El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

El objetivo general de esta técnica de inmunoprecipitación de ARN es aislar y caracterizar selectivamente los complejos de proteínas de ARN endógenos formados en células eucariotas a través de un enriquecimiento dirigido a oligonucleótidos específicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del control postranscripcional, como la composición de las proteínas de unión al ARN que definen las cinco UTR principales de una transcripción retroviral para regular su expresión génica. La principal ventaja de esta técnica es que permite al investigador aislar y caracterizar selectivamente un complejo proteico de ARN específico de interés, manteniendo al mismo tiempo la posibilidad de realizar un análisis más global de la RNP aguas abajo.

Bueno, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión fundamental de las infecciones virales y numerosas enfermedades celulares. Y proporciona información significativa sobre los mecanismos de control postranscripcional de la expresión génica. Eso podría significar nuevos objetivos farmacológicos viables.

Después de cultivar células y llevar a cabo la inmunoprecipitación de una proteína marcada con FLAG de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera 60 microlitros por IP de lodo de perlas magnéticas pro-TG a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Coloque el tubo en una rejilla magnética y retire la solución de almacenamiento pipeteando cuidadosamente. A continuación, retire el tubo de la rejilla.

Agregue 600 microlitros de 1x tampón de lavado. Y coloque el tubo en un rotador de extremo a extremo a temperatura ambiente durante tres minutos, para lavar y equilibrar las cuentas. Coloque el tubo en la rejilla magnética y retire el tampón de lavado.

A continuación, añade 10 volúmenes de tampón de lavado 1x fresco. Añada el anticuerpo inmunoprecipitante FLAG a las perlas magnéticas pro-TG equilibradas. Y luego gire el tubo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, para conjugar el anticuerpo inmunoprecipitante.

Coloque el tubo en el imán y retire el sobrenadante. A continuación, retire el tubo del imán y añada 1x tampón de lavado a las perlas y gírelo a temperatura ambiente durante tres minutos. Repita el paso de lavado dos veces y retire el tampón final.

Retire el medio de cultivo de las células por aspiración y use 1,5 mililitros de PBS helado para lavar las células dos veces. Con un raspador de células, desaloje las células húmedas y adheridas. Pipetear la suspensión celular en tubos nuevos y luego centrifugar el cultivo a 226 veces G en cuatro grados centígrados, durante cuatro minutos.

Agregue 375 microlitros de tampón bajo en sal helado al pellet de celda e incube la muestra en hielo durante cinco minutos para permitir la hinchazón. Es importante tener cuidado al agregar y volver a suspender el pellet de celda en el tampón de lisis baja en sal, para garantizar una inmersión e hinchazón completas sin interrupciones mecánicas prematuras. Para recolectar el lisado de células citoplasmáticas, agregue 125 microlitros de tampón de lisis helado y luego use un homogeneizador Dounce preenfriado para realizar diez golpes.

Homogeneizar Dounce con la fuerza suficiente para permitir la lisis de la membrana plasmática y los contaminantes del lisado citoplasmático liberado. Pero tenga cuidado de no extender demasiado la interrupción mecánica y correr el riesgo de contaminación nuclear, interrupción del complejo de proteínas de ARN o pérdida de Spine el homogeneizado en un microfugo a máxima velocidad durante un minuto. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,7 mililitros que haya estado en hielo.

Determine la concentración total de proteína. Reserve el 10% para el análisis de Western blot, que se utilizará como control de entrada. Para llevar a cabo la inmunoprecipitación, agregue el volumen deseado de lisado de células recolectadas a las perlas conjugadas de anticuerpos objetivo.

Usando 1x tampón de lavado, lleve el volumen total a 600 microlitros y gire la muestra a temperatura ambiente. Después de 90 minutos de incubación, coloque el tubo IP en el estante de imanes para recoger las perlas. A continuación, recoge el sobrenadante y resérvalo a medida que fluye.

A continuación, agregue 10 volúmenes de tampón de lavado NETN 150 helado a las perlas conjugadas de anticuerpos unidas a RNP y gire la muestra a temperatura ambiente durante tres minutos. Después de volver a suspender los complejos RNP inmovilizados en tampón de unión 1x de acuerdo con el protocolo de texto, ajuste el volumen restante en 100 microlitros de tampón de unión 1x helado. Y calentar el tubo a 70 grados centígrados durante tres minutos.

Para aislar complejos de proteínas de ARN afines, agregue un oligo de ADN de aproximadamente 30 nucleótidos, complementario a los tres límites de secuencia principal del ARN de interés. E incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave. Agregue de cinco a diez unidades de ARNasa H al tubo e incube la muestra a temperatura ambiente durante una hora para escindir el ARN del híbrido de ARN y ADN.

A continuación, transfiera el sobrenadante que contiene los complejos RNP capturados de interés a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mililitros. Para recolectar el ARN inmunoprecipitado, vuelva a suspender la mitad de la muestra total de complejos de ARN capturados en 750 microlitros de reactivo de tiocianato de guanidinio ácido. Añadir 200 microlitros de cloroformo al tubo, agitar enérgicamente durante 10 segundos e incubar a temperatura ambiente durante tres minutos.

Después de la centrifugación, recoja la fase acuosa en un tubo nuevo y agregue un volumen igual de isopropanol. Mezclar bien e incubar la muestra a temperatura ambiente durante al menos diez minutos. Agregue un microlitro de azul de glicol a la muestra y guárdela a menos 20 grados centígrados para una precipitación eficiente o un procesamiento en una fecha futura.

Centrifugar el tubo a 16.000 veces G en cuatro grados centígrados durante diez minutos. Utilice una micropipeta P200 para recoger y desechar cuidadosamente el sobrenadante para no alterar la bolita de ARN. Agregue 500 microlitros de etanol al 75% a cada tubo.

Vórtice y centrifuga los tubos durante cinco minutos. Recoja cuidadosamente y deseche el sobrenadante como se acaba de demostrar. Seque al aire el pellet durante dos o tres minutos y use 100 microlitros de agua libre de RNasa para volver a suspenderlo.

Aplique 100 microlitros de la muestra de ARN a una columna de limpieza de ARN. Y procesarlo de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Finalmente, eluya el ARN en 30 microlitros de agua libre de ARNasa y almacene a menos 80 grados Celsius durante un máximo de tres meses.

Para aislar elementos de control postranscripcional, o complejos de ribonucleoproteínas PCE, GAG, RNA, RHA formados en células en proliferación. La inmunoprecipitación de FLAG-MS2 RNP se llevó a cabo en lisados de células HECK293 transfectadas. Los resultados muestran una precipitación eficiente de la proteína FLAG-MS2.

Como DHX9/RHA se encuentra en el complejo RNP y no dentro del control de isótopos IgG, ni dentro del control negativo. Aquí se muestran las transferencias occidentales de los complejos de ARN y ADN digeridos por la ARNasa H. La RNasa H escindió el ARN de PCE GAG, liberando el complejo RNP unido específicamente a la UTR de cinco primos.

Las RNPs asociadas a DHX9/RHA se enriquecieron en los eluyentes. Es importante destacar que las RNP unidas a FLAG-MS2 permanecieron con las perlas conjugadas de anticuerpos. En este experimento, se validó la inmunoprecipitación de HO del bucle del tallo MS2, que contiene ARN PCE GAG retroviral en células y en eluyentes, mediante RT-PCR y QRT-PCR.

Los resultados confirmaron una asociación selecta entre DHX9/RHA y la UTR retroviral de cinco primos, que se ha destacado como un RNP único, importante para el control de la traducción dirigida. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cinco horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar todos los pasos de manera eficiente y con cuidado, para garantizar el mantenimiento de los complejos RNP intactos y el aislamiento del complejo RNP específico de interés.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectrometría de masas y la secuenciación de ARN, para responder a preguntas adicionales, como la asociación global de proteínas con el ARN diana. Y análisis regional o completo de todas las transcripciones involucradas dentro de un RNP en particular. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del control genético postranscripcional exploraran los distintos complejos de proteínas de ARN que gobiernan la expiración de genes virales patógenos y el mecanismo general del control de la expresión génica celular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cosechar complejos RNP celulares intactos y determinar su composición mediante el enriquecimiento selectivo dirigido por oligonucleótidos. No olvide también que trabajar con virus patógenos y muestras biológicas y productos químicos peligrosos como el ácido o el fenol puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar todas las precauciones, como el equipo de protección personal adecuado, mientras se realiza este procedimiento.