Clasificación de flujo y secuenciación exome de las células Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin clásico

El objetivo general de este procedimiento es separar y concentrar las células viables de Hodgkin, Reed-Sternberg o HRS de los tumores inflamatorios linfocíticos de Linfoma de Hodgkin clásico o CHL para la generación y el análisis de datos de secuenciación de próxima generación de exoma completo de alta calidad. Este método puede responder a preguntas clave en la biología de CHR, incluida la identificación de mutaciones impulsoras clave, mutaciones de escape inmunológico y también observar la diversidad génica dentro de la clasificación. Esta técnica produce ADN derivado del tumor que es de muy alta calidad y pureza.

Facilitando la generación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación sin la necesidad de un paso de preamplificación. Esta técnica puede tener implicaciones importantes para el diagnóstico del linfoma de Hodgkin, ya que puede ayudar con una subclasificación y pronóstico. También puede influir en la elección del tratamiento, ya que algunas alteraciones pueden indicar susceptividad o resistencia a fármacos específicos.

Jonathan From tuvo esta idea cuando descubrió cómo visualizar células HRS por citometría de flujo y realizó los primeros experimentos de clasificación con estas células. Antes de preparar las células, mezcle los anticuerpos pretitulados en un vial de vidrio oscuro. Luego, agregue PBS y BSA para llevar el cóctel de anticuerpos a un volumen de 100 microlitros.

Y transfiera el vial de nitrógeno líquido a una cubeta de hielo o hielo seco. A continuación, descongele rápidamente las células de interés en un baño de agua a 37 grados centígrados. Cuando solo quede una pequeña porción congelada, vierta las células en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 45 mililitros de medio de descongelación a 37 grados centígrados y enjuague el vial criogénico dos veces con un mililitro de medio de descongelación fresco.

Después de agrupar ambos enjuagues, deje que las células se digieran a temperatura ambiente durante 15 minutos. Cuando las células se hayan reequilibrado, recójalas por centrifugación. Aspire todos menos los últimos 200 microlitros del sobrenadante.

Vuelva a suspender las células en el medio de descongelación restante y deje que las células descansen durante otros dos o tres minutos. A continuación, incubar las células en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Al final de la incubación, lavar las células en tres mililitros de medio de clasificación, volviendo a suspender el pellet en un mililitro de medio de clasificación fresco.

Luego, filtre las células a través de un filtro superior de tubo de flujo de cinco mililitros. Enjuague el tubo y el colador con un mililitro adicional de medio clasificador y mantenga las células en hielo. Antes de comenzar la clasificación de celdas, en el software del citómetro de flujo, en el menú del experimento, seleccione nuevo experimento y abra la ventana de estado del instrumento.

En la pestaña parámetros, elimine los parámetros no utilizados. A continuación, vuelva a abrir la pestaña del experimento y seleccione la configuración de compensación para crear los controles de compensación. En la ventana del navegador, haga clic en el signo más para expandir la muestra de control de compensación y ejecute los tubos de control de compensación sin registrar los datos.

Ajuste los voltajes del detector según sea necesario para que las poblaciones de cuentas teñidas positivamente para cada cromo de flora estén entre el canal 10, 000 y 100, 000. Y de los más brillantes en su canal de detección principal. Registre los voltajes necesarios para cada parámetro para cada tubo.

Luego, debajo de la muestra de control de compensación, haga un clic izquierdo para resaltar el tubo de control sin manchar y cargar el tubo de control sin manchar en la etapa de muestra. En la ventana de control de adquisición, haga clic en cargar y ejecute los controles de compensación individuales en los campos de voltaje del detector para que todos los parámetros ingresen manualmente los voltajes determinados. Haga clic en registrar para obtener los datos de control sin teñir.

A continuación, ejecute todos los controles de compensación restantes, registrando los datos sin cambiar ninguna de las configuraciones del detector. Cuando se hayan analizado todos los controles, deje correr un tubo de agua desionizada estéril durante cinco minutos para limpiar el instrumento de cualquier material residual antes de continuar. Para compuerta las celdas para la clasificación HRS, cargue el tubo experimental y registre al menos 100.000 eventos mientras ajusta el caudal para adquirir de 3.000 a 4.000 eventos por segundo.

Asegúrese de registrar suficientes eventos para visualizar una población que puede ser tan pequeña como una de cada 1.000 células. Para identificar los controles somáticos de células B y T, se deben controlar las células CD20 y CD5 positivas, respectivamente. Cuando se hayan colocado todas las compuertas, clasifique las celdas en tubos cónicos preenfriados de 15 mililitros que contengan de siete a ocho mililitros de medio de recolección.

Al final de la clasificación, transfiera las poblaciones celulares aisladas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Y pellet las células por centrifugación. Luego, lave las células en un mililitro de PBS fresco y retire los sobrenadantes de cada tubo, teniendo cuidado de no alterar los pequeños gránulos.

Después de la amplificación de la biblioteca y la limpieza de perlas en el punto 8X, se debe observar una distribución de luz normal de tamaños de fragmentos en el rango deseado. Las bibliotecas que exhiben desviaciones de esta forma indican la presencia de un artefacto de alto o bajo peso molecular, e idealmente no deben secuenciarse. Por ejemplo, el dímero del adaptador a veces puede pasar por la primera limpieza del cordón X puntiagudo, apareciendo como un pico agudo centrado alrededor de 125 a 130 pares de bases.

En este caso, se debe realizar una limpieza adicional de la cuenta en X puntiaguda, seguida de una visualización repetida de la distribución del tamaño para garantizar la eliminación exitosa del dímero. Después de la secuenciación multiplexada de cuatro muestras por carril, se puede lograr una profundidad media de cobertura de 50 a 100 X en todo el objetivo. Aunque los gráficos de número de copias generados a partir de una biblioteca de un nanogramo pueden dar lugar a ganancias y pérdidas espurias del número de copias.

Aproximadamente el 70% de los casos de linfoma de Hodgkin clásico son portadores de mutaciones B2M y 820, o deleciones que parecen ser clonales, y que se pueden usar para calcular el contenido tumoral relativo. Si se utilizan linfocitos T como controles somáticos, la secuenciación HRS demostrará aumentos significativos en el número de copias en las posiciones correspondientes a las posiciones alfa, delta y beta del receptor de linfocitos T. Así como pérdidas significativas en las posiciones de los receptores de células B pesadas y cadenas ligeras kappa con una carga mutacional total de 100 a 400 mutaciones somáticas por caso de exoma.

Una vez dominada, esta técnica, incluida la clasificación de células y la construcción de la biblioteca de secuenciación, puede completarse en tres o cuatro días si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, podemos realizar estudios prospectivos más amplios y otros métodos, como la epigenética, la proteómica y la metabalomómica para obtener más conocimientos sobre el linfoma de Hodgkin y avanzar hacia terapias personalizadas más específicas. Después de su desarrollo, el método nos permitió estudiar células HRS con alta pureza en cantidades relativamente grandes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células HRS e iniciar su análisis genómico.