Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

El objetivo general de este experimento es realizar un genotipado rápido y preciso del pez globo tóxico mediante el análisis de pequeños amplicones de PCR. La parte comestible del pez globo que se utiliza para preparar el plato de pez globo varía según su especie y algunas de las especies contienen toxinas en todo el cuerpo. Este músculo la base de datos y el masu y la aleta y la piel de nacimiento del pez globo pueden ayudar en el genotipado del pez globo desde el punto de vista de la seguridad total de los alimentos para todos y para la investigación.

Para realizar la extracción de ADN con un kit, primero coloque de 30 a 50 miligramos de tejido de pescado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 o 1,5 mililitros. Aplaste el tejido sin aleta ni piel, usando una microespátula. Añadir 180 microlitros del tampón de lisis de tejidos animales y 40 microlitros de proteinasa k y vórtice brevemente.

Incube a 56 grados centígrados en un calentador de bloque durante dos horas o toda la noche. Centrifugar la muestra durante cinco minutos a 13000xg. Después de transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, agregue 200 microlitros del tampón caotrópico que contiene clorhidrato de guanidina del kit.

A continuación, añadir 200 microlitros de etanol al 99,5% y mezclar por vórtice. Transfiera la mezcla, incluido cualquier precipitado, a la columna de centrifugación colocada en un tubo de recolección de dos mililitros. Después de centrifugar durante un minuto a 13000xg, deseche el flujo.

Agregue 500 microlitros de tampón de lavado uno, que contiene clorhidrato de guanidina del kit, y centrifugue como antes. Deseche el flujo y el tubo de recolección. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros provisto con el kit.

Añadir 500 microlitros de tampón de lavado dos y centrifugar durante tres minutos a 20.000xg. Después de desechar el flujo y el tubo de recolección, transfiera la columna de centrifugación a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Pipetear 200 microlitros del tampón de elución en el centro de la membrana de la columna de centrifugación.

Después de un minuto, centrifugar durante un minuto a 6000xg. A continuación, pipetee 50 microlitros de aluette en una cubeta ultravioleta desechable. Mida el espectro ultravioleta del aluette a 220 a 300 nanómetros y la absorbancia a 260 nanómetros utilizando un espectrofotómetro.

El uso de reactivos sin detergente es fundamental para el éxito de la cromatografía líquida porque los reactivos pueden dañar la columna analítica. Trabajando en un banco limpio para evitar la contaminación, configure una PCR de 25 microlitros para cada muestra de ADN extraída, un control positivo y un control negativo, en hielo como se describe en el protocolo de texto. Para facilitar la operación, prepare una cantidad suficiente de cóctel que contenga todos los reactivos sin ADN molde y dispense.

Utilice la ADN polimerasa que tenga actividad de corrección para evitar la adición de tres salientes de adenina principal al producto de PCR. Llevar a cabo la amplificación de PCR en un termociclador utilizando el programa de ciclo que se muestra en el protocolo de texto. Para realizar la digestión enzimática, agregue dos microlitros del tampón de digestión enzimática a la solución de PCR.

Agregue un microlitro de cada enzima de restricción y mezcle suavemente. Incubar la muestra durante 30 minutos a 37 grados Celsius en el termociclador, seguido de cinco minutos a 72 grados Celsius. Filtre la solución de reacción con un dispositivo de filtro centrífugo de 0,2 a 0,5 micras para evitar obstrucciones y dañar la columna analítica.

Transfiera el filtrado a un vial de polipropileno cónico y almacene a 20 grados centígrados hasta el análisis. Prepare una solución de hexafluoroisopropanol y trietilamina en un frasco de un litro como se describe en el protocolo de texto. Conecte el frasco a la línea A del instrumento de cromatografía líquida, enfriando el frasco con un refrigerador portátil de enfriamiento directo para evitar la vaporización.

Conecte otra botella llena de metanol a la línea B.Conecte la columna de protección y la columna analítica al instrumento. Comience a fluir la fase móvil inicial para equilibrar las columnas. Si está utilizando un espectrómetro de masas sin software para controlar la presión de la trampa C, debe reducir la presión de la trampa C controlando manualmente la barra.

Para hacer esto, tire de la perilla para desbloquear y gire la perilla en sentido contrario a las agujas del reloj muy lentamente para reducir la alta presión de vacío a 1/3. La presión indicada debe cambiar gradualmente de forma diferida. Ignore el mensaje de advertencia sobre baja presión.

Empuje la perilla para bloquear. Después de configurar la calibración, como se describe en el protocolo de texto, acerque la sonda de ionización por electrospray calentada a la interfaz del espectrómetro de masas en la posición B.Conéctela a la sonda y a una jeringa con un tubo. Infundir el calibrante constantemente a un caudal de 10 microlitros por minuto utilizando la bomba de jeringa integrada.

Verifique solo los seis iones de masa más baja en la tabla de calibración personalizada. Proceda con la calibración después de que se estabilice la intensidad de las señales. Después de la calibración, verifique solo los seis iones de masa más alta y proceda con la calibración.

Evite calibrar usando todos los iones a la vez para evitar fallas. Mueva la sonda a la posición D para un caudal de 0,4 mililitros por minuto y conéctela al instrumento con un tubo de metal inerte. Después de configurar los parámetros como se describe en el protocolo de texto, purgue las burbujas tocando la parte inferior de los viales.

Coloque los viales de muestra en el estante de muestras e inyecte un microlitro de una muestra utilizando el muestreador automático para iniciar el análisis. Abra los archivos de datos sin procesar con un software de navegador y confirme que todas las adquisiciones se hayan finalizado correctamente, incluidos los controles positivos y negativos. Configure un método como se describe en el protocolo de texto y, a continuación, haga clic en el botón ejecutar en la pestaña ejecutar cue para iniciar el software de deconvolución.

Una vez completada la señal, seleccione una fila y haga clic en abrir resultado en la leyenda superior para obtener los resultados de la deconvolución. Aquí hay un cromatograma típico de corriente iónica total obtenido de un control negativo y una muestra de pez globo. Cada pico representa un dúplex de ADN que se separa en función de su longitud.

En este ejemplo, se observan tres picos de la muestra de pez globo. Estos picos son el resultado de la digestión de los amplicones utilizando dos endonucleasas. No se observan picos en la muestra de control negativo.

Cada pico representa un espectro de masas que comprende iones cargados múltiplemente. La ampliación del espectro de masas permite que se noten docenas de picos resueltos isotópicamente. Esta resolución es un requisito para determinar la masa monoisotópica y solo es factible a través de un espectrómetro de masas de alta resolución.

En este ejemplo, las masas monoisotópicas del tercer pico son 16296,7656 y 16468,6616 Daltons. Considerando una tolerancia de masa de tres ppm, los valores medidos son idénticos a los valores teóricos de takifugu rubripes como se muestra aquí. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día utilizando instrumentos y aparatos comunes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar amplicones pequeños mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas de alta resolución para el genotipado. La técnica se puede aplicar en el análisis de otros polimorfismos de ADN siempre que la variación de la secuencia se refleje en los pequeños amplicones a analizar. Sin embargo, esta técnica solo identifica composiciones base, no se puede distinguir la sustitución de bases dentro de la misma mercancía.