Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es detectar receptores de factor de crecimiento de baja abundancia en embriones de pez cebra mediante la combinación de la selectividad y la sensibilidad del marcaje de afinidad del receptor elegido por su ligando radiactivo. Este método puede ayudar a responder preguntas en los campos de la biología del desarrollo, como los niveles de expresión de los receptores y sus propiedades bioquímicas. Este método, que hemos denominado AFLIP, extiende una poderosa calidad descriptiva de marcaje de afinidad, una técnica de biología celular bien establecida a los estudios de desarrollo del pez cebra.

Para comenzar este procedimiento, recoja de 100 a 200 embriones para cada condición y colóquelos en placas de Petri que contengan agua de pescado. A continuación, descorionar manualmente los embriones con pinzas de punta fina y evitar el uso de pronasa o cualquier otra proteasa durante todo el protocolo, ya que puede digerir los receptores objetivo. A continuación, coloque los embriones en un tubo de microfuga de 1,5 mililitros y lávelos dos veces con 1X PBS.

A continuación, añade 500 microlitros de tampón desyogur. Libera la mayor parte de la yema pipeteando suavemente los embriones en la solución hacia arriba y hacia abajo unas 30 a 40 veces. Para 72 embriones HPF y 48 HPF, utilice puntas de pipeta azules y amarillas respectivamente.

Es posible que sea necesario cortar ligeramente las puntas amarillas para evitar destruir los embriones. Una liberación exitosa de la yema se puede verificar observando los embriones bajo el microscopio. La eliminación de la yema debe ser lo más completa posible, ya que los lípidos y las proteínas de la yema pueden interferir con los pasos posteriores de unión al ligando o al anticuerpo.

Después de eso, recoja los embriones por centrifugación a 600 x g durante 15 segundos. Deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta. A continuación, lave los embriones dos veces con 500 microlitros de tampón de lavado mediante un vórtice suave a la velocidad más baja.

A continuación, recoja los embriones por centrifugación a 600 x g durante 15 segundos. A partir de aquí, continúe el procedimiento a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante con cuidado con una pipeta.

Posteriormente, suspendemos los embriones en 350 microlitros de tampón de lisis y los homogeneizamos con un mortero de plástico. A continuación, incubar los embriones lisados durante 30 minutos con agitación en un balancín de probeta a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar los embriones lisados a 11.000 x g durante 15 minutos para eliminar los restos insolubles.

Después de eso, transfiera el sobrenadante aclarado a un tubo nuevo. Determine la proteína total mediante el ensayo de proteínas de Bradford y la curva de calibración de plotty. En este paso, coloque de 400 a 500 microgramos de proteína embrionaria total en un tubo de microfuga de 1,5 mililitros y dilúyalo a un microgramo por microlitro con tampón 1.

A continuación, agregue yodo-125 etiquetado como caldo TGF-beta II para alcanzar una concentración final de 150 picomolar e incube agitando en un balancín de tubo de ensayo durante dos horas a cuatro grados centígrados. Después de eso, agregue un anticuerpo sin diluir contra el receptor de interés para alcanzar una dilución de 1:100. Luego continúe la incubación a cuatro grados centígrados durante otras dos horas o toda la noche.

Después de la incubación, agregue 50 microlitros de perlas de unión a inmunoglobulinas adecuadas e incube durante 50 minutos con agitación en un balancín de tubo de ensayo a cuatro grados centígrados. A continuación, recupere las perlas por microcentrifugación a 11.000 x g durante 20 segundos y deseche el sobrenadante en un contenedor de basura radiactivo adecuado. A continuación, lavar las perlas IP tres veces con un mililitro de tampón de lavado IP mediante vórtice a la microcentrifugación a 11.000 x g durante 20 segundos cada vez.

A continuación, vuelva a suspender las perlas IP en 250 microlitros de tampón de lavado IP. Prepare una solución DSS fresca y agregue 1,5 microlitros a la muestra. A continuación, incubar la muestra durante 15 minutos a cuatro grados centígrados con agitación.

Para apagar la reacción de reticulación, agregue 500 microlitros de tampón de lavado IP suplementado con suficiente caldo de cloruro de prueba a pH 7.4 para alcanzar 25 milimolares de cloruro de prueba. A continuación, centrifugar a 11,00 x g durante 20 segundos para recoger las perlas IP. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas IP en 30 microlitros de tampón reductor de laemmli.

A continuación, hierva la muestra a 94 grados centígrados durante cinco minutos antes de la electroforesis en gel SDS-PAGE y luego analice los geles secos en un fosforímetro o mediante autorradiografía convencional. En esta figura se muestran los resultados representativos obtenidos con AFLIP. La proteína total extraída de los embriones a 72 hpf y 48 hpf se sometió a un marcaje de afinidad con yodo-125 TGF-beta II seguido de IP con BG anti-pez cebra de conejo o BG de conejo anti-rata como control.

En la autorradiografía, la glucemia puede detectarse sin GAG o como una glucemia modificada con glicosaminoglicanos. Esta figura muestra cómo se puede utilizar AFLIP para medir los niveles de expresión de un receptor determinado en embriones sometidos a una manipulación experimental, en este caso, la disminución de betaglicano a la inyección de morfolino. El carril uno muestra el nivel del receptor beta III de TGF en un embrión de tipo salvaje de 72 hpf, mientras que el carril dos muestra el efecto de administrar siete nanogramos de un morfolino dirigido al límite del exón 2-intrón 2 de la transcripción primaria de ZFPG. Obsérvese que la regulación a la baja de la glucosa en la sangre obtenida con este morfolino no se reproduce mediante su control no coincidente.

Estos resultados confirmaron que el fenotipo obtenido con este morfolino era específico para la destrucción del receptor beta III del TGF como se describió anteriormente. El éxito de AFLIP para detectar un factor de crecimiento o receptores de citocinas depende de la disponibilidad de un ligando radiomarcado que pueda unirse y reticularse a su receptor. También se requiere un buen anticuerpo para la inmunoprecipitación.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente. Dado que AFLIP evita el paso de transferencia de la Western blot, permite una mejor detección de receptores fuertemente glicosilados. Y hemos visto aquí para el proteoglicano betaglicano, que se transfiere de manera muy ineficiente en Western blot. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la digestión enzimática, para describir modificaciones postraduccionales adicionales, siempre que se revelen mediante técnicas electroforéticas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo AFLIP puede ayudarlo a detectar receptores de baja abundancia en varios embriones de peces mediante el marcaje de afinidad relacionado con la inmunoprecipitación. Por último, no olvide que el trabajo con yodo-125 debe realizarse con cuidado y protección adecuada. Buena suerte con tus experimentos.