Name: Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende la técnica AFLIP para detectar receptores de factores de crecimiento de baja abundancia en embriones de pez cebra mediante etiquetado de afinidad e inmunoprecipitación. Este método avanza la biología del desarrollo.

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Los autores agradecen a Gilberto Morales por el cuidado y mantenimiento de los peces, y a los Dres. Claudia Rivera y Héctor Málagón (IFC-UNAM Animal Facility) por su ayuda en la inmunización de conejos. Este trabajo contó con el apoyo de becas de CONACYT 131226 y PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Todos los experimentos llevados a cabo en animales fueron aprobados por el Comité para el Laboratorio de Cuidado y Uso de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Animal, bajo el número CICUAL-Protocolo: FLC40-14. (CICUAL: &quot;Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México&quot;). 1. Preparación de extracto de proteína de embriones <ol><li> Recoger 100 - 200 embriones para cada condición de comparar (morphants vs tipo salvaje) en la etapa deseada, por ejemplo, 72 h después de la fecundación (HPF). </li><li> Coloque los embriones en placas de Petri que contienen los peces de agua (ver Tabla 1) y dechorionate manualmente embriones utilizando unas pinzas de punta fina. Evitar el uso de pronasa durante este paso (o cualquier otra proteasa durante todo el protocolo), ya que puede digerir el receptor diana. </li><li> Coloque los embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se lavan los embriones twhielo con solución tampón de fosfato 1x (PBS) (véase la Tabla 1). </li><li> Añadir 500 l de tampón deyolk (ver Tabla 1). </li><li> Liberar la mayor parte de la yema pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (aproximadamente 30 - 40 veces) los embriones en la solución. Para el 72 y 48 HPF embriones HPF utilizar azul y amarillo, puntas de pipeta, respectivamente. puntas amarillas puede ser necesario cortar un poco para evitar la destrucción de embriones. La liberación de yema de éxito se puede verificar mediante la observación de los embriones bajo el microscopio. </li><li> Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg. </li><li> Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta. </li><li> Lavado de embriones dos veces con 500 l de tampón de lavado (ver Tabla 1) por agitación suave a la velocidad más baja. </li><li> Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg. </li><li> A partir de aquí, continuar con el procedimiento a 4 ° C. </li><li> Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta. </li><li> embriones resuspender en 350 l de tampón de lisis (véase la Tabla 1) y homogeneizar usando una mano de mortero de plástico. </li><li> Incubar los embriones lisadas 30 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° C. </li><li> Centrifugar lisaron embriones a 11.000 xg durante 15 min con el fin de eliminar los residuos insolubles. </li><li> Transferencia aclaró sobrenadante usando una pipeta a un tubo nuevo. </li><li> Determinación de proteínas totales mediante el ensayo de proteínas de Bradford 4, u otro procedimiento adecuado. Si se utiliza el ensayo de Bradford, lleve a cabo la curva de calibración en presencia de concentraciones equivalentes de los detergentes presentes en el tampón de lisis, ya que provocan una subestimación de la proteína estándar 4. </li></ol> 2. Detección de proteína endógena Receptor <ol><li> Etiquetado de afinidad e inmunoprecipitación (todos estos pasos a 4 ° C) <ol><li> Coloque 400-500 g de proteína total de embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y diluir a 1 g / l con tampón 1 (ver Tabla 1). Nota: Con el fin de obtener 500 g de proteína total del embrión, a unos 100 - 200 embriones deben ser procesados ​​inicialmente. 72 HPF embriones producen rutinariamente ~ 5 g de proteína embrión total, que es suficiente para la detección betaglicano. </li><li> Añadir suficiente volumen de TGF-β2 etiqueta de valores para alcanzar una concentración final de 150 pM y se incuba con agitación en un tubo de ensayo basculante 2 horas a 4 ° C. TGF-β2 debe ser etiquetado antes de iniciar AFLIP, con 125 I por el método de la cloramina T como se describe por Cheifetz et al. 5. PRECAUCIÓN: El uso de blindaje para minimizar la exposición durante la manipulación marcado con 125I ligando. </li><li> Añadir suficiente volumen de anticuerpo sin diluir contra el receptor de interés con el fin de llegar a una dilución de 1: 100 y continuar la incubación durante otras 2 horas a 4 ° C (incubación puede ser O / N). Esta es la dilución óptima de antisuero # 31, que se utiliza en este estudio y descrito en otra parte 3, pero dependiendo de la calidad de la unatibody, una dilución mayor o menor puede ser la óptima. </li><li> Añadir 50 l de perlas de unión a inmunoglobulina adecuado (por ejemplo, la proteína G-Sepharose, que se equilibró previamente en RTFP y se resuspendió 1: 5 de su volumen original en RTFP) e incubar durante 50 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° DO. </li><li> Recuperar las cuentas por microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 seg. </li><li> Desechar el sobrenadante en un recipiente de basura radiactiva adecuada. </li><li> Se lavan las IP-cuentas tres veces con 1 ml de tampón de lavado IP (ver Tabla 1), por agitación e microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 segundos cada vez. </li><li> Resuspender IP-perlas en 250 l de tampón de lavado IP. </li><li> Añadir 1,5 l de suberato de disuccinimidilo (DSS, se disolvió en DMSO a 10 mg / ml). Preparar la solución de DSS justo antes de su uso en esta etapa. </li><li> Incubar durante 15 min a 4 ° C con agitación. </li><li> Con el fin de detener la reacción de reticulación, añadir 500 l Otampón de lavado f IP, suplementado con suficiente Tris-Cl pH 7,4 de stock para llegar a 25 mM Tris-Cl. Los grupos amino libres en Tris capturan DSS no reaccionado. </li><li> Se centrifuga a 11.000 xg durante 20 segundos para recoger IP-cuentas y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender IP-perlas en 30 l de tampón reductor Laemmli. </li><li> Hervir las muestras de 5 min a 94 ° C. </li><li> Opcionalmente, el análisis de muestras en un contador gamma utilizando el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Análisis de las muestras <ol><li> Las muestras sometidas a desnaturalización SDS-PAGE. Utilice poliacrilamida en el porcentaje adecuado para la masa del receptor y ejecutar gel bajo procedimiento estándar. </li><li> Sumergir gel en solución de fijación (véase la Tabla 1) durante 30 min a TA. </li><li> Lavar gel con agua destilada durante 15 min. </li><li> Coloque gel en papel de filtro previamente hidratado y cubrir con papel film película. </li><li> gel seco a 80 ° C durante 1 hr. </li><li> Exponer en gel en una scre PhosphorImager blancoa temperatura ambiente en O / N. </li><li> Analiza pantalla expuesta mediante un PhosphorImager usando el protocolo del fabricante. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de transferencias de Western con un anticuerpo específico contra una proteína de interés es una herramienta valiosa para estudiar su expresión durante la embriogénesis 7. Sin embargo, la inmunotransferencia de proteínas altamente glicosiladas no ha sido muy exitoso debido a su transferencia ineficiente y débil unión a nitrocelulosa o PVDF membranas 8,9. Los proteoglicanos son un buen ejemplo de este inconveniente, debido a sus cadenas de glicosaminoglicanos unido...

La detección específica de proteínas expresadas durante el desarrollo embrionario es necesaria para validar los perfiles de expresión obtenidos mediante la medición de sus ARNm afines con RT-PCR o hibridación in situ (ISH). Esto se logra comúnmente mediante una transferencia de Western de extractos de embriones seguida de la detección con anticuerpos específicos. Sin embargo, este enfoque es difícil de aplicar a proteínas que se encuentran en muy baja abundancia, o que tienen propiedades que dificultan su transferencia cuantitativa durante su transferencia. El betaglicano, también conocido como receptor del factor de crecimiento transformante tipo III β (TGF-β) (TGFBR3), es un ejemplo de estas dificultades. TGFBR3 es un proteoglicano de membrana a tiempo parcial que se une a TGF-β a través de su proteína central1, con una afinidad notablemente mayor por la isoforma TGF-β2, una propiedad que lo distingue de cualquier otra proteína de unión a TGF-β2. El TGFBR3 en el pez cebra se expresa a partir de 8 hpf, alcanzando un máximo de 72 hpf, según lo detectado por RT-PCR de su ARNm3. 
Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de un anticuerpo muy específico3, todos los intentos de detectar su producto traducido por Western blot resultaron infructuosos. Teniendo en cuenta que la naturaleza proteoglicana de TGFBR3, así como la supuesta baja abundancia, pueden ser responsables de este fracaso, se ideó un método de detección, AFLIP, que aprovecha la alta afinidad de TGFBR3 por TGF-β2. En este método, se permite que un extracto de proteína de embriones agrupados se una específicamente a 125TGF-β2 marcado con I y los complejos receptor-ligando se purifican por inmunoprecipitación y se entrecruzan antes de la separación por SDS-PAGE. Los patrones de migración observados por autorradiografía de los geles revelaron la presencia y la naturaleza de las especies receptoras marcadas. Este enfoque combina la especificidad del ligando del marcaje de afinidad con la inmunoprecipitación por anticuerpos específicos, aumentando el rango de detección y evitando la transferencia ineficiente de TGFBR3. Debido a sus propiedades inherentes, el ensayo AFLIP no es un ensayo cuantitativo, pero se puede utilizar para medir con confianza las diferencias experimentales relativas en el receptor analizado.

<table><tbody><tr><td>Suberato de disuccinimidilo (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G Sepharose 4 Fast</td><td>Flow GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Secador de gel Modelo 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Auto Contador</td> gamma <td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exposure Cassette</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla Marina del Mar Cristalino Empresas</td><td>Marinas http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detección de afinidad etiquetado endógeno receptores de embriones de pez cebra

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Mediante la combinación de las potencias de Affinity Labeling y Immunoprecipitation (AFLIP), se ha implementado una técnica para la detección de receptores de baja abundancia en embriones de pez cebra. Esta técnica aprovecha la selectividad y sensibilidad conferida por el marcaje de afinidad de un determinado receptor por su ligando con la especificidad de la inmunoprecipitación. Hemos utilizado AFLIP para detectar el receptor de TGF-β tipo III (TGFBR3), también conocido como betaglicano, durante el desarrollo temprano del pez cebra. AFLIP fue fundamental para validar la eficacia de un fenotipo de pez cebra morphant TGFBR3. En el primer paso, se preparan extractos de proteínas embrionarias y se utilizan para generar complejos 125I-TGF-β2-TGFBR3 que se purifican por inmunoprecipitación. Posteriormente, estos complejos se entrecruzan covalentemente y se revelan mediante la separación SDS-PAGE y la detección autorradiográfica. Esta técnica requiere la disponibilidad de un ligando marcado para el receptor que se va a detectar y de un anticuerpo específico contra él, y se adaptará fácilmente para identificar cualquier factor de crecimiento o receptor de citocinas que cumpla estos requisitos.

La Figura 1 muestra un resultado representativo obtenido con AFLIP. Las señales en el carril 1 provienen de la I-ligando 125 covalentemente ya sea a la proteína de pez cebra betaglicano núcleo (BG núcleo, por debajo del marcador de 150 kDa) o el núcleo de BG que ha sido procesada a su forma de proteoglicanos mediante la unión de los glicosaminoglicanos (GAG, frotis que van desde 170 kDa a la parte superior del gel). Este patrón de migración, una proteína núcle...

Se describe una técnica novedosa para la detección de receptores endógenos de baja abundancia presentes en embriones de pez cebra. Lo hemos denominado AFLIP porque consiste en el marcaje de afinidad del receptor por su ligando ligado a la inmunoprecipitación.

Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar receptores de factores de crecimiento de baja abundancia en embriones de pez cebra mediante la combinación de la selectividad y sensibilidad del marcado por afinidad del receptor elegido mediante su ligando radiactivo. Este método puede ayudar a responder preguntas en campos de la biología del desarrollo, como los niveles de expresión de receptores y sus propiedades bioquímicas. Este método, al que hemos apodado AFLIP, amplía las cualidades descriptivas potentes del marcado por afinidad, una técnica bien establecida de biología celular, hacia estudios del desarrollo en pez cebra.Para comenzar este procedimiento, recolecte de 100 a 200 embriones para cada condición y colóquelos en placas de Petri que contengan agua para peces. Luego, descorioneer manualmente los embriones utilizando pinzas de punta fina y evite usar pronasa o cualquier otra proteasa durante todo el protocolo, ya que podrían digerir los receptores objetivo. A continuación, coloque los embriones en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y lávelos dos veces con PBS 1X.Luego, agregue 500 microlitros de tampón desyolkante. Libere la mayor parte del vitelo pipeteando suavemente los embriones en la solución de arriba abajo aproximadamente de 30 a 40 veces. Para embriones de 72 hpf y 48 hpf, utilice puntas de pipeta azules y amarillas, respectivamente.Puede ser necesario cortar ligeramente las puntas amarillas para evitar dañar los embriones. Se puede verificar una liberación exitosa de la yema observando los embriones bajo el microscopio. La eliminación de la yema debe ser lo más completa posible, ya que los lípidos y proteínas de la yema pueden interferir con los pasos posteriores de unión de ligandos o anticuerpos.A continuación, recolecte los embriones mediante centrifugación a 600 x g durante 15 segundos. Descarte cuidadosamente el sobrenadante utilizando una pipeta. Luego, lave los embriones dos veces con 500 microlitros de tampón de lavado, agitándolos suavemente en vórtex a la velocidad más baja.Luego, recoger los embriones mediante centrifugación a 600 x g durante 15 segundos. A partir de este momento, continuar el procedimiento a cuatro grados Celsius. Desechar cuidadosamente el sobrenadante utilizando una pipeta.Posteriormente, suspendemos los embriones en 350 microlitros de tampón de lisis y los homogenizamos utilizando un pistilo de plástico. Luego, incubar los embriones lisados durante 30 minutos con agitación en un agitador de tubos de ensayo a cuatro grados Celsius. A continuación, centrifugar los embriones lisados a 11.000 × g durante 15 minutos para eliminar los restos insolubles.A continuación, transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo nuevo. Determine la proteína total mediante el ensayo de proteína de Bradford y trace la curva de calibración. En este paso, coloque de 400 a 500 microgramos de proteína total de embrión en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y dilúyala hasta una concentración de un microgramo por microlitro con el tampón 1.A continuación, agregue el reactivo patrón de TGF-beta II marcado con yodo-125 para alcanzar una concentración final de 150 picomolares e incube con agitación en un agitador de tubos de ensayo durante dos horas a cuatro grados Celsius. Después de eso, agregue el anticuerpo no diluido contra el receptor de interés para alcanzar una dilución 1:100. Luego, continúe la incubación a cuatro grados Celsius durante otras dos horas o durante la noche.Después de la incubación, agregue 50 microlitros de perlas de unión a inmunoglobulinas adecuadas e incube durante 50 minutos con agitación en un agitador de tubos de ensayo a cuatro grados Celsius. Luego, recupere las perlas mediante microcentrifugación a 11,000 x g durante 20 segundos y deseche el sobrenadante en un recipiente apropiado para desechos radiactivos. Posteriormente, lave las perlas de inmunoprecipitación tres veces con un mililitro de tampón de lavado para inmunoprecipitación, agitando por vórtex y microcentrifugando a 11,000 x g durante 20 segundos cada vez.Luego, resuspenda las perlas de IP en 250 microlitros de tampón de lavado de IP. Prepare una solución fresca de DSS y añada 1,5 microlitros de esta a la muestra. A continuación, incube la muestra durante 15 minutos a cuatro grados Celsius con agitación.Para detener la reacción de reticulación, agregue 500 microlitros de tampón de lavado de IP suplementado con suficiente stock de cloruro de tryst a pH 7,4 para alcanzar una concentración de 25 milimolar de cloruro de tryst. A continuación, centrifugue a 11,00 ×g durante 20 segundos para recoger las perlas de IP. Posteriormente, deseche el sobrenadante y resuspenda las perlas de IP en 30 microlitros de tampón reductor de Laemmli.A continuación, hierva la muestra a 94 grados Celsius durante cinco minutos antes de la electroforesis en gel de SDS-PAGE y luego analice los geles secos en un fosforímetro o mediante autoradiografía convencional. Esta figura muestra los resultados representativos obtenidos con AFLIP. Se sometió a marcado por afinidad con yodo-125 TGF-beta II, seguido de IP con anticuerpo de conejo anti-pez cebra BG o con anticuerpo de conejo anti-rata BG como control, a proteína total extraída de embriones a las 72 hpf y 48 hpf.En la auto-radiografía, se puede detectar BG sin GAG o como BG modificada con glicosaminoglucanos. Esta figura muestra cómo AFLIP puede utilizarse para medir los niveles de expresión de un receptor determinado en embriones sometidos a una manipulación experimental, en este caso, la reducción de betaglicano mediante la inyección de morfolino. La vía uno muestra el nivel del receptor de TGF beta III en un embrión silvestre de 72 hpf, mientras que la vía dos muestra el efecto de administrar siete nanogramos de un morfolino dirigido al límite del exón 2-intrón 2 del transcrito primario ZFPG. Obsérvese que la disminución de BG obtenida con este morfolino no se reproduce con su control desemparejado.Estos resultados confirmaron que el fenotipo obtenido con este morfolino fue específico para la inhibición del receptor de TGF beta III, tal como se describió anteriormente. El éxito de AFLIP para detectar receptores de factores de crecimiento o citoquinas depende de la disponibilidad de un ligando radiomarcado que pueda unirse y entrecruzarse con su receptor. También se requiere un buen anticuerpo para inmunoprecipitación.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. Dado que AFLIP evita el paso de transferencia del western blot, permite una detección mejorada de receptores altamente glicosilados. Y aquí hemos observado, en el caso del proteoglicano betaglucano, que se transfiere de manera muy ineficiente en el western blot. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la digestión enzimática, con el fin de describir modificaciones postraduccionales adicionales, siempre que sean reveladas mediante técnicas electroforéticas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo AFLIP puede ayudarle a detectar receptores poco abundantes en varios embriones de peces mediante marcado por afinidad ligado a inmunoprecipitación. Por último, no olvide que el trabajo con yodo-125 debe realizarse con precaución y protección adecuada. Buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Este protocolo esboza una manera de etiquetar y rastrear el destino de los pequeños grupos de células de embriones de pez cebra empleando la radiación UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido de monte se inmunomarcaje para amplificar la señal de la fluoresceína uncaged.

Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Este video muestra un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra. Consiste en montar embriones de pez cebra decorionados incrustados en agarosa, inyectar una solución de colorante dirigida a los ligandos DeltaD en los RGP y obtener imágenes bajo un microscopio de fluorescencia para la división celular asimétrica que confirme la activación de la señalización Notch/DeltaD.

Un ensayo de captación de anticuerpos para la obtención de imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

Este trabajo desarrolla un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización de Notch / DeltaD intra-linaje en la división de progenitores de glía radial del cerebro embrionario del pez cebra.

Ensayo de captación de anticuerpos para el seguimiento de la endocitosis notch/delta durante la división asimétrica de los progenitores radiales de la glía del pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Aprende la técnica AFLIP para detectar receptores de factores de crecimiento de baja abundancia en embriones de pez cebra mediante etiquetado de afinidad e inmunoprecipitación. Este método avanza la biología del desarrollo.

Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

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