si el valor CT del preparativa qPCR está más allá del rango de la curva estándar, se diluye la reacción de RT en ininterrumpidos 1: 5 diluciones y repita el paso 7.2. NOTA: Para una secuenciación de ARN y la técnica de espectrometría de masas, por favor consulte el archivo Método complementario. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí t</a>o ver el archivo de método complementario. (Haga clic aquí para descargar.) </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El aislamiento RNP y estrategia de identificación afines ARN descrito aquí es un medio selectivo de la investigación de una interacción específica de ARN-proteína y de descubrimiento de las proteínas candidatas co-regulación de un RNP específico en las células. La ventaja de usar oligonucleótidos escisión por RNasa H para aislar RNPs es la capacidad de capturar y analizar el elemento activo en cis ARN RNP sobre RNPs heterogéneos unidos aguas abajo al elemento de RNA que actúan en cis de inte...

la expresión del gen post-transcripcional se regula con precisión, a partir de la transcripción del ADN en el núcleo. Controlado por ARN de unión a proteínas (prácticas comerciales restrictivas), ARNm biogénesis y el metabolismo se producen en partículas de ribonucleoproteínas altamente dinámicas (RNPs), que se asocian y se disocian con un mRNA precursor sustrato durante la progresión de ARN metabolismo 1-3. Los cambios dinámicos en los componentes de RNP afectan el destino post-transcripcional de un ARNm y proporcionan garantía de calidad durante el procesamiento de los transcritos primarios, su tráfico nuclear y localización, su actividad como plantillas de ARNm para la traducción, y la eventual facturación de mRNAs maduros. Numerosas proteínas se designan como las prácticas comerciales restrictivas en virtud de sus dominios de aminoácidos conservados, incluyendo el motivo de reconocimiento de ARN (RRM), el ARN de doble cadena dominio de unión (RBD), y tramos de residuos básicos (por ejemplo, arginina, lisina y glicina) 4. Las prácticas comerciales restrictivas son rutinariamenteaislado por las estrategias de inmunoprecipitación y se criban para identificar sus afines ARN. Algunas prácticas comerciales restrictivas co-regulan los pre-ARNm que están relacionadas funcionalmente, designados como regulons ARN 5-8. Estas prácticas comerciales restrictivas, sus ARNm afines, ya veces no codificante del ARN, forman RNP catalíticos que varían en su composición; su singularidad se debe a varias combinaciones de factores asociados, así como a la secuencia temporal, la ubicación, y la duración de sus interacciones 9. RNA inmunoprecipitación (RIP) es una técnica poderosa para aislar RNPs procedentes de células y para identificar las transcripciones asociadas utilizando el análisis de secuencia de 10 a 13. Pasar de la candidata a escala del genoma de cribado es posible a través de PIR, junto con un análisis de microarrays 14 o secuenciación de alto rendimiento (RNAseq) 15. Del mismo modo, las proteínas co-precipitación se pueden identificar mediante espectrometría de masas, si son lo suficientemente abundante y separable del anticuerpo co-precipitación de 16,17. Aquí, nos dirigimos a la metodología para el aislamiento de componentes RNP de un ARN cognado específico a partir de células humanas cultivadas, aunque el enfoque es alterable por lisados ​​solubles de células de plantas, hongos, virus y bacterias. Los análisis de aguas abajo de la materia incluyen la identificación y validación candidato por inmunoblot, espectrometría de masas, ensayo enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarrays, y RNAseq, tal como se resume en la Figura 1. Dado el papel fundamental de la RNP en el control de la expresión génica a nivel post-transcripcional, las alteraciones en la expresión de las prácticas comerciales restrictivas de componentes o su accesibilidad a los afines ARN pueden ser perjudiciales para la célula y están asociados con varios tipos de trastornos, incluyendo la enfermedad neurológica 18. DHX9 / RNA helicasa A (RHA) es necesario para la traducción de mRNAs seleccionadas de orígenes celulares y retrovirales 6. Estos ARN afines exhiben elementos que actúan en cis-estructuralmente relacionadas dentro de su5 &#39;UTR, que se designa como el elemento de control post-transcripcional (PCE) 19. Actividad RHA-PCE es necesario para la traducción en la tapa que dependen eficiente de muchos retrovirus, incluido el VIH-1, y de genes reguladores de crecimiento, incluyendo Jund 6,20,21. Codificada por un gen esencial (dhx9), RHA es esencial para la proliferación celular y su baja regulación elimina la viabilidad celular 22. El análisis molecular de RHA-PCE RNP es un paso esencial para entender por qué es necesaria la actividad de RHA-PCE para el control de la proliferación celular. La caracterización precisa de los componentes RNP RHA-PCE en estado estacionario o sobre perturbación fisiológica de la célula requiere el enriquecimiento selectivo y captura de los RNPs RHA-PCE en abundancia suficiente para el análisis de aguas abajo. Aquí, el ARN retroviral PCEgag fue etiquetado con 6 copias del sitio de unión de ARN que actúa en cis para la proteína de cubierta de MS2 (CP) dentro del marco de lectura abierto. La proteína de cubierta de MS2 se exogenously co-expresada con PCEgag RNA por el plásmido de transfección para facilitar el montaje RNP en células en crecimiento. RNPs que contienen la proteína de cubierta MS2 con RNA etiquetado PCEgag-MS2 cognado se inmunoprecipitaron a partir del extracto celular y capturaron en perlas magnéticas (Figura 2a). Para capturar selectivamente los componentes RNP con destino al PCE, la RNP inmovilizado se incubó con un oligonucleótido complementario a las secuencias distales a la PCE, formando un híbrido de ARN-ADN que es el sustrato para la actividad de RNasa H. Desde PCE se posiciona en &#39;terminal del 5&#39; de la región no traducida 5, el oligonucleótido era complementario a las secuencias de ARN adyacentes al sitio de inicio de traducción retroviral (gag codón de inicio). Escisión por RNasa H cerca del inicio de la mordaza codón lanzado complejo UTR 5 &#39;de la RNP inmovilizado, que se recogió como eluyente. A partir de entonces, la muestra se evaluó mediante RT-PCR para confirmar la captura de PCEgag y mediante SDS PAGE y de inmunotransferencia para confirmar la capture de la proteína de cubierta de MS2 objetivo. Una validación de la unión de ARN proteína PCE-asociado, DHX9 / RNA helicasa A, se realiza entonces.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Proteína A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-RHA</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS reactivo</td><td>Tecnología de vida</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNasa H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>Columna de limpieza RNaeasy</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa omniscript</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones de hexámero aleatorio</td><td>Invitrogen N8080127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones Oligo-dT</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>Imprimaciones de PCR</td><td>IDT</td><td></td><td>Imprimaciones específicas del gen para&nbsp; Amplificación por PCR</td></tr><tr><td>Oligonucleótido para la escisión mediada por la ARNasa</td><td>H IDT</td><td></td><td>Cebador antisentido para la tripsina del ARN diana</td></tr><tr><td>Tecnología</td><td>Gibco Life</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio de cultivo de tejidos</td><td>Tecnología Gibco Life</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Tecnología Gibco Life</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DTT Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td></td><td></td><td>Soporte de tubo de microcentrífuga de 1,7 ml</td></tr><tr><td>Campana</td><td></td><td></td> laminar <td>Para el cultivo de tejidos animales</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> de CO2 <td>Para el cultivo de tejidos animales</td></tr><tr><td>Aparato</td><td></td><td></td> de gel de proteínas <td>Separación de muestras de proteínas</td></tr><tr><td>Aparato</td><td></td><td></td> de transferencia de <td>proteínas Transferencia de muestras</td></tr><tr><td>de proteínas Listo para usar geles de proteínas (4-15%)</td><td></td><td></td><td>Separación de muestras de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> de mesa <td>Pellet abajo de la muestra</td></tr><tr><td>Rotador</td><td></td><td></td> de mesa <td>Mezcle la muestra de extremo a extremo</td></tr><tr><td>Vórtice</td><td></td><td></td><td>Mezcle las muestras</td></tr></tbody></table>

el aislamiento de los complejos de arn-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Las partículas de ribonucleoproteína dirigen la biogénesis y la regulación postranscripcional de todos los ARNm a través de distintas combinaciones de proteínas de unión al ARN. Están compuestos por elementos de ARN que actúan cis dependientes de la posición y combinaciones únicas de proteínas de unión al ARN. Definir la composición de un RNP específico es esencial para lograr una comprensión fundamental de la regulación génica. El aislamiento de una RNP selecta es similar a encontrar una aguja en un pajar. Aquí, demostramos un enfoque para aislar RNPs asociadas en la región no traducida 5' de un ARNm seleccionado en células asíncronas transfectadas. Se ha demostrado que este cognado RNP es necesario para la traducción de virus seleccionados y genes de respuesta al estrés celular.
El protocolo de coprecipitación de ARN-proteína demostrado es adecuado para el análisis posterior de componentes proteicos a través de análisis proteómicos, inmunoblots o ensayos de identificación bioquímica adecuados. Este protocolo experimental demuestra que la helicasa A de DHX9/ARN está enriquecida en el extremo 5' del ARN retroviral afín y proporciona información preliminar para la identificación de su asociación con los ARNm afines huR y junD asociados al estrés celular.

RIP resultados anteriores identificaron los ARN gag retroviral y se seleccionaron los ARN celulares que co-precipitado con DHX9 / RHA, incluido el VIH-1 6, 6 y Jund Hur (Fritz y Boris-Lawrie, sin publicar). El retroviral 5 'UTR se ha demostrado que co-precipitado con DHX9 / RHA en el núcleo y para co-aislar en el citoplasma en polirribosomas. Se define de manera única como el cis-actuando elemento de control post-transcripcional (PCE) 6. Para ais...

Este manuscrito describe un enfoque para aislar RNPs afines seleccionados formados en células eucariotas a través de un enriquecimiento específico dirigido a oligonucleótidos. Demostramos la aplicabilidad de este enfoque mediante el aislamiento de un RNP afín unido a la región no traducida retroviral 5' que está compuesta por DHX9/ARN helicasa A.

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

El objetivo general de esta técnica de inmunoprecipitación de ARN es aislar y caracterizar selectivamente los complejos de proteínas de ARN endógenos formados en células eucariotas a través de un enriquecimiento dirigido a oligonucleótidos específicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del control postranscripcional, como la composición de las proteínas de unión al ARN que definen las cinco UTR principales de una transcripción retroviral para regular su expresión génica. La principal ventaja de esta técnica es que permite al investigador aislar y caracterizar selectivamente un complejo proteico de ARN específico de interés, manteniendo al mismo tiempo la posibilidad de realizar un análisis más global de la RNP aguas abajo.Bueno, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión fundamental de las infecciones virales y numerosas enfermedades celulares. Y proporciona información significativa sobre los mecanismos de control postranscripcional de la expresión génica. Eso podría significar nuevos objetivos farmacológicos viables.Después de cultivar células y llevar a cabo la inmunoprecipitación de una proteína marcada con FLAG de acuerdo

isolation-cognate-rna-protein-complexes-from-cells-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y...

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

Este método de pull-down del RNA permite identificar los objetivos de RNA de un ARN largo no codificante (lncRNA). Basado en la hibridación de caseros, diseñadas anti-sentido oligonucleótidos sondas de ADN específicas para este lncRNA en un tejido adecuadamente fijo o línea celular, permite la captura de todos los objetivos de la lncRNA RNA eficientemente.

Procedimiento de ARN Pull-down para identificar dianas de ARN de un ARN largo no codificante

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.

Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Aprenda a aislar complejos de ARN-proteína en células eucariotas mediante elución dirigida por oligonucleótidos. Este método permite caracterizar interacciones específicas de ARN y proteínas como DHX9/RHA en transcritos retrovirales.

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

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